劉嘉方，李 蕾，云興福

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院，包頭 014030；3.滿洲里俄語職業(yè)學(xué)院，滿洲里 021400）

番茄晚疫病由致病疫霉Phytophthora infestans（Mont.）de Bary侵染所致，是番茄生產(chǎn)上的毀滅性病害[1]。致病疫霉屬卵菌綱 Oomycetes，主要侵染番茄的葉和莖，在潮濕、涼爽的環(huán)境條件下侵染速度極快，會(huì)加速病害發(fā)生，造成嚴(yán)重?fù)p失[2]。傳統(tǒng)生產(chǎn)上多采用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)番茄晚疫病進(jìn)行防治，但農(nóng)藥的大量使用會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，目前需要尋找一種綠色環(huán)保、生態(tài)有效的防治方法。

化感作用（allelopathy）是植物通過釋放化學(xué)物質(zhì)進(jìn)而影響自身或其他微生物的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。利用植物化感作用可以有效防治蔬菜病害，如大蒜的根系提取物對(duì)番茄晚疫病菌[4]、辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、番茄青枯病菌Ralstonia solanacearum和番茄灰霉病菌Botrytis cinerea[5]等多種病原菌均有顯著抑制效果；韭菜揮發(fā)物[6]、西芹提取物[7]和蠶豆根系分泌物[8]能抑制枯萎病菌Fusariumspp.的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)，降低病原菌的致病力。煙草Nicotiana tabacumL.是一種一年生或有限制性的多年生的草本植物，全株被細(xì)毛，基生稍木質(zhì)化，在夏天和秋天開花[9]。作為一種高敏感的化感植物，煙草的根系分泌物[10]、葉片浸提物[11]以及殘?bào)w腐解物[12]等不同部位均具有化感效應(yīng)。煙草中機(jī)酸類、煙堿類、酮類物質(zhì)及鉀元素等含量較高，可促進(jìn)作物生長(zhǎng)，并有一定的抗病效果[13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的煙草浸提液對(duì)水稻[14]和萵苣[15]等作物的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用；煙草化感物質(zhì)能提高植物的光合能力，對(duì)真菌、細(xì)菌和放線菌有明顯的抑制作用[16]，對(duì)蔬菜病蟲害也有較好的防治效果[17]。因此，煙草化感作用在番茄晚疫病防治方面具有較大潛力。

本研究通過菌絲生長(zhǎng)和致病力測(cè)定探討煙草浸提液對(duì)番茄晚疫病菌的化感作用，并連續(xù)處理多代，直至獲得 1株符合疫霉菌弱毒評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的 PIAS-R菌株（番茄晚疫病菌弱毒菌株英文全稱Phytophthora infestansattenuated strain，PIAS）。并進(jìn)一步通過測(cè)定PIAS-R菌株的孢子萌發(fā)率、菌絲生物量和細(xì)胞壁降解酶活性，觀察菌絲體形態(tài)特征及其轉(zhuǎn)錄組分析比較，解析煙草浸提液對(duì)番茄晚疫病菌的化感抑制效應(yīng)機(jī)理，以期為利用煙草防治蔬菜病害或研制植物性抑菌劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：干煙草由遼寧省朝陽煙草基地提供，品種為“大葉葵”；番茄晚疫病病原菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供；番茄種子購自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科學(xué)院，品種為“粉紅918”。

菌種培養(yǎng)：試驗(yàn)前期將保存的番茄晚疫病病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，7 d后菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，菌落形態(tài)完整，可進(jìn)一步擴(kuò)繁備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂16 g、蒸餾水1 L；馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose，PD）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L；改良MS培養(yǎng)基（Murashige & Skoog，MS）：KNO32 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，VB10.1 mg，L-天冬酰胺 0.5 g，羧甲基纖維素鈉鹽 10 g或柑橘果膠 10 g，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 煙草浸提液的制備 用天平稱取煙草根、葉6 g等量3份置于100 mL錐形瓶中，分別以1:10比例加入蒸餾水，25 ℃條件下?lián)u床振蕩浸提（240 r/min），1 d后取出置于超凈工作臺(tái)上，然后過濾，第1次用定性濾紙過濾除濾渣，第2次經(jīng)細(xì)菌過濾器（0.22 μm）過濾除菌2次，即得煙草根、葉浸提液母液，濃度為100 mg/mL；將煙草浸提液母液用無菌水稀釋2倍作為處理濃度（50 mg/mL），貯于冰箱（4 ℃）中備用。PI-R代表根浸提液處理，PI-L代表葉浸提液處理。

