貢繼堯，宋梓萌，陳 媛，曾美迪，李世寶,2△

1.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州 221000

子宮內(nèi)膜癌(EC)是目前全球女性中最常見的惡性腫瘤之一[1]，在中國(guó)僅次于宮頸癌，居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第二位，而在發(fā)達(dá)國(guó)家居于首位[2]，好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性。近年來，EC在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率持續(xù)上升，平均發(fā)病年齡也越來越小[3]，但其具體病因尚不清楚。2019年國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)稱在我國(guó)EC的發(fā)病率為10.28/10萬，死亡率為1.9/10萬[4]。2020年，全球共有417 367例新診斷病例，由EC導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)97 370人[5]。目前臨床較為常見的診斷標(biāo)志物是人卵巢癌抗原(CA125)[6]，但其診斷EC的靈敏度和特異度不佳[7]，使血清腫瘤標(biāo)志物在臨床上受到極大的限制。而診斷性刮宮術(shù)作為其早期診斷的金標(biāo)準(zhǔn)具有侵襲性，因此，亟須發(fā)現(xiàn)一種靈敏度高且易獲得的EC診斷標(biāo)志物來提高EC的診斷效率。

miR-181a是一種微小RNA(miRNA)，廣泛分布于人類細(xì)胞中，發(fā)揮著調(diào)控細(xì)胞發(fā)育和分化的作用[8]。相關(guān)研究證實(shí)，miR-181a在EC患者的腫瘤組織中表達(dá)水平上升[9]，提示miR-181a具備作為EC標(biāo)志物的潛能。但組織標(biāo)本獲取的侵入性限制了其臨床應(yīng)用，而血清標(biāo)本獲取相對(duì)簡(jiǎn)單，并且miRNA在血清中也較為穩(wěn)定[10]，可以為診斷提供了一種無創(chuàng)的、經(jīng)濟(jì)的方法。因此，本研究擬通過檢測(cè)EC患者血清miR-181a水平，探討miR-181a在EC診斷中的價(jià)值及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年8月至2022年3月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院確診的EC患者血清標(biāo)本47份(EC組)，女性體檢健康者血清標(biāo)本25份(對(duì)照組)。EC組患者年齡45～74歲，平均(58.0±7.6)歲；對(duì)照組年齡47～68歲，平均(57.4±6,2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)診斷性刮宮檢查證實(shí)為EC；納入本研究前未經(jīng)任何手術(shù)、放療、化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他腫瘤患者；心、肺、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病患者；嚴(yán)重精神類疾病患者。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及健康者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2主要試劑和儀器 miR-181a及U6引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)自中國(guó)北京天根生化有限公司。TRNzol Universal總RNA提取試劑購(gòu)自Life technologies公司,PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自Bio-Rad公司，ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自Applied Biosystems公司。

1.3總RNA的提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR) 將存放于-80 ℃的血清標(biāo)本在室溫下融解，取200 μL血清置于無核酶Ep管中，按照Trnzol Universal總RNA提取試劑說明書提取血清總RNA。使用分光光度計(jì)檢測(cè)提取RNA的純度和濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以260 nm和280 nm處的吸光度比值(A260/A280)在1.8～2.0為最佳。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)體系(總體系20 μL)將提取的RNA在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min，之后保持10 ℃。得到的cDNA標(biāo)本保存在-20 ℃冰箱中備用。以1 μL cDNA為模板，按照PCR試劑盒配制反應(yīng)體系20 μL，PCR條件：95 ℃孵育15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法，以U6作為內(nèi)參，每個(gè)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清mir-181a的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism8.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料呈非正態(tài)分布，兩組間比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)、率表示，組間比較采χ2檢驗(yàn)。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，分析血清miR-181a對(duì)EC的臨床診斷價(jià)值，并計(jì)算曲線下面積(AUC)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1EC組和對(duì)照組血清miR-181a水平比較 qPCR法檢測(cè)miR-181a水平，試驗(yàn)過程中血清標(biāo)本未被污染，且未出現(xiàn)引物二聚體或非特異性擴(kuò)增，結(jié)果較可靠。EC組血清miR-181a水平明顯高于對(duì)照(P<0.05)，見圖1。

