段夢冉 劉豐澤 葛建镕 易紅梅 楊洪明高玉倩 岳鵬武 馬文宇 班秀麗2, 王鳳格

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究所玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室，100097，北京；2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，130118，吉林長春；3全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，100125，北京；4吉林省種子管理總站，130022，吉林長春）

玉米作為擁有糧食、飼料和工業(yè)原料三重屬性的糧食作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)著不可替代的位置。玉米產(chǎn)量占全國糧食產(chǎn)量近40%。吉林省是我國主要的商品糧產(chǎn)區(qū)之一[1]。位于世界三大黃金玉米帶之一的吉林黃金玉米帶2020年玉米產(chǎn)量達2973.44萬t，占吉林省糧食總產(chǎn)量的78.2%[2]，占全國玉米產(chǎn)量的11.4%[3]。種子純度作為評價種子質(zhì)量的一項重要指標，與玉米產(chǎn)量有著密不可分的關(guān)系[4]，生物混雜或機械混雜會導(dǎo)致玉米種子不純，因此加強對吉林省玉米種子質(zhì)量控制，特別是準確鑒定玉米種子純度對全省玉米產(chǎn)量至關(guān)重要，隨著玉米新品種的逐年增多，對于玉米種子純度鑒定也提出了更高的要求。

玉米種子純度鑒定的主要方法有田間鑒定法[5]和鹽溶蛋白鑒定法[6]，田間鑒定法耗時耗力，易受環(huán)境影響；鹽溶蛋白鑒定法對于親緣關(guān)系較近的品種鑒定困難。近20年來，SSR分子標記技術(shù)以其多態(tài)性好、靈敏度高、操作簡便、用時短及準確率高等優(yōu)點在品種純度、真實性鑒定以及品種權(quán)保護等方面得到廣泛應(yīng)用。已制訂了玉米品種真實性和純度SSR分子標記檢測標準[7]，趙久然等[8]利用40對核心引物構(gòu)建中國玉米品種標準樣品的SSR指紋庫，李銳等[9]以224份山西玉米自交系構(gòu)建了68份核心種質(zhì)，楊揚等[10]對308個糯玉米品種從審定年份和適宜種植區(qū)角度分析了遺傳多樣性特點和發(fā)展趨勢。SSR分子標記技術(shù)還可用于玉米抗病和抗蟲種苗的選育[11]。此外，SSR分子標記技術(shù)在小麥[12]、水稻[13]和高粱[14]等種子的真實性和純度鑒定、新品種輔助育種和遺傳多樣性分析等方面也發(fā)揮著不可替代的作用。

本試驗以吉林省主推的50個玉米品種為材料，通過SSR分子標記法利用40對引物進行擴增，結(jié)合每對引物的遺傳穩(wěn)定性、多態(tài)性以及樣品區(qū)分能力等進行篩選，最終獲得一組適用于吉林省主推玉米品種種子純度鑒定多重擴增及多重電泳的引物，為吉林省主推玉米品種種子純度鑒定提供了一套科學(xué)高效的方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

依據(jù)全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心統(tǒng)計的2020年度農(nóng)作物品種推廣情況，選擇在吉林省種植推廣面積排名前50的主推玉米品種，該50個品種種植面積占吉林省玉米種植面積的61.73%（表1）。樣品種子來源于吉林省種子市場。

表1 50份樣品信息Table 1 The informations of 50 samples ×104hm2

1.2 試驗方法

1.2.1 小區(qū)田間種植 為驗證SSR分子標記鑒定法與田間鑒定法結(jié)果的一致性，使2種方法所用材料一一對應(yīng)，將試驗材料于吉林省長春市公主嶺市陶家屯鎮(zhèn)種植基地單粒點播種植，每行播種50粒，每個品種播種100粒，待植株所有性狀都表現(xiàn)出來后進行田間鑒定并取樣，從距葉尖30cm處取單株葉片，對每個品種的100個單株逐個取樣，取樣完成后分別包裝保存。

1.2.2 DNA提取 取適量葉片，剪碎于1.2mL的離心管中，加入鋼珠后將管放入96孔深孔板中，采用磁珠法提取DNA[15]，用紫外分光光度計（Nanodrop 2000）檢測DNA濃度，將DNA稀釋到約100ng/μL，采用瓊脂糖凝膠電泳法對DNA進行質(zhì)量檢測。

1.2.3 引物 選擇GB/T 39914-2021中公布的40對引物，采用PET、NED、VIC和FAM 4種熒光染料，標記每對引物中的其中一條的5′端，由Applied Biosystems公司（美國）合成引物。

