胡錦煒，朱懷軍，勞茜瑩，2，李丹瀅#（.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，南京 20008；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，南京 20008）

環(huán)孢素A是從致病真菌多孔木霉中分離得到的具有抗真菌活性的化合物[1]，具有免疫抑制作用[2]。1983年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)環(huán)孢素A用于預(yù)防和治療器官移植后的排斥反應(yīng)。目前，環(huán)孢素A主要應(yīng)用于腎移植、肝移植、心臟移植等，提高了器官移植患者的生存率[3]。除器官移植外，環(huán)孢素A也廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、干燥綜合征以及免疫性血小板減少癥等自身免疫疾病的治療[4-8]。然而，環(huán)孢素A在有著強(qiáng)大免疫抑制作用的同時(shí)，也存在一些毒性反應(yīng)，包括肝腎毒性、心血管毒性以及神經(jīng)毒性等，嚴(yán)重時(shí)甚至危及患者生命[9]。由于環(huán)孢素A治療窗狹窄，臨床使用時(shí)通常需進(jìn)行治療藥物濃度監(jiān)測(cè)，根據(jù)患者服用環(huán)孢素A前和用藥后2 h的血藥濃度調(diào)整給藥劑量，以提高用藥的安全性與有效性[10]。但由于環(huán)孢素A存在明顯的個(gè)體間代謝差異，臨床實(shí)踐及相關(guān)文獻(xiàn)均提示，部分血藥濃度在治療窗內(nèi)的患者仍然療效不佳甚至還出現(xiàn)了毒性反應(yīng)[11]。該現(xiàn)象提示，目前臨床常規(guī)使用的血藥濃度監(jiān)測(cè)方法并不能完全反映環(huán)孢素A的臨床預(yù)后，探索更有效的臨床個(gè)體化用藥指標(biāo)意義重大。

環(huán)孢素A通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入淋巴細(xì)胞，抑制淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CN）活性，使淋巴細(xì)胞功能發(fā)生改變，從而對(duì)機(jī)體發(fā)揮免疫抑制作用[12]。在此基礎(chǔ)上，本文結(jié)合臨床研究現(xiàn)狀，圍繞外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）內(nèi)環(huán)孢素A濃度、CN活性和T細(xì)胞功能以及環(huán)孢素A代謝物濃度4個(gè)方面，綜述其與環(huán)孢素A臨床預(yù)后的相關(guān)性，以期尋找潛在的個(gè)體化用藥指標(biāo)，彌補(bǔ)環(huán)孢素A臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)的不足，為環(huán)孢素A個(gè)體化治療提供臨床應(yīng)用依據(jù)。

