朱 航 崔方慶 盧傳禮 陳衛(wèi)衛(wèi) 李旭輝陸思奇 張湘博 趙 華 齊永文

（1長江大學農學院，434025，湖北荊州；2廣東省科學院南繁種業(yè)研究所，510316，廣東廣州；3仲愷農業(yè)工程學院農業(yè)與生物學院，510100，廣東廣州；4廣州國家現代農業(yè)產業(yè)科技創(chuàng)新中心，510520，廣東廣州）

玉米作為主要糧食作物之一，含有對人體有益的核黃素、多種微量元素和維生素A（VA）等化學物質[1]。目前，自然界中已有750余種類胡蘿卜素被研究[2]。近年來，在玉米VA源物質類胡蘿卜素的合成分子機制方面的研究取得了重要進展，鑒定了一些與類胡蘿卜素合成的關鍵QTL位點。開展了lcyE、crtRB、PSY1和crtRB3等類胡蘿卜素合成關鍵基因的多態(tài)性對玉米籽粒中類胡蘿卜素含量的影響，開發(fā)了功能位點的分子標記，為實施利用分子標記加快高VA品種的選育提供了重要的方法[3]。對玉米籽粒中類胡蘿卜素研究鑒定出葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素4種主要的類胡蘿卜素[4-5]。類胡蘿卜素最主要的分離方法有高效液相色譜法[6-8]、超高效液相色譜法[9]、分光光度法[10]、超臨界流體色譜法[11]、拉曼光譜法[12]和液相色譜-串聯質譜法[13]等。類胡蘿卜素是一種對身體有益的健康天然食用色素，以黃色、橙色或紅色表現出來，不僅具有為食品添色的功效，還含有較高的保健價值[14]。因其具有抗氧化和抗衰老等特點，被視為一類抗氧化劑。類胡蘿卜素含有對人體有益的葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素等[15-16]，其中葉黃素和玉米黃質對緩解癌癥和降低心血管疾病等方面具有較好的效果[17]。類胡蘿卜素對人體健康有十分重要的作用，可在食品和醫(yī)藥等行業(yè)大規(guī)模應用[18-19]。

陳潔瓊等[20]對5種鮮食甜、糯玉米籽粒中類胡蘿卜素含量進行分析，發(fā)現不同種類玉米籽粒中的類胡蘿卜素含量差別較大，甜玉米籽粒（39.68mg/kg）比糯玉米（2.10～3.69mg/kg）高出十幾倍。章園等[21]對黃玉米不同時期籽粒類胡蘿卜素含量進行分析，發(fā)現玉米黃質、葉黃素和β-隱黃質含量水平隨著籽粒成熟度的提高總體呈上升態(tài)勢，β-胡蘿卜素含量無明顯變化。嚴華等[22]使用高效液相色譜分析法對沙棘中4種類胡蘿卜素進行檢測，發(fā)現不同品種沙棘中類胡蘿卜素含量具有較大差異。郭艷等[23]采用液相色譜法對甘藍不同顏色花的類胡蘿卜素含量進行檢測，發(fā)現玉米黃質、β-胡蘿卜素和葉黃素等是導致花瓣顏色變化的主要原因。

本試驗用高效液相色譜技術測定不同籽粒顏色玉米自交系葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素4種類胡蘿卜素含量，探究玉米籽粒中類胡蘿卜素含量與籽粒顏色間的關系，為優(yōu)質玉米品種培育提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

依據顏色等級挑選60個自交系組成的自然群體作為試驗材料（表1），所有材料均來自中國農業(yè)大學賴錦盛教授實驗室[24]。試驗材料于2020年下半年種植于廣東省韶關市翁源縣（114°7′48″E，24°21′0″N）。

表1 60份供試材料Table 1 60 tested materials

1.2 儀器與設備

儀器為高效液相色譜儀、6530 Q-TOF精確質量級四極桿-飛行時間質譜儀（atmosphericpressure chemical ionization，APCI）、精宏水浴鍋、真空離心濃縮儀Eppendorf concentrator 5301和掃描儀（ImagescannerⅢ）。試驗用的葉黃素、玉米黃質、β-胡蘿卜素和β-隱黃質的標準品來自美國Sigma公司。甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）和甲醇均為色譜級，環(huán)己烷、乙醇、無水硫酸鈉和氫氧化鉀等均為分析純。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 玉米籽粒顏色鑒定 每個自交系挑選外觀一致的種子約30粒，使用EPSON EU-88掃描設備和EPSON Scan軟件進行圖像數據采集，獲得初始圖片進行提取和計算，得到60份材料籽粒顏色的R（紅色）、G（綠色）、B（藍色）和Gray（灰度）值數據。并將60份玉米自交系籽粒色澤分為4個等級（圖1），等級1為白色，等級2為黃色，等級3為橙黃色，等級4為紫黑色，以此為籽粒顏色的視覺分級表型數據。