1.2.2 不同煙草浸提液每代處理后篩選番茄晚疫病菌弱毒菌株 煙草對(duì)番茄晚疫病菌的化感作用：在無菌條件下，用直徑為0.6 cm的打孔器打取番茄晚疫病病原菌株，用接種針將菌餅移入不同PDA培養(yǎng)基（121℃，30 min）中。以培養(yǎng)皿中添加2 mL各處理浸提液和18 mL培養(yǎng)基的平板為處理，以添加20 mL培養(yǎng)基的平板為對(duì)照（CK）。菌絲面向下，每皿取1塊放于中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)2 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（cm）[18]。每隔1 d測(cè)1次，共測(cè)5次。持續(xù)培養(yǎng)6 d后長(zhǎng)出的菌落為第1代。用打孔器分別打取第1代各處理和對(duì)照菌餅放入上述對(duì)應(yīng)不同培養(yǎng)基中，長(zhǎng)出的菌落為第2代，依此類推，直至處理培養(yǎng)8代，測(cè)定每一代的菌落直徑，5次重復(fù)。菌落直徑（cm）=測(cè)量菌落直徑平均值－0.6 cm，化感效果（%）=（對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100。

煙草對(duì)番茄晚疫病菌的抑制效果：取25 ℃條件下在PDA平板上培養(yǎng)6 d的每一代各處理番茄晚疫病菌，在平板中央加入適量預(yù)冷的無菌水，用涂布棒輕輕刮取菌絲表面，2層紗布過濾即得到孢子囊懸浮液，在顯微鏡下調(diào)整濃度為5.0×104cfu/mL，將配制好的懸浮液在4 ℃低溫箱靜置2～3 h，釋放的游動(dòng)孢子用于接種。以接種番茄晚疫病病原菌的孢子囊懸浮液為對(duì)照（CK）。將露白的番茄種子播種在直徑為8 cm的塑料育苗缽中自然生長(zhǎng)，每缽1株，待番茄植株長(zhǎng)至6～8葉期時(shí)，用手持噴壺在植株葉片正反面分別均勻噴施不同處理的懸浮液，以葉面上有明顯小液滴為度。接種處理在下午 6－7點(diǎn)進(jìn)行并在噴施完扣上小棚保溫保濕，在接種21 d后依據(jù)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[19]進(jìn)行番茄晚疫病調(diào)查并計(jì)算病情指數(shù)，每處理24株，3次重復(fù)。病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病葉數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)數(shù)）×100。

第一，福建小學(xué)學(xué)校的數(shù)量和施教人數(shù)逐年增加?！岸拍旮闹浦酰O(shè)中心學(xué)校875校、國民學(xué)校3700校、私立小學(xué)586校、共4161校① 原文計(jì)算有誤，應(yīng)為5161校。，施教人數(shù)小學(xué)部514490人。三十年中心學(xué)校增為1164校、國民學(xué)校增為3782校、私立小學(xué)516校、共5462校、施教人數(shù)小學(xué)部648551人。三十一年中心學(xué)校增為1349校、國民學(xué)校增為4041校、私立小學(xué)468校、共5732校②原文計(jì)算有誤，應(yīng)為5858校。、施教人數(shù)小學(xué)部634562人。”［27］13三年間，小學(xué)學(xué)校的數(shù)量增長(zhǎng)了1571所，施教人數(shù)僅小學(xué)部就增長(zhǎng)了120072人。

1.2.3 PIAS-R生理指標(biāo)的測(cè)定 將1.2.2篩選到的番茄晚疫病菌弱毒菌株P(guān)IAS-R進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，以番茄晚疫病病原菌株為對(duì)照（CK），5次重復(fù)。