1 PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度與環(huán)孢素A臨床療效的相關(guān)性

環(huán)孢素A進(jìn)入血液循環(huán)后，部分與T細(xì)胞結(jié)合發(fā)揮治療作用。國(guó)內(nèi)外已有多個(gè)研究提出，測(cè)定淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)孢素A濃度能更好地反映臨床療效[13-17]。由于T細(xì)胞內(nèi)環(huán)孢素A濃度較低，對(duì)測(cè)定方法的特異性與可靠性有較高的要求，相比之下，測(cè)定PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度的可行性更高[13]。在器官移植領(lǐng)域也已有專(zhuān)家共識(shí)表示，測(cè)定PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度可以作為補(bǔ)充全血治療藥物監(jiān)測(cè)不足的工具，優(yōu)化器官移植患者的個(gè)體化治療[14]。Falck等[15]將20名腎移植患者的環(huán)孢素A血藥谷、峰濃度和T細(xì)胞內(nèi)濃度作為研究對(duì)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在20名發(fā)生和未發(fā)生排斥反應(yīng)的患者中，其環(huán)孢素A給藥劑量差異和血藥峰濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而T細(xì)胞內(nèi)環(huán)孢素A濃度在患者發(fā)生排斥反應(yīng)的1周前開(kāi)始出現(xiàn)逐漸下降，特別是在發(fā)生排斥反應(yīng)的3 d前，T細(xì)胞內(nèi)環(huán)孢素A濃度出現(xiàn)明顯下降。Crettol等[16]對(duì)41名腎移植患者、20名肝移植患者以及3名肺移植患者的全血環(huán)孢素A谷濃度和PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度同時(shí)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種監(jiān)測(cè)結(jié)果的相關(guān)性較弱。該研究進(jìn)一步根據(jù)患者的ABCB1基因型進(jìn)行分組，研究ABCB1單核苷酸多態(tài)性對(duì)環(huán)孢素A血藥濃度以及PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度的影響。ABCB1是編碼P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的基因，P-gp可以將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出，降低藥物濃度，從而影響藥物療效[17]。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同ABCB1基因多態(tài)性會(huì)影響P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而導(dǎo)致PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度發(fā)生改變；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于攜帶不同ABCB11199G＞A基因型的患者，環(huán)孢素A血藥濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這也進(jìn)一步解釋了環(huán)孢素A個(gè)體差異較大的原因[16]。Barbari等[18]將35名腎移植患者分為3組，分別為發(fā)生過(guò)急性排斥反應(yīng)組（n＝7）、發(fā)生過(guò)腎毒性反應(yīng)組（n＝5）和移植器官功能正常組（n＝23），分別測(cè)定其環(huán)孢素A血藥谷、峰濃度以及PBMCs內(nèi)谷、峰濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3組患者的環(huán)孢素A血藥谷、峰濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而移植器官功能正常組患者的PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A谷、峰濃度明顯高于發(fā)生過(guò)急性排斥反應(yīng)組和發(fā)生過(guò)腎毒性反應(yīng)組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[18]。這個(gè)研究再一次說(shuō)明，相較于監(jiān)測(cè)環(huán)孢素A全血藥物濃度，監(jiān)測(cè)器官移植患者PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度更能有效地反映臨床預(yù)后情況。此外，2020年已有專(zhuān)家共識(shí)總結(jié)了較為系統(tǒng)的PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度的測(cè)定方法及步驟，進(jìn)一步提高了這種監(jiān)測(cè)方法應(yīng)用于臨床的可行性[14]。