圖1 玉米籽粒顏色分級Fig.1 The color grades of maize kernels

1.3.2 玉米中類胡蘿卜素的提取 成熟的玉米籽粒經磨樣機粉碎研磨后，稱量3.0g置于50.0mL離心管中，加入乙醇30mL（含0.1%BHT），密封搖勻，85℃水浴加熱孵育20min，加入80%KOH 0.6mL溶液，水浴60min進行皂化后冰水冷卻，將皂化溶劑放入分液漏斗中，加入環(huán)己烷30.0mL和去離子水15.0mL振蕩搖勻，重復2次。加入無水硫酸鈉5.0g過濾，收集分液漏斗中上層溶液，減壓濃縮至干燥，用乙腈-甲醇（75:25，V/V）溶液溶解，將溶液過0.22μL有機系濾膜后進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定，整個前處理過程注意避光[25]。

1.3.3 高效液相色譜分析 色譜柱：YMC carotenoid（250×4.6mm，5μm）色譜柱；柱溫：30℃；檢測器波長為325和450nm；流動相：A為甲醇-MTBE-水（81:15:4，V/V），B為甲醇-MTBE-水（6:90:4，V/V），進樣20μL；線性梯度洗脫，流速為 1mL/min。洗脫程序：0～12.5min（100%B），12.5～25min（0%B）。DAD檢測器測定波長為450nm。

1.3.4 類胡蘿卜素組分定性定量分析 對于有標樣的部分加以比較，利用保留時間的統(tǒng)一性加以測定，并利用外標定量法建立回歸方程，對玉米類胡蘿卜素各組分含量作出量化分析（表2）。

表2 混合標準液濃度Table 2 Concentration of mixed standard solution mg/kg

1.4 數據處理

利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析及組間差異的Duncan's多重比較，采用SPSS分析變量間的Pearson相關系數進行相關性分析，用GraphPad Prism 5作圖。

2 結果與分析

2.1 玉米類胡蘿卜素含量統(tǒng)計的回歸方程

采用外標定量法進行試樣中各組分峰的定量。配制標準溶液樣品，按上述色譜要求計算標準試樣的相對峰面積，由相對峰面積-進樣量關系，按線性回歸方式得出其中4種主要類胡蘿卜素線性回歸方程、相關系數值與線性范圍，結果見表3。試樣中各組分的含量使用的標準曲線數據，3次重復，取平均值。

表3 4種類胡蘿卜素的線性范圍及相關系數Table 3 Linear range and correlation coefficients of the four carotenoid groups

2.2 不同自交系中類胡蘿卜素含量分布

60份玉米自交系籽粒類胡蘿卜素檢測（表4）表明，玉米籽粒中含有豐富的類胡蘿卜素，且變化范圍在1.49～119.31mg/kg。其中，總類胡蘿卜素含量占比最低的是自交系C1，僅有1.49mg/kg，最高的自交系為C47，可達119.31mg/kg，最高與最低含量之間相差近80倍。60份玉米自交系葉黃素平均含量為56.32mg/kg，其中C27含量最高，達99.98mg/kg，C1含量最低，為0.56mg/kg；玉米黃質平均含量為0.85mg/kg，其中C35含量最高，達2.91mg/kg，C14含量最低，為0.02mg/kg；β-隱黃質平均含量為1.31mg/kg，其中C27含量最高，達2.20mg/kg，C1含量最低，為0.94mg/kg；β-胡蘿卜素平均含量為5.75mg/kg，其中C52號含量最高，達26.61mg/kg，C19含量最低，為0.61mg/kg。

表4 玉米自交系的類胡蘿卜素含量統(tǒng)計分析Table 4 Statistical analysis of carotenoid content of maize inbred lines mg/kg

2.3 不同顏色等級籽粒中類胡蘿卜素的含量

圖2和表5表明，葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素含量在4個籽粒顏色等級中表現出顯著的遺傳多樣性，不同顏色等級間具有較大差別。

圖2 不同籽粒顏色等級中4種類胡蘿卜素含量Fig.2 Carotenoid content of four groups in different seed color grades

玉米自交系中的葉黃素平均含量遠大于玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素的平均含量，其在等級3的含量最高，為71.05mg/kg，依次是等級4和等級2，分別為54.76和50.53mg/kg，含量最低的是等級1，為1.69mg/kg。玉米黃質中等級4的含量最高，為1.35 mg/kg，其次為等級3（1.31mg/kg）和等級2（0.37mg/kg），等級1未檢出。β-隱黃質中等級1、等級2與等級3、等級4間有顯著差異（表5），等級4和等級3中β-隱黃質含量較高，等級1和等級2含量較低，等級4（1.56mg/kg）中β-隱黃質含量大約是等級1（0.94mg/kg）的1.7倍。另外玉米籽粒中β-胡蘿卜素含量較高的是等級4（10.89mg/kg），而在等級1中沒有檢測到β-胡蘿卜素（表4）。

表5 不同顏色等級中葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素的含量分析Table 5 Analysis of lutein,zeaxanthin,β-cryptoxanthin and β-carotene contents in different color grades mg/kg

