牛 曼,王樹洪,熊彬媛,姜興宇,李玉林,劉婷婷,喻安永
遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診科,貴州 遵義 563003
創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)不僅嚴重危害患者健康,而且給家庭和整個社會造成巨大負擔,從全世界范圍來看,每年有超過5 000萬人發(fā)生TBI,而中國TBI患者的總?cè)藬?shù)遠超其他大多數(shù)國家[1]。盡管多年的基礎(chǔ)研究已經(jīng)開發(fā)出一些有前景的神經(jīng)保護療法,但均未能轉(zhuǎn)化到臨床,而且目前尚無有效的藥物[2]。線粒體自噬(mitophagy)是細胞通過選擇性自噬清除功能異常或多余線粒體的過程,它可以維持線粒體質(zhì)量及功能的穩(wěn)定,從而在TBI中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3]。在哺乳動物中,已經(jīng)鑒定出了不同的線粒體自噬效應因子,如類NIP3蛋白X(NIP3-like protein X,Nix)、Bcl-2/腺病毒E1B19-KDa-相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interacting protein3,BNIP3)、攜帶FUN14結(jié)構(gòu)域蛋白1(FUN14 domaincontaining protein 1,UNDC1)、Bcl-2類蛋白13(BCL2-like 13,BCL2L13)、心磷脂(cardiolipin,CL)和PTEN誘導激酶1(PTEN-induced kinase 1,PINK1)等[4]。Chao等[5]首次證明在人類和大鼠的受傷大腦中,CL外化介導的受損線粒體的靶向自噬參與了TBI早期受損細胞器的清除。因此對CL外化的進一步研究,可能是改善TBI治療結(jié)果的潛在策略。
CL是線粒體特異性磷脂,具有獨特的二聚體結(jié)構(gòu),含有4個酰鏈和2個與甘油相連的磷脂?;鵞6]。CL在線粒體內(nèi)膜(inner mitochondrial membrane,IMM)的基質(zhì)側(cè)合成[7],幾乎只存在于線粒體膜內(nèi),占所有磷脂的20%。CL的功能體現(xiàn)在多個方面:線粒體膜的構(gòu)造、蛋白質(zhì)的引進、生物能量、線粒體動力學和線粒體自噬[8]。所以CL代謝的缺陷會導致線粒體結(jié)構(gòu)的改變,包括嵴的喪失、氧化磷酸化降低、線粒體DNA不穩(wěn)定、線粒體形態(tài)和動力學改變及線粒體自噬能力的降低[9-11]。TBI增加了大腦能量需求,導致線粒體呼吸鏈激活,進一步使活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成增加,這一系列事件通過氧化CL來觸發(fā)神經(jīng)元凋亡。神經(jīng)細胞避免凋亡的一個途徑是通過線粒體自噬消除受損的線粒體,研究結(jié)果表明,TBI后由CL引導的線粒體自噬是一種內(nèi)源性的神經(jīng)保護過程,標志著受損的線粒體被消除,從而限制神經(jīng)元死亡和行為缺陷[5]。
2.1CL過氧化促進細胞凋亡 TBI后大腦能量需求增加,線粒體呼吸被激活,從而導致ROS生成增加,此時CL被氧化,導致細胞凋亡,使神經(jīng)細胞功能喪失,進一步加重顱腦損傷[5]。這個氧化過程是CL與細胞色素c(Cytochrome C,Cytc)相互作用實現(xiàn)的。Cytc是一個定位于線粒體膜間隙的水溶性蛋白質(zhì),是在呼吸鏈中電子傳遞必需的一類色素蛋白,其參與呼吸作用。另一方面,膜結(jié)合的Cytc已被確定為細胞凋亡的活化劑[12]。CL與Cytc相互作用形成過氧化物酶復合物,催化CL過氧化,過氧化的CL在OMM上的聚集導致Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的募集和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的形成,MPTP將包括Cytc在內(nèi)的線粒體促凋亡蛋白釋放到細胞質(zhì)中,在細胞質(zhì)中,Cytc促進凋亡體組裝,從而觸發(fā)細胞凋亡[13-14],進一步導致神經(jīng)細胞的功能喪失,從而加重顱腦損傷。CL是唯一在凋亡過程中發(fā)生過氧化的線粒體磷脂,它與Bcl-2家族蛋白相互作用,使線粒體外膜通透性增加,導致Cytc的釋放[15]。研究證實,對乙酰氨基酚可以減少CL的過氧化,最大限度地減少細胞凋亡[16-17],且對乙酰氨基酚可以誘導CL重塑[18]。