2 PBMCs內(nèi)CN活性與環(huán)孢素A臨床療效的相關(guān)性

CN是一種可以調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）核移位和活化的蛋白。環(huán)孢素A與T細(xì)胞內(nèi)親環(huán)素結(jié)合所形成的復(fù)合物可以與CN結(jié)合并抑制CN活性，從而發(fā)揮免疫抑制作用[12]。目前關(guān)于PBMCs內(nèi)CN活性的研究多集中于器官移植領(lǐng)域，探索其與環(huán)孢素A藥動(dòng)學(xué)以及排斥反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)性。一項(xiàng)關(guān)于異基因干細(xì)胞移植的研究對(duì)31名患者進(jìn)行了CN活性的測(cè)定，其中有18名患者發(fā)生Ⅱ級(jí)甚至更嚴(yán)重的移植物抗宿主反應(yīng)（graft versus-host reaction，GVHR），且發(fā)生GVHR患者的PBMCs內(nèi)CN活性顯著高于未發(fā)生GVHR患者[19]。在移植后2個(gè)月的跟蹤隨訪中發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生GVHR的18名患者中，8名患者在移植后21 d內(nèi)發(fā)生GVHR，其中有6名患者出現(xiàn)CN活性超過(guò)28.5 pmol/（min·mg pro）的現(xiàn)象；10名患者在移植21 d后發(fā)生GVHR，其在排斥反應(yīng)發(fā)生之前均出現(xiàn)CN活性超過(guò)28.5 pmol/（min·mg pro）的現(xiàn)象。這表明CN活性的增強(qiáng)與GVHR的發(fā)生密切相關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)，在GVHR發(fā)生前后，患者的環(huán)孢素A血藥谷濃度并無(wú)明顯變化，環(huán)孢素A血藥谷濃度與CN活性之間也沒(méi)有相關(guān)性，該結(jié)論與另一項(xiàng)關(guān)于腎移植的研究相似[20]。Fukudo等[21]研究發(fā)現(xiàn)，接受環(huán)孢素A治療的肝移植患者的CN活性隨著環(huán)孢素A血藥濃度達(dá)峰值后迅速下降，其中未發(fā)生排斥反應(yīng)的患者的CN活性低于發(fā)生排斥反應(yīng)的患者；在環(huán)孢素A達(dá)峰濃度或谷濃度時(shí)，未發(fā)生排斥反應(yīng)的患者的CN活性一直維持在20 pmol/（min·mg pro）以下。該研究對(duì)比了另一種CN抑制劑他克莫司血藥濃度與CN活性及藥效學(xué)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與環(huán)孢素A的相同之處在于，出現(xiàn)排斥反應(yīng)的患者的他克莫司血藥谷濃度較低，CN活性較高；與環(huán)孢素A的不同之處在于，出現(xiàn)腎毒性反應(yīng)的患者的他克莫司血藥谷濃度較高、CN活性較低，而在使用環(huán)孢素A的患者中，發(fā)生或未發(fā)生腎毒性反應(yīng)的患者的CN活性差異無(wú)明顯變化。Pai等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，服用環(huán)孢素A的患者PBMCs內(nèi)CN活性比未服用環(huán)孢素A的健康志愿者低。但與其他研究不同之處在于，這些服用環(huán)孢素A的患者中，發(fā)生GVHR的患者PBMCs內(nèi)的平均CN活性為0.5 pmol/min，明顯低于未發(fā)生排斥反應(yīng)的患者（平均CN活性為1.0 pmol/min）。這些較低水平的CN活性可能繼發(fā)于較高水平的環(huán)孢素A，即為了治療GVHR而服用較高劑量環(huán)孢素A的結(jié)果。該項(xiàng)研究也顯示，雖然環(huán)孢素A發(fā)揮藥理作用可以持續(xù)抑制CN活性，但抑制CN活性并不能控制GVHR的發(fā)生，可見(jiàn)GVHR的作用機(jī)制可能不止CN活性改變這一條通路。