孢子萌發(fā)率的測(cè)定：參照黃英菊等[20]的方法制備濃度為1×107cfu/mL的PIAS-R和CK菌株游動(dòng)孢子懸浮液。將制備好的游動(dòng)孢子懸浮液在黑暗10 ℃條件下放置3 h，刺激游動(dòng)孢子萌發(fā)。每次鏡檢50個(gè)游動(dòng)孢子，計(jì)算孢子萌發(fā)率（注：芽管長(zhǎng)度達(dá)孢子直徑一半時(shí)認(rèn)為萌發(fā)），孢子萌發(fā)率（%）=孢子萌發(fā)數(shù)/孢子總數(shù)×100。

菌絲生物量的測(cè)定：在無菌條件下，用接種針將等齡PIAS-R和CK菌餅移入30 mL PD培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)6 d后收集菌絲，蒸餾水洗滌、晾干，記錄菌絲生物量（g）[21]。

粗酶液的制備：無菌條件下，分別取等齡PIAS-R和CK菌落，移至事先滅菌的50 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基（改良MS和PD培養(yǎng)基）中，每個(gè)三角瓶接種直徑0.6 cm的5塊菌餅，并在26 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)6 d，將收集的培養(yǎng)液用3層紗布過濾，除去孢子和菌絲體，濾液在4 ℃下12000×g離心15 min，再次過濾后棄去沉淀，取上清液為粗酶液，將其保存在4 ℃下待測(cè)。測(cè)定各項(xiàng)細(xì)胞壁降解酶指標(biāo)。β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定參照高曉敏[22]的方法；纖維素酶活性測(cè)定參照 Eveleigh等[23]方法；果膠酶活性測(cè)定參考姜立春等[24]方法；蛋白酶活性測(cè)定參照趙爽等[25]方法。

1.2.4 PIAS-R菌絲體形態(tài)觀察 用相機(jī)對(duì)1.2.2篩選到的番茄晚疫病菌弱毒菌株P(guān)IAS-R菌落進(jìn)行直接拍照，以番茄晚疫病病原菌株菌落為對(duì)照（CK）。同時(shí)從PDA平板上挑取菌絲用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX53）以200倍放大倍數(shù)觀察菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)，選擇典型特征視野對(duì)菌絲進(jìn)行拍照和描述。

1.2.5 PIAS-R轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 將1.2.2篩選到的番茄晚疫病菌弱毒菌株P(guān)IAS-R用無菌鑷子小心刮取菌絲體300 mg，放入提前標(biāo)記的凍存管中，液氮冷凍，-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。以番茄晚疫病病原菌株菌絲體為對(duì)照（CK），3次重復(fù)。利用DNase提取樣品的總RNA；用1%瓊脂糖凝膠電泳和Agilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)總RNA的完整性、純度和濃度；文庫的構(gòu)建參照TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit的說明進(jìn)行；使用Illumina HiSeqTM 2500平臺(tái)進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用WPS（2019）軟件處理原始數(shù)據(jù)，SPSS（20.0）統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，T檢驗(yàn)法（T-test）、最小顯著差異法（LSD）和Duncan法（SSR）多范圍檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。轉(zhuǎn)錄測(cè)序中用eXpress[26]軟件分析基因FPKM[27]，用DESeq[28]軟件進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析。篩選出P＜0.05且|log2fold change| ≥1的差異基因進(jìn)行GO和KEGG[29]富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草浸提液每代處理后番茄晚疫病菌弱毒菌株的篩選

表1 不同煙草浸提液對(duì)番茄晚疫病菌的化感作用Table 1 Allelopathy of different tobacco extracts on Phytophthora infestans