2.4 R、G、B和Gray值與類胡蘿卜素含量的相關性分析

對60份玉米自交系中R、G、B、Gray值與類胡蘿卜素含量進行相關性分析，如表6所示，R、G、B、Gray值間和類胡蘿卜素之間均具有極顯著正相關性；R、G、B、Gray值與葉黃素、玉米黃素、β-隱黃質、β-胡蘿卜素間具有極顯著負相關性，即類胡蘿卜素含量越高，紅度、綠度、藍度和灰度值越低?？傮w而言，R、G、B和Gray值之間，G與Gray值的正相關性最高，達0.992，其次是R值與Gray和G值，正相關性分別達到0.939和0.912，R與B值正相關性較低，為0.408；類胡蘿卜素含量之間，β-隱黃質和β-胡蘿卜素相關性較高，達0.830，其次是玉米黃質和β-隱黃質，達0.815，而葉黃素與β-胡蘿卜素關聯性較低，為0.343；葉黃素與B值負相關性較高，達-0.619，而葉黃素與R值負相關性則較低，為-0.593。

表6 R、G、B和Gray值與類胡蘿卜素含量間的相關性分析Table 6 Correlation analysis between R,G,B,and Gray values and carotenoid content

2.5 玉米自交系類胡蘿卜素含量的聚類分析

根據類胡蘿卜素含量，采用系統(tǒng)聚類法，用歐式距離可變類平均法對60個品種進行聚類分析，60份玉米自交系按籽粒中類胡蘿卜素含量差異可分為5大類，其中編號C1～C8聚為一類；C9～C34、C36～C46、C48、C49、C52～54、C56、C58和C60聚為一類；C59單獨聚為一類；C50、C51和C57聚為一類；C35、C55和C47聚為一類。

在5個類群中，第5類的葉黃素、玉米黃質和β-隱黃質含量都是最高的，屬于高VA的自交系，第1類葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素的含量都最低，β-隱黃質和玉米黃質含量在5個類群中的平均值較低。第2類包含了多個自交系，屬于中富含類胡蘿卜素的自交系（表7）。

表7 不同類群間類胡蘿卜素含量的分析Table 7 Analysis between carotenoid contents among different groups

3 討論

篩選高含量類胡蘿卜素玉米是十分關鍵的，但這需要一種快速、準確、操作簡便的分析測定方法。與其他檢測方法相比，高效液相色譜法具有高效性、精確性和顯著性等優(yōu)勢，已成為化學分析中主要分離方法[26]。本試驗采用高效液相色譜法測定玉米類胡蘿卜素中的葉黃素、玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素的濃度，結果發(fā)現玉米籽粒中類胡蘿卜素各組分間含量差異顯著，與Baseggio等[27]和周毅等[28]研究結果一致。Hwang等[29]采用紫外分光光度計法檢測白色和橙色玉米類胡蘿卜素含量，結果表明類胡蘿卜素的組成及其濃度是影響籽粒色澤的主要原因。Hu等[30]通過高效液相色譜法測定不同玉米籽粒顏色，結果表明，黃色、橙黃色和黑色玉米中有相對高含量的類胡蘿卜素，而白色玉米最低。類胡蘿卜素組成成分分析表明，葉黃素被確定是玉米中主要的類胡蘿卜素，并且紫黑色玉米類胡蘿卜素含量總體最高，這與Hu等[31]和O'Hare等[32]的研究結果類似。本試驗以60份玉米自交系為材料，運用高效液相色譜技術對各種玉米自交系的類胡蘿卜素組成成分進行分析測定，探究玉米籽粒顏色與類胡蘿卜素含量的關系，結果顯示，類胡蘿卜素含量占比最高的是葉黃素、β-胡蘿卜素和玉米黃質，其次是β-隱黃質。同時發(fā)現類胡蘿卜素各組分間含量差異影響籽粒顏色。

4 結論

采用高效液相色譜檢測法，對60份玉米自交系籽粒中類胡蘿卜素含量進行測定，結果顯示各自交系中葉黃素含量最高，是類胡蘿卜素的主要成分，其次是β-胡蘿卜素、玉米黃質和β-隱黃質。其中，4種類胡蘿卜素含量間均有顯著性差異，玉米黃質、β-隱黃質和β-胡蘿卜素含量隨著籽粒顏色等級的增加而增加，葉黃素含量呈先增加后降低的變化趨勢。籽粒中類胡蘿卜素含量與籽粒顏色相關指標相關性分析顯示，4種主要類胡蘿卜素含量與R、G、B、Gray值均呈極顯著負相關，而4種主要類胡蘿卜素組分間呈極顯著正相關，R、G、B和Gray值間也呈極顯著正相關。本研究結果表明，隨著顏色等級的增長，類胡蘿卜素含量也隨之增長，且在等級3時達最高，其次是等級4，因此籽粒顏色可用作判斷總類胡蘿卜素含量的依據，可為培育高富集營養(yǎng)玉米品種提供直觀有效的方法。