費(fèi) 鵬，史恩聰，姚繼云，郝夢(mèng)迪，張雅晴，段京瑤，劉海瀛，劉登科

（1.南陽(yáng)理工學(xué)院張仲景康養(yǎng)與食品學(xué)院，河南南陽(yáng) 473000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；3.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽(yáng) 471000）

1 克羅諾桿菌對(duì)嬰幼兒的危害

克羅諾桿菌（Cronobacter spp.），屬于腸桿菌科，是一個(gè)具有高度遺傳多樣性的屬，該菌屬由7個(gè)種組成：阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）、丙二酸鹽克羅諾桿菌（C.malonaticus）、蘇黎世克羅諾桿菌（C.turicensis）、莫金斯克羅諾桿菌（C.muytjensii）、康帝蒙提克羅諾桿菌（C.condimenti）、尤尼沃斯克羅諾桿菌（C.universalis） 和都柏林克羅諾桿菌（C.dublinensis）[1]。在這7個(gè)種中，阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌能夠?qū)е氯梭w嚴(yán)重的臨床感染。嬰幼兒，尤其是體重較輕的早產(chǎn)兒，一旦食用了被克羅諾桿菌污染的食品，就會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腦膜炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和敗血癥等疾病，并帶來嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，死亡率高達(dá)40%～80%，嚴(yán)重危害著嬰幼兒的健康[2]。2002年，國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)就將克羅諾桿菌列為了“嚴(yán)重危害特定人群生命、引起長(zhǎng)期慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥的一種致病菌”[3]。2004年，世界衛(wèi)生組織將克羅諾桿菌列為嬰幼兒配方乳粉中的A類致病菌，此后該菌的危害風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別被高度重視[4]。

2 我國(guó)嬰兒食品中克羅諾桿菌污染的現(xiàn)狀

2.1 嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染情況

我國(guó)是嬰兒配方乳粉生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染不僅制約了該行業(yè)的健康發(fā)展，而且嚴(yán)重威脅著嬰幼兒的健康。表1總結(jié)了近年來我國(guó)市售嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染情況[2，5-13]，2008—2019年，該來源的克羅諾桿菌的污染率為1.11%～23.08%，污染率有所下降，但未見明顯規(guī)律，這說明嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染與生產(chǎn)企業(yè)個(gè)體的生產(chǎn)環(huán)境和衛(wèi)生管理直接相關(guān)。此外，研究表明原材料、加工環(huán)境、運(yùn)輸及銷售等環(huán)節(jié)都有可能污染克羅諾桿菌。同時(shí)，如果嬰兒配方乳粉開封后保存不當(dāng)，克羅諾桿菌也可以通過空氣污染產(chǎn)品，并在嬰兒配方乳粉中長(zhǎng)期存活[13]。因此，為了避免克羅諾桿菌的二次污染，嬰兒配方乳粉的生產(chǎn)和運(yùn)輸環(huán)節(jié)必須進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理，產(chǎn)品沖調(diào)最好使用70℃左右的熱水，從而盡可能地消除克羅諾桿菌對(duì)嬰幼兒的感染途徑。

中國(guó)嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌污染狀況見表1。

表1 中國(guó)嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌污染狀況

2.2 其他嬰兒食品中克羅諾桿菌的污染情況

隨著嬰兒食品資源和種類的多樣化，研究發(fā)現(xiàn)克羅諾桿菌不僅能夠污染嬰兒配方乳粉，其他的嬰兒食品中也檢測(cè)到了該致病菌。表2總結(jié)了2008—2018年10年間我國(guó)市售嬰兒食品中克羅諾桿菌的污染情況，這些嬰兒食品覆蓋了奶片、嬰幼兒餅干、嬰幼兒谷物食品、嬰幼兒米粉、嬰幼兒面條和其他輔食?？肆_諾桿菌的污染率從4.17%到27.3%不等，其中2018年陜西地區(qū)嬰幼兒米粉中克羅諾桿菌的污染率高達(dá)27.3%。此外，與嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的污染率相比，其他嬰兒食品中該致病菌的污染率普遍較高。這表明與嬰兒配方乳粉相比，其他嬰兒食品的原輔料、加工和運(yùn)輸環(huán)境及包裝材料等的衛(wèi)生清潔程度有待進(jìn)一步提高，而應(yīng)用于嬰兒配方乳粉生產(chǎn)的法律法規(guī)及生產(chǎn)要求也應(yīng)適用于其他嬰兒食品。

其他嬰兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況見表2。

表2 其他嬰兒食品中克羅諾桿菌的污染狀況

3 克羅諾桿菌溯源中方法及應(yīng)用

3.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型

脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）是基于細(xì)菌上限制性內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)分布建立的一種分型方法，其辨識(shí)度高，是細(xì)菌分型傳統(tǒng)的方法之一[23]。Fei P等人[24]利用PFGE技術(shù)對(duì)市售的嬰兒配方乳粉進(jìn)行分型溯源研究，發(fā)現(xiàn)雖然市售的地點(diǎn)不同，但是來自同一地區(qū)的克羅諾桿菌具有更為相近的PFGE圖譜。許龍巖等人[25]對(duì)分離自不同地區(qū)食品中的阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行了PFGE分型研究，結(jié)果表明，部分食品被PFGE圖譜相近的菌株污染，認(rèn)為PFGE可以用于食品中阪崎克羅諾桿菌的溯源。然而，并不是所有的克羅諾桿菌都具有Xba I或Sep I的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，且PFGE并不能對(duì)受試菌株進(jìn)行鑒定，導(dǎo)致了一些假陽(yáng)性的存在，這就給PFGE技術(shù)在溯源中的應(yīng)用帶來局限性。