2.1.2 煙草浸提液對(duì)番茄晚疫病菌的抑制效果 在番茄植株6～8葉期，用每一代各處理菌株的懸浮液對(duì)番茄植株進(jìn)行人工接種。從接種后21 d開始調(diào)查不同菌株的病情指數(shù)（圖1）。隨接種代數(shù)的增加，每一代各處理的病情指數(shù)均始終低于CK且有顯著差異。在接種后21 d，每一代PI-R處理的病情指數(shù)較CK顯著降低37.31%、41.43%、47.88%、49.30%、60.97%、70.56%、76.63%和82.45%。接種后期PI-R處理的病情指數(shù)顯著低于PI-L處理。在連續(xù)處理8代后，煙草浸提液對(duì)番茄晚疫病菌有明顯的抑制效果，其中PI-R處理菌株在第7、8代的病情指數(shù)連續(xù)＜10，表明已經(jīng)由番茄晚疫病菌的強(qiáng)致病性菌株逐步變?yōu)槿踔虏⌒跃?，將這株番茄晚疫病菌弱毒菌株命名為PIAS-R。此外，隨繼代培養(yǎng)代數(shù)的增加，CK菌株的病情指數(shù)總體表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)，說明繼代培養(yǎng)對(duì)番茄晚疫病菌的致病力有一定的抑制作用。

圖1 不同煙草浸提液處理后番茄晚疫病菌致病力的變化Fig.1 Changes of pathogenicity of Phytophthora infestans after treatment with different tobacco extracts

2.2 PIAS-R孢子萌發(fā)、生物量和酶活性的變化

對(duì)PIAS-R和CK菌株的孢子萌發(fā)率、菌絲生物量和細(xì)胞壁降解酶活性進(jìn)行測(cè)定（表2）。PIAS-R菌株的孢子萌發(fā)率和生物量為31.4%和0.224 g，較CK菌株顯著降低55.01%和35.45%。PIAS-R菌株分泌的4種細(xì)胞壁降解酶活性均低于CK菌株且有顯著差異。β-葡萄糖苷酶、纖維素酶、果膠酶和蛋白酶活性較對(duì)照降低33.79%、51.11%、60.11%和37.63%；其中纖維素酶和果膠酶活性最低，為10.15 μ/(g·min)和110.52 U/mL。說明PIAS-R菌株分泌更低活性的纖維素酶和果膠酶，且分泌的果膠酶活性下降程度大于纖維素酶。

表2 PIAS-R的孢子萌發(fā)率、菌絲生物量和酶活性Table 2 Spore germination rate, mycelial biomass and enzymes activities of PIAS-R

2.3 PIAS-R菌絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

2.3.1 PIAS-R菌絲體形態(tài)比較 對(duì)25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后的PIAS-R和CK菌株進(jìn)行拍照觀察（圖2）。通過觀察菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)不同菌株的形態(tài)特征有較大差異（表3）。PDA平板透明光滑，菌絲都以接種塊為中心，生長(zhǎng)成圓形或近圓形的絨毛狀或絮狀菌絲體。與CK菌株相比，PIAS-R菌株的菌落顏色和表型不同且生長(zhǎng)速率減慢。

表3 PIAS-R的形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of PIAS-R

圖2 PIAS-R在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6 d后的菌落狀態(tài)Fig.2 Colony status of PIAS-R after 6 d growth on PDA medium

2.3.2 PIAS-R菌絲體顯微結(jié)構(gòu)的觀察 從PDA平板上挑取PIAS-R和CK菌絲體，用光學(xué)顯微鏡觀察不同菌株的顯微結(jié)構(gòu)（圖3）。在放大200倍的顯微鏡視野下觀察PIAS-R菌絲體出現(xiàn)不同種類的畸形變化，包括菌絲分枝增多（圖3A），原生質(zhì)分布不均勻（圖3B），菌絲局部膨脹（圖3C）、變短（圖3D）、扭曲和透明（圖3E，F(xiàn)），菌絲相互纏繞（圖3G）且頂端膨大（圖3H）；而正常生長(zhǎng)的CK菌絲體光滑順直、粗細(xì)均一、內(nèi)含物飽滿且原生質(zhì)分布均勻（圖3I-L）。