圖1 對(duì)照組與EC組血清mir-181a水平比較

2.2miR-181a對(duì)EC的診斷價(jià)值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-181a診斷EC的AUC為0.889 8(95%CI：0.816 5～0.963 1，P<0.05)，靈敏度為91.49%，特異度為72.00%，見圖2。

圖2 血清miR-181a診斷EC的ROC曲線

2.3EC患者血清miR-181水平與臨床病理特征的關(guān)系 以血清miR-181a的中位數(shù)(8.386)為界，miR-181≥8.36的EC患者為高表達(dá)組(24例)，miR-181a<8.386的EC患者為低表達(dá)組(23例)。高表達(dá)組肌層浸潤(rùn)深度≥2 cm的患者比例高于低表達(dá)組(P<0.05)，而兩組年齡、分化程度、免疫組化及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、炎性改變、癌累及其他部位比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 EC血清miR-181a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

miRNA是近年來用于腫瘤診斷的新型標(biāo)志物。miRNA與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和代謝密切相關(guān)，對(duì)機(jī)體生理狀態(tài)的維持和細(xì)胞發(fā)育起重要作用[11]?，F(xiàn)有不少研究證明，miRNA是影響EC發(fā)生、發(fā)展的重要因素[12]。BOREN等[13]研究了與EC發(fā)生相關(guān)的miRNA及其靶信使RNA，發(fā)現(xiàn)在正常子宮內(nèi)膜演變?yōu)樽訉m內(nèi)膜非典型增生過程中，有13種miRNA存在不同程度的差異性表達(dá)，提示miRNA在EC中可能發(fā)揮了促癌基因和抑癌基因的功能。此外，miRNA在疾病中特異性表達(dá)，且在血清中穩(wěn)定存在，不易被血液中的核糖核酸酶降解[14]。這些結(jié)果提示，血清miRNA作為腫瘤標(biāo)志物在EC的發(fā)生、發(fā)展，早期診斷，以及預(yù)后預(yù)測(cè)方面具有十分重要的意義。

miR-181a位于人9號(hào)染色體上，不少研究發(fā)現(xiàn)miR-181a的差異化表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[15]，在許多惡性腫瘤中均表達(dá)失調(diào)。華佳葉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在急性髓細(xì)胞性白血病中高表達(dá)，其通過促進(jìn)HL-60細(xì)胞株的增殖來發(fā)揮促癌作用。YANG等[17]推測(cè)miR-181a在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮了癌基因調(diào)控作用。此外，有研究表明，胃癌患者血清中miR-181a表達(dá)量明顯上調(diào)，可以作為腫瘤標(biāo)志物進(jìn)一步研究[18]。國(guó)內(nèi)外均有關(guān)于miR-181a對(duì)EC影響的報(bào)道，但重點(diǎn)均放在了研究miR-181a對(duì)EC組織細(xì)胞的作用上。有研究人員發(fā)現(xiàn)，miR-181a在EC患者的新鮮冰凍組織標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為miR-181a可能通過抑制其靶基因PR的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)EC的發(fā)生、發(fā)展[19]。但是目前關(guān)于miR-181a在EC血清中的表達(dá)及臨床意義的研究較少。

本研究運(yùn)用qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在EC組血清中miR-181a水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，表明miR-181a可能在EC的發(fā)生機(jī)制中起促癌基因作用。

本課題組認(rèn)為，在EC發(fā)病和進(jìn)展過程中，因EC組織中腫瘤細(xì)胞逃逸或死亡，釋放基因組DNA入血，導(dǎo)致外周血中miR-181a水平升高，miR-181a的這種特異性變化可作為EC診療的無創(chuàng)性分子標(biāo)記物，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，將有助于EC檢出和治療效果的監(jiān)控，但其具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-181a在EC患者血清中水平升高，其可能參與了EC的發(fā)生、發(fā)展，提示miR-181a是一個(gè)潛在的診斷EC的標(biāo)志物。