研究發(fā)現(xiàn)核糖體生物發(fā)生因子Peter Pan(PPAN)的缺失會導致自噬途徑和細胞凋亡的失衡[19]。向線粒體輸送小分子抑制劑、電子清除劑,既可以防止大量心磷脂氧化產(chǎn)物的積累,也可以防止顱腦損傷[20]。截短型Bid基因(T-Bid)可能與Cytc競爭CL,導致Cytc從膜上釋放,從而停止CL的氧化[21]。含有C22∶6的CL是TBI后引起的氧化損傷的一個特異的、早期的和顯著的靶點,提示CL氧化產(chǎn)物可能是腦內(nèi)細胞早期凋亡的生物標志物信號,也是急性治療的關(guān)鍵靶點[22]。Kagan等[6]表示氧化反應可能通過導致線粒體損傷和氧化脂質(zhì)的積累來間接促進線粒體自噬。通過對CL過氧化導致細胞凋亡的機制的研究,可能找到治療TBI的有效治療靶點。
2.2CL外化到線粒體表面作為消除信號引起線粒體自噬 Erlich等[23]首先證明自噬在TBI中起保護作用。Chao等[5]首次證明在受傷的人類和大鼠的大腦中,線粒體自噬參與了TBI早期受損細胞器的清除,CL外化到線粒體表面,作為受損線粒體清除的標志物,誘導線粒體自噬清除受損線粒體,從而抑制細胞凋亡,這一系列過程減輕了神經(jīng)元細胞的死亡和相關(guān)的行為缺陷。
2.2.1CL與核苷二磷酸激酶D(NDPK-D)結(jié)合外化:NDPK-D或NME4(非轉(zhuǎn)移性表達的異構(gòu)體4),也被稱為NM23-H4,是形成定位于線粒體膜間間隙的大的同源六聚體復合物[24],其結(jié)合CL并促進其重新分布到線粒體膜外膜[25-26]。NDPK-D通過在膜間隙形成六聚體,在物理上連接IMM和線粒體外膜(outermitochondrial membrane,OMM),所以NDPK-D可能在物理上促進CL從IMM外化到OMM[6]。視神經(jīng)萎縮1(optic atrophy l,OPA1)是IMM融合和嵴形成所必需的GTPase蛋白,OPA1與某種蛋白相互作用參與將NDPK-D的激酶功能轉(zhuǎn)換為CL-轉(zhuǎn)位酶活性[25],促進CL從IMM到OMM的轉(zhuǎn)位。由于NDPK-D具有產(chǎn)生核苷三磷酸鹽和促進CL轉(zhuǎn)移的雙重功能,并且與OPA1緊密結(jié)合,通過OPA1為其提供GTP,因此NDPK-D是一個決定線粒體自噬反應的十分關(guān)鍵的整合位點[27]。此外,CL還與其他線粒體自噬相關(guān)的蛋白相互作用。例如,自噬相關(guān)蛋白Beclin 1直接與OMM上的CL結(jié)合,以誘導或抑制線粒體自噬[28]。心磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶1(Acyl-CoA:lysocardiolipin acyltransferase-1,ALCAT1)可以在多種衰老相關(guān)疾病中催化CL的病理重塑[29],去除ALCAT1顯著增強了線粒體自噬的吞噬作用[30]。Tafazzin蛋白(TAZ)是一種CL重塑轉(zhuǎn)?;?,在不影響自噬小體生物發(fā)生的情況下調(diào)節(jié)線粒體功能和線粒體自噬的功能[31]。研究發(fā)現(xiàn),卡路里限制(calorie restriction,CR)促進廣泛的線粒體膜重塑,降低氧化損傷的脂質(zhì),增加心磷脂水平和重新分配心磷脂[32]。綜上所述,對CL外化相關(guān)蛋白的研究,可能發(fā)現(xiàn)新的藥物靶點,從而調(diào)節(jié)線粒體自噬,進一步減輕腦損傷。
2.2.2CL與線粒體肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase,mtCK)相互作用外化:mtCK與含有心磷脂的膜具有高親和力。mtCK在線粒體中含量非常豐富,占線粒體蛋白質(zhì)的1%,它是一種多任務蛋白,定位于線粒體膜間間隙,是跨越線粒體膜的八聚體,與CL特異性結(jié)合[33]。當CL異常時,mtCK不能作為轉(zhuǎn)運體發(fā)揮作用,這表明CL對于mtCK的穩(wěn)定有重要作用[21,34]。mtCK可能通過膜脫水導致線粒體膜界面水的丟失,從而促進脂質(zhì)轉(zhuǎn)移[21]。mtCK通過磷酸肌酸穿梭機制參與線粒體和胞漿之間的能量轉(zhuǎn)移,并且在維持線粒體膜結(jié)構(gòu)方面具有額外的作用[33],它還調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔,其氧化會破壞能量平衡,膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開,從而導致細胞凋亡[35]。mtCK 和NDPK-D非常相似[21],這兩種激酶都具有兩種功能,即通過強的心磷脂相互作用與內(nèi)膜ANT和線粒體呼吸的功能偶聯(lián),以及膜間脂質(zhì)轉(zhuǎn)移,它二者可能有相同的CL從IMM到OMM的轉(zhuǎn)位方式。CL通過NDPK-D和mtCK從線粒體內(nèi)膜外化到線粒體外膜,然后與微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1light chain 3,MAPlLC3/LC3)相互作用介導線粒體自噬過程。