圖3 PIAS-R的微觀變化Fig.3 Microscopic changes of PIAS-R

2.4 PIAS-R轉(zhuǎn)錄組分析

2.4.1 總RNA質(zhì)量分析及差異表達(dá)基因的篩選 對(duì)6 個(gè)樣本進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序后獲得總 RNA 質(zhì)量結(jié)果（表 4）。根據(jù)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量統(tǒng)計(jì)，可進(jìn)行后續(xù)相關(guān)數(shù)據(jù)分析。將 RNA讀取映射到基因組中，分析PIAS-R和CK菌株的差異表達(dá)，繪制差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）統(tǒng)計(jì)圖（圖4），PIAS-R相對(duì)于CK有2651個(gè)基因（P＜0.05，|log2fold change| ≥1）在表達(dá)水平上存在顯著差異，其中1086個(gè)DEGs上調(diào)，1565個(gè)DEGs下調(diào)。

圖4 RNA差異表達(dá)基因?qū)Ρ葓DFig.4 RNA statistics and comparison plot of differently expressed genes (DEGs)

表4 總RNA的質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 4 Quality results of total RNA

2.4.2 GO富集分析 對(duì)PIAS-R與CK之間的DEGs進(jìn)行GO 功能富集分析，選取富集最顯著的前30個(gè)分類條目，繪制GO富集柱狀圖（圖5）。在 GO 數(shù)據(jù)庫中，DEGs根據(jù)功能分為生物過程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3 大類。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的與菌株生長(zhǎng)發(fā)育和致病力相關(guān)的GO功能分類，生物過程中的內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)集合（eisosome assembly）、纖維素分解代謝過程（cellulose catabolic process）和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)（lipid transport）均在上/下調(diào)DEGs富集最多的條目；細(xì)胞組分中內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)（eisosome）、脂滴（lipid droplet）和細(xì)胞壁（cell wall）均在上/下調(diào)DEGs富集最多的條目；分子功能中的纖維素結(jié)合（cellulose binding）、纖維素酶活性（cellulase activity）和單酚單加氧酶活性（monophenol monooxygenase activity）均在上/下調(diào)DEGs富集最多的條目。

圖5 差異表達(dá)基因GO分類注釋top 30Fig.5 Top 30 GO classification of DEGs

2.4.3 KEGG富集分析 對(duì)PIAS-R與CK之間的DEGs進(jìn)行KEGG 顯著性通路富集分析，如圖6所示。結(jié)果表明，DEGs主要集中在其他氨基酸代謝（metabolism of other amino acids）、脂質(zhì)代謝（lipid metabolism）、能量代謝（energy metabolism）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）和氨基酸代謝（amino acid metabolism）通路中。

圖6 差異表達(dá)基因KEGG富集通路Fig.6 Enriched KEGG pathways of DEGs

3 討論

煙草中的有機(jī)酸類[30]和生物堿類[31]物質(zhì)對(duì)常見的植物病原菌都有一定的抑制作用。病原菌弱毒菌株一般可通過自然分離法[32]、化學(xué)刺激法[33]和植物提取物化感法[34]等篩選獲得。在篩選番茄晚疫病菌的弱毒菌株時(shí)，根據(jù)疫霉菌致病力分類標(biāo)準(zhǔn)[35]把病情指數(shù)＜10的菌株認(rèn)定為弱致病性菌株。本研究中，煙草根、葉浸提液對(duì)番茄晚疫病菌的菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)為化感抑制作用，且隨處理代數(shù)的增加抑制作用累積增強(qiáng)；培養(yǎng)后期PI-R處理的菌落直徑始終低于CK且有顯著差異。經(jīng)過連續(xù)8代處理，煙草浸提液對(duì)番茄晚疫病菌的抑制效果逐漸提高；接種后每一代各處理菌株的病情指數(shù)均始終低于CK且有顯著差異；其中，PI-R處理菌株在第7、8代的病情指數(shù)連續(xù)＜10，據(jù)此確定第8代PI-R處理的番茄晚疫病菌為番茄晚疫病菌弱毒菌株P(guān)IAS-R。另外，由于連續(xù)處理代數(shù)較多，本試驗(yàn)僅僅利用人工接種對(duì)每一代不同處理的番茄晚疫病菌進(jìn)行致病力測(cè)定，而沒有對(duì)接種發(fā)病后各代番茄植株上的病原菌進(jìn)行重新分離，并再次接種測(cè)定其致病力的穩(wěn)定性，這在后續(xù)的試驗(yàn)過程中會(huì)進(jìn)一步探討研究。