3.2 多位點(diǎn)序列分型

多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型的方法，這種方法通過特異性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)6～10個(gè)400～600 bp的管家基因進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)定其序列，將得到的序列信息在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比分析，得到其序列型，從而對(duì)分離株進(jìn)行分型和溯源研究[4]。與其他分型方法相比，多位點(diǎn)序列分型技術(shù)操作簡(jiǎn)便，辨識(shí)度較高，能夠進(jìn)行種水平的鑒定，且具有高度的共享性，越來越多的研究者采用此項(xiàng)技術(shù)對(duì)克羅諾桿菌進(jìn)行公共安全實(shí)踐的相似性查詢和溯源研究[26]。目前，已經(jīng)建立了克羅諾桿菌多位點(diǎn)序列分型數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.pubmlst.org/cronobacter），其中已包含3 164株不同來源的克羅諾桿菌，113 430個(gè)等位基因，759個(gè)序列型；此外，980株克羅諾桿菌已經(jīng)完成了全基因組測(cè)序，所有的研究者都可以通過克羅諾桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)分享研究結(jié)果，并和其他研究者的研究結(jié)果進(jìn)行比較。因此，目前克羅諾桿菌分型和溯源的大量研究都采用此法。Fei P等人[24]利用MLST分型對(duì)分離自車間終產(chǎn)品和相應(yīng)環(huán)境樣品中的克羅諾桿菌進(jìn)行了分析，并通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在嬰兒配方乳粉生產(chǎn)中噴霧干燥、流化床和包裝過程是最易污染該致病菌的環(huán)節(jié)。通過MLST分析發(fā)現(xiàn)新生兒腦膜炎的發(fā)生與阪崎克羅諾桿菌序列型4（Sequence type 4，ST4）高度相關(guān)，ST1和ST83分別是分離自嬰兒食品和其加工環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)ST。此外，羅諾桿菌的序列型也與地域有一定的關(guān)系，如ST64是中國(guó)地區(qū)嬰兒食品中克羅諾桿菌的優(yōu)勢(shì)ST之一，而這種優(yōu)勢(shì)性在其他國(guó)家并未體現(xiàn)[2，24，26]。然而，雖然MLST分型展示出來的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系能夠一定程度上反映受試菌株全基因組的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，但是MLST分型能夠分析的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)量較少，很難達(dá)到基于堿基層面的精確溯源。

3.3 全基因組分型

全基因組分型是最為理想的分子分型方法，可準(zhǔn)確鑒定克羅諾桿菌屬菌種、亞種。全基因組的高通量測(cè)序技術(shù)（二代測(cè)序）較一代測(cè)序相比，不僅保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，且成本較一代測(cè)序較低[27]。研究發(fā)現(xiàn)全基因組測(cè)序結(jié)合MLST分型技術(shù)面對(duì)相同ST型的克羅諾桿菌進(jìn)行深度解析，如cog-MLST、SNP等分析，可以應(yīng)用于克羅諾桿菌的溯源研究[28]。閆瑞等人[29]研究表明通過cog-MLST可對(duì)ST型相同但無相關(guān)性的菌株進(jìn)一步分型，且對(duì)不同聚類與菌株分離國(guó)家及來源之間的密切相關(guān)性，結(jié)果表明，對(duì)于相同的ST克羅諾桿菌的溯源分析有較大的幫助。綜上所述，基于Pub-MLST數(shù)據(jù)庫(kù)從全基因組層面對(duì)不同來源菌株進(jìn)行分析，更有利于克羅諾桿菌的溯源研究。然而，在實(shí)際的應(yīng)用中，雖然二代測(cè)序較一代測(cè)序的費(fèi)用大大降低，但是其費(fèi)用仍高于MLST分型和PFGE分型，這也導(dǎo)致了此種方法目前沒有被廣泛應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

克羅諾桿菌的污染一直是困擾我國(guó)嬰兒食品產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的難題。近年來，雖然一些嚴(yán)格的食品安全衛(wèi)生管理措施被有效實(shí)施，嬰兒食品中克羅諾桿菌的污染率也有所減少，但是仍然不能消除該致病菌對(duì)嬰幼兒的危害。總結(jié)原因如下：①克羅諾桿菌具有較強(qiáng)的抗?jié)B透壓和耐干燥的能力，這使得該致病菌能夠在嬰兒食物中長(zhǎng)期存活[30]；②克羅諾桿菌能夠產(chǎn)生大量的生物膜，從而起到對(duì)自身的保護(hù)作用，減弱了消毒劑和抗生素對(duì)該致病菌的作用效果[31]；③目前我國(guó)嬰幼兒腦膜炎的治療側(cè)重點(diǎn)并沒有聚焦在是哪種致病菌導(dǎo)致的疾病發(fā)生，這在一定程度上切斷了克羅諾桿菌的溯源鏈。在嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的溯源中，除了PFGE分型、MLST分型和全基因組分型以外，隨機(jī)多態(tài)性擴(kuò)增DNA也可用于該致病菌的分型，但是由于這種分型方法的結(jié)果和引物設(shè)計(jì)相關(guān)，因此很難達(dá)到資源共享且重復(fù)性較差[32]。此外，隨著將樣本檢測(cè)結(jié)果和樣品具體采集信息、主成分分析和聚類分析相結(jié)合[33]，嬰兒配方乳粉中克羅諾桿菌的溯源將更準(zhǔn)確。綜上所述，對(duì)我國(guó)嬰幼兒食品中克羅諾桿菌的污染情況和溯源手段進(jìn)行總結(jié)和探討十分必要，這有助于掌握該來源克羅諾桿菌的種群特征，并能夠?yàn)閶雰菏称返陌踩a(chǎn)提供針對(duì)性的指導(dǎo)，以便從生產(chǎn)層面杜絕該致病菌的污染。