3 T細(xì)胞功能變化與環(huán)孢素A臨床療效的相關(guān)性

有研究表明，環(huán)孢素A可抑制CN活性，阻止NFAT去磷酸化，最終導(dǎo)致T細(xì)胞功能減弱，表現(xiàn)為細(xì)胞因子表達(dá)水平降低、T細(xì)胞的增殖與活化受到抑制[23]。由此可見(jiàn)，監(jiān)測(cè)T細(xì)胞功能變化有助于了解環(huán)孢素A生物學(xué)效應(yīng)信息。目前的研究主要通過(guò)測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原、細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）、IL-4、IL-5、IL-2R、腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、干擾素 γ（interferon γ，IFN-γ）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等]以及NFAT殘留基因表達(dá)（NFAT regulated gene expression，NFAT-RGE）等來(lái)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞功能[24]。一項(xiàng)關(guān)于特發(fā)性蕁麻疹患者的研究顯示，使用環(huán)孢素A治療的患者臨床癥狀均明顯減輕，其中70%的患者達(dá)到完全緩解；同時(shí)該研究還監(jiān)測(cè)到，與治療前相比，治療后患者的IL-2R（P＜0.001）、IL-5（P＝0.001）、TNF-α（P＝0.001）表達(dá)水平均顯著降低[25]。另一項(xiàng)關(guān)于肝移植患者的研究顯示，環(huán)孢素A血藥谷、峰濃度與NFAT殘留基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.000 1）；發(fā)生與未發(fā)生感染的患者環(huán)孢素A血藥谷、峰濃度差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在發(fā)生腎毒性的患者中也沒(méi)有觀察到環(huán)孢素A血藥谷、峰濃度明顯升高[26]。這都進(jìn)一步說(shuō)明了環(huán)孢素A血藥濃度與臨床預(yù)后之間存在不一致性。一項(xiàng)關(guān)于肝移植的研究測(cè)定了NFAT-RGE、IL-2、INF-γ以及GM-CSF，并觀察了患者T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)（T cell-mediated acute rejection，TCMAR）和巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）感染的發(fā)生情況。結(jié)果顯示，NFAT-RGE等4個(gè)指標(biāo)在發(fā)生TCMAR患者中的表達(dá)均明顯高于未發(fā)生TCMAR患者，而在發(fā)生CMV感染患者中的表達(dá)明顯低于未發(fā)生CMV感染患者；發(fā)生TCMAR與未發(fā)生TCMAR患者的環(huán)孢素A血藥濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[27]。該研究結(jié)果也佐證了CMV感染的發(fā)生與環(huán)孢素A全血濃度無(wú)相關(guān)性。目前環(huán)孢素A在臨床應(yīng)用中一般根據(jù)患者的血藥濃度或疾病狀態(tài)調(diào)整給藥劑量。一項(xiàng)關(guān)于腎移植患者用藥調(diào)整的研究比較了以NFAT-RGE（試驗(yàn)組，n＝28）和以環(huán)孢素A血藥谷濃度（對(duì)照組，n＝27）調(diào)整給藥方案的治療效果，結(jié)果顯示，對(duì)照組中有4名患者發(fā)生感染，試驗(yàn)組無(wú)感染發(fā)生，且對(duì)照組中有6名患者發(fā)生代謝紊亂，2名患者發(fā)生心血管不良反應(yīng)；試驗(yàn)組患者的環(huán)孢素A用藥劑量以及血藥谷、峰濃度均低于對(duì)照組。該研究結(jié)果說(shuō)明，根據(jù)NFAT-RGE調(diào)整環(huán)孢素A劑量可以在保證藥物有效的前提下，最大程度減輕藥物的毒副反應(yīng)[28]。此外還有研究表明，長(zhǎng)期穩(wěn)定腎移植患者NFAT-RGE水平在20%～30%之間的預(yù)后較好[29]。

4 環(huán)孢素A代謝物濃度與其臨床療效的相關(guān)性

環(huán)孢素A進(jìn)入體內(nèi)，通過(guò)細(xì)胞色素P450酶系代謝后主要生成AM1、AM9、AM4N等30余種代謝物[30]。有研究提示，環(huán)孢素A的腎毒性、心臟毒性以及感染等毒副反應(yīng)可能與其代謝物有關(guān)[31-33]。一篇關(guān)于環(huán)孢素A代謝物的綜述指出，AM1、AM9、AM19與環(huán)孢素A的腎毒性有關(guān)，其中AM1與AM9由環(huán)孢素A經(jīng)單羥化反應(yīng)而得，這種代謝途徑可以增加環(huán)孢素A的極性，使其易于排泄，減少毒副作用的發(fā)生[31]。環(huán)孢素A在腎臟代謝的能力比在肝臟代謝的能力弱，這或許可以解釋其腎毒性。另一項(xiàng)關(guān)于腎移植的研究測(cè)定了患者的環(huán)孢素A全血濃度和AM1、AM9、AM4N、去甲基化代謝物（demethylcarboxylated-CsA，dMC-CsA）、二羥化代謝物（dihydroxylated-CsA，DiH-CsA）以及三羥化代謝物（trihydroxylated-CsA，TriH-CsA）濃度，記錄了治療期間收縮和（或）舒張壓升高、室上性/室性心律失常、心肌梗死等心血管不良事件，以及糖尿病、肥胖、高三酰甘油、高膽固醇等心血管風(fēng)險(xiǎn)因素的發(fā)生情況，探究其與環(huán)孢素A代謝物濃度的關(guān)系[32]。研究結(jié)果表明，糖尿病患者中AM4N、AM1、AM9、AM1c、AM1c9、AM19代謝物濃度較低，這可能與糖尿病患者肝臟代謝功能較低有關(guān)；而在這些糖尿病患者中AM1濃度的升高與室上性心律失常以及舒張壓升高有關(guān)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，較高濃度的AM4N、dMC-CsA、AM1、DiH-CsA、TriH-CsA以及較低濃度的AM9與心血管不良反應(yīng)有關(guān)。另外一項(xiàng)關(guān)于肝移植的研究測(cè)定了環(huán)孢素A及其代謝物的濃度，研究其與患者發(fā)生感染的關(guān)系[33]。研究結(jié)果表明，有病毒感染史的肝移植患者的DiH-CsA/環(huán)孢素A、TriH-CsA/環(huán)孢素A濃度比值較高，其中有人類(lèi)皰疹病毒感染史的肝移植患者的dMC-CsA/環(huán)孢素A、AM1/環(huán)孢素A、DiH-CsA/環(huán)孢素A以及TriH-CsA/環(huán)孢素A濃度比值更高，有細(xì)菌感染史的肝移植患者的AMI/環(huán)孢素A濃度比值更高。