2.2.3CL外化與LC3結(jié)合:CL外化到線粒體表面可以促進線粒體自噬。Chu等[36]發(fā)現(xiàn),在初級皮質(zhì)神經(jīng)元和SH-SY5Y細胞中,魚藤酮、星孢素、6-羥基多巴胺可以導致心磷脂外化到線粒體表面。CL從從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)運到線粒體表面,至少需要3次移位:(1)從IMM的內(nèi)小葉到OMM的外小葉;(2)從IMM的外小葉到OMM的內(nèi)小葉;(3)從OMM的內(nèi)小葉到OMM的外小葉[37]。這一過程涉及磷脂擾亂酶3(phospholipid scramblase-3,PLS-3),負責CL從IMM到OMM的移位并伴隨自身的磷酸化,PLS3缺乏通過抑制CL外化減弱TBI誘導的線粒體自噬[5]。
因線粒體損傷而外化的CL與自噬蛋白LC3相互作用,介導初級神經(jīng)元和轉(zhuǎn)化的神經(jīng)細胞中線粒體的靶向自噬[36]。LC3是自噬標志物,自噬信號誘導后,胞漿型LC3(即LC3-I)與磷脂酰乙醇胺共價脂化形成膜相關(guān)的LC3-II,自噬的“貨物”受體將“貨物”帶入正在形成的吞噬體,并通過LC3相互作用區(qū)(LIR)域與LC3結(jié)合,最終形成自噬體[38]。最新研究表明,TBI誘導的線粒體自噬,通過CL外化作為消除受損線粒體的標志物是有益的,因為它減輕了神經(jīng)元死亡和相關(guān)的行為缺陷[5]。CL的重新分布是線粒體自噬的信號,它通常定位于線粒體膜內(nèi),當存在線粒體損傷、去極化和其他損傷信號時,很大一部分CL移位到線粒體膜外表面,在OMM表面形成了一個重要的平臺,在那里CL與存在于吞噬體上的酵母中自噬相關(guān)基因8(Atg8)的同源物-LC3的特定位點(幾個堿性氨基酸簇)結(jié)合,促進炎性小體的激活,并刺激線粒體通過線粒體自噬來清除受損或無功能的線粒體[36,39-40]。LC3將同時介導線粒體識別和自噬小體的形成,最終導致受損線粒體的移除[41]。線粒體自噬對于神經(jīng)元細胞來說是一把“雙刃劍”,LC3結(jié)合位點有一個重要特征,它可以被cAMP依賴的蛋白激酶PRKACA/PKA (protein kinase,cAMP-dependent,catalytic,α)磷酸化,該位點靠近一對精氨酸,用于線粒體自噬。Chu等[40]預測通過在這個區(qū)域增加負電荷,將有助于減弱LC3與CL的結(jié)合作用,從而提高觸發(fā)線粒體自噬的閾值。值得注意的是,LC3介導的CL識別不依賴于氧化,非氧化性CL的外化足以觸發(fā)線粒體自噬。CL過氧化,導致持續(xù)的傷害或過量的ROS產(chǎn)生,可能有助于將CL相關(guān)的線粒體信號從線粒體自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎绦蛐运劳鯷40]。CL過氧化導致細胞凋亡,而細胞避免凋亡的途徑包括CL外化引導的線粒體自噬,或許通過對線粒體不同生理狀態(tài)下的研究,可以發(fā)現(xiàn)TBI有效的治療靶點。
盡管近年來實驗性研究已經(jīng)開發(fā)出了一些可能有效的神經(jīng)保護療法,但是在臨床的實際應用仍無進展,科研工作者和臨床醫(yī)師都在積極探尋有效的治療方法。本篇總結(jié)了和CL外化引起線粒體自噬有關(guān)的幾種相關(guān)蛋白,針對這種脂質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用的研究,可能為未來的研究提供一種新方向。CL既參與線粒體自噬又在神經(jīng)細胞凋亡中發(fā)揮重要作用,所以對CL的進一步研究可能為TBI提供有效治療靶點。關(guān)于線粒體脂質(zhì)的研究已經(jīng)取得了許多進展,但CL外化的具體機制仍需進一步探究,并且對正常CL代謝的途徑還知之甚少。因此,通過對CL的進一步研究,可能會在TBI治療方面發(fā)掘無限潛能。
作者貢獻聲明:牛曼:選題設(shè)計,文章撰寫;喻安永:提供研究經(jīng)費與指導性支持;王樹洪、熊彬媛、姜興宇、李玉林、劉婷婷:整理文獻以及采集整理數(shù)據(jù)