李楊等[36]觀察表明不同油茶炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides的致病力可能與其孢子萌發(fā)率存在一定關(guān)系。朱荷琴等[37]對(duì)棉花黃萎病菌Verticillium dahliae不同致病菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致病菌株的生物量都高于弱致病菌株。Khaledi等[38]發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌F.graminearum強(qiáng)致病力菌株產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性水平明顯高于弱致病力菌株。王前前[39]研究發(fā)現(xiàn)核盤菌Sclerotinia sclerotiorum低毒菌株 SZ-150菌絲較細(xì)小，分枝較多，較為密集。黃娟等[40]研究表明核盤菌的致病力減弱和生長(zhǎng)抑制與其菌絲結(jié)構(gòu)和形態(tài)變異有關(guān)，其弱致病型 Ep-1PN具有菌落擴(kuò)展、菌絲頂端分枝異常、原生質(zhì)不均勻和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不完整等特點(diǎn)。

番茄晚疫病菌以孢子或菌絲體形式在植株病殘?bào)w或土壤中存活，通過氣流或雨水侵染到番茄植株上[41]。本研究中，PIAS-R菌株的孢子萌發(fā)率、菌絲生物量和細(xì)胞壁降解酶活性均低于CK菌株且有顯著差異，菌絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)畸形變化（菌落變薄、顏色變淺，菌絲分枝增多、頂端膨大、變短、扭曲和透明，原生質(zhì)分布不均勻），推測(cè)煙草是通過抑制菌株的孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和自身分泌的酶活性，破壞菌絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響對(duì)寄主的侵染能力，從而來發(fā)揮抑菌作用的。

內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)是一種大型蛋白復(fù)合體，可作為支架誘導(dǎo)膜皺紋或內(nèi)陷[42]。病原真菌的菌絲體生長(zhǎng)受阻或形態(tài)發(fā)生畸變可能是細(xì)胞中的纖維素發(fā)生變化[43]。脂滴參與菌絲生長(zhǎng)和致病力等表型[44]。本研究中，根據(jù)GO功能富集分析，內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)集合、內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)、纖維素分解代謝過程、纖維素結(jié)合、纖維素酶活性和脂滴均在上調(diào)DEGs主要富集的分類條目中。推測(cè)煙草通過調(diào)控菌體內(nèi)內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)、纖維素和脂滴相關(guān)編碼基因上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而影響菌株的表型特征、菌絲生長(zhǎng)和致病力等。

缺失脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變體在生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和致病力等方面表現(xiàn)出了諸多缺陷[45]。致病真菌細(xì)胞壁對(duì)其毒力和致病力至關(guān)重要，可以保護(hù)菌株免受宿主防御機(jī)制的傷害[46]。單酚加氧酶是酪氨酸酶[47]，低活性的酪氨酸酶能降低菌株的褐變度[48]。酪氨酸酶是生物體中參與黑色素合成的關(guān)鍵酶[49]，缺乏黑色素生成的突變菌株喪失致病能力[50]。本研究中，根據(jù)GO功能富集分析，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁和單酚單加氧酶活性均在下調(diào)DEGs主要富集的分類條目中。推測(cè)煙草通過調(diào)控菌體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁和酪氨酸酶相關(guān)編碼基因下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而影響菌株的孢子萌發(fā)、致病力和菌落顏色等。煙草具體調(diào)控哪些編碼基因差異表達(dá)來影響菌株的生長(zhǎng)和致病力還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，煙草浸提液對(duì)番茄晚疫病菌具有良好的化感抑制作用，其抑菌機(jī)理與干擾菌株生理生化代謝，破壞菌絲體形態(tài)結(jié)構(gòu)，影響菌體內(nèi)的基因表達(dá)有關(guān)。后續(xù)需進(jìn)一步明確煙草內(nèi)部抑菌活性物質(zhì)及差異基因的具體調(diào)控機(jī)制，最終開發(fā)出防治番茄晚疫病的有效植物源。