5 結(jié)語(yǔ)

從文獻(xiàn)研究來(lái)看，PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度、CN活性和T細(xì)胞功能變化以及環(huán)孢素A代謝物濃度均具有預(yù)示環(huán)孢素A臨床療效以及不良反應(yīng)發(fā)生的作用。通過(guò)監(jiān)測(cè)這些指標(biāo)有望優(yōu)化器官移植患者的給藥方案，減少感染與急性排斥反應(yīng)等不良反應(yīng)的發(fā)生。而對(duì)于自身免疫疾病患者來(lái)說(shuō)，由于其臨床用藥的復(fù)雜性，環(huán)孢素A通常與激素以及其他免疫功能調(diào)節(jié)藥物合用，僅根據(jù)環(huán)孢素A血藥濃度調(diào)整給藥劑量可能收效甚微，而同時(shí)進(jìn)行以上指標(biāo)的監(jiān)測(cè)，更有利于進(jìn)一步確定臨床療效不佳的原因，從而指導(dǎo)治療方案的調(diào)整或環(huán)孢素A用藥劑量的調(diào)整。

然而，上述這些能夠表征環(huán)孢素A臨床療效的指標(biāo)中，目前除了環(huán)孢素A全血藥物濃度外，PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度、CN活性和T細(xì)胞功能變化以及環(huán)孢素A代謝物濃度均尚無(wú)常規(guī)開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目。單就實(shí)驗(yàn)室檢查方法而言，檢測(cè)試劑的可及性、檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性等并不是瓶頸。比如T細(xì)胞功能（包括IL-2、NFAT、GM-CSF、TNF-α以及INF-γ等細(xì)胞因子）的測(cè)定已有商品化引物試劑，CN活性測(cè)定也有相應(yīng)試劑盒上市，且對(duì)于這些指標(biāo)大多數(shù)都通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)儀、色譜儀以及流式細(xì)胞儀等常規(guī)儀器進(jìn)行檢測(cè)。但如何將檢測(cè)結(jié)果與臨床實(shí)際用藥效果形成一一量化對(duì)應(yīng)關(guān)系，給臨床提供操作性更強(qiáng)的量化指標(biāo)才是應(yīng)用這些指標(biāo)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。要解決這一關(guān)鍵問(wèn)題還有賴(lài)于更多的臨床研究數(shù)據(jù)。目前，上述指標(biāo)中PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度測(cè)定的研究相對(duì)較多，且2020年已有國(guó)際專(zhuān)家共識(shí)[13]總結(jié)了其監(jiān)測(cè)方法的技術(shù)要求及詳細(xì)步驟，大大提高了其臨床可行性。

綜上所述，PBMCs內(nèi)環(huán)孢素A濃度、CN活性和T細(xì)胞功能變化以及環(huán)孢素A代謝物濃度對(duì)環(huán)孢素A的臨床療效以及不良反應(yīng)均有一定的預(yù)示作用，可彌補(bǔ)環(huán)孢素A血藥濃度監(jiān)測(cè)的不足，但其臨床實(shí)用性還需進(jìn)一步提高。