1.2.4 PCR擴增 PCR體系20.00μL：模板DNA 2.00μL，2×TaqPlus Master Mix（近岸蛋白質(zhì)科技有限公司）10.00μL，ddH2O 7.75μL，引物0.25μL。多重擴增時根據(jù)該體系中增加的引物量相應(yīng)減少ddH2O的量，PCR擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延伸45s，35次循環(huán)；72℃延伸10min，擴增產(chǎn)物放于4℃保存。

1.2.5 電泳檢測 利用ABI 3730XL DNA分析儀進行熒光毛細管電泳，對擴增產(chǎn)物進行檢測，根據(jù)SSR分子標記擴增片段大小及引物上標記熒光顏色的不同，選擇10重引物組合進行電泳，根據(jù)不同的Panel組合，將同組的擴增產(chǎn)物等體積混合，震蕩混勻。將2.0μL混合樣品和10.0μL含有1%GS3730-500分子量內(nèi)標的去離子甲酰胺加入到DNA分析儀專用96孔電泳板中，在PCR擴增儀上95℃變性5min，4℃保存10min，離心30s后，于ABI 3730XL DNA分析儀上進行熒光毛細管電泳。15kV預(yù)電泳2min，15kV電泳30min。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 利用ABI3730XL DNA分析儀上自帶的Date Collection V1.0軟件收集電泳原始數(shù)據(jù)，形成FSA文件，將FSA文件上傳到SSR指紋分析器SSR Analyser[16]，經(jīng)分析后上傳到SSR指紋數(shù)據(jù)庫中，對樣品指紋圖譜進行分析。采用Power-Marker ver 3.25統(tǒng)計SSR引物位點的等位基因頻率、基因型數(shù)、等位基因數(shù)、基因多樣性、雜合度及多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）值等，采用WPS Office進行樣品雜合位點數(shù)分布圖的繪制及鑒別力（DP值）的計算，用IBM SPSS Statistics 23統(tǒng)計相關(guān)性及顯著性系數(shù)。

1.2.7 多重擴增體系優(yōu)化 根據(jù)各引物在多重擴增體系中的表現(xiàn)，利用IBM SPSS Statistics 23設(shè)計多因素多水平的正交試驗方案，將2×TaqPlus Master Mix及引物的用量設(shè)置為考察因素，參照原體系中2×TaqPlus Master Mix量及引物量，針對每個考察因素分別設(shè)置4個水平，根據(jù)試驗結(jié)果找出每個因素的最佳水平，然后進行驗證試驗，確定9重擴增體系的最佳組合。為驗證該多重擴增體系可用于吉林省主推玉米品種的純度鑒定，隨機選擇6個品種（編號為D1、D2、D3、D4、D5和D6）各100個單株進行鑒定，并將鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取濃度及質(zhì)量檢測

所有樣品 DNA 濃度均在 300～700ng/μL，OD260/280值在1.8～2.0，提取的DNA質(zhì)量較高，達到了試驗要求。

2.2 純度鑒定引物的篩選

根據(jù)40對引物的毛細管電泳結(jié)果，通過對各位點雜合度、遺傳穩(wěn)定狀況、染色體位置、多重擴增及多重電泳潛力等的評估，篩選出一套適用于吉林省主推玉米品種種子純度鑒定的核心引物。

2.2.1 試驗材料SSR標記指紋圖譜庫的構(gòu)建 用40對引物對50個玉米品種進行單重引物擴增，將擴增產(chǎn)物混合成4組，每組包含10對引物，進行多重電泳檢測。依據(jù)電泳結(jié)果對40對引物的多態(tài)性進行分析，結(jié)果（表2）顯示，40對引物多態(tài)性較高，40個位點的總基因型數(shù)為414，變化范圍在4～24，平均值為10.35；總等位基因數(shù)為276，變化范圍在3～15，平均值為6.9；等位基因頻率在0.34～0.88，平均值為0.54；基因多樣性變化范圍在0.22～0.78，平均值為0.59；雜合度在10%～96%，平均雜合度為68.1%，最低的是P02位點，雜合度為10%，最高的是P03、P05和P10位點，雜合度為96%。PIC值為0.21～0.76，平均PIC值為0.55，最低的是P07位點，為0.21，最高的是P22位點，為0.76。

表2 50個吉林省主推玉米品種SSR引物多態(tài)性分析Table 2 SSR primer polymorphism analysis of 50 main maize varieties in Jilin province

續(xù)表2 Table 2(continued)

2.2.2 核心引物篩選 依據(jù)50份樣品在40對SSR基礎(chǔ)引物的指紋數(shù)據(jù)及引物多態(tài)性信息，選擇雜合度高于80%的引物進入核心引物的候選名單，進一步優(yōu)選出 P03、P05、P08、P10、P11、P13、P14、P17、P23、P25、P30、P31、P33、P35 和 P37，共15對引物。

根據(jù)引物的片段大小、標記的熒光顏色及在染色體上的位置，篩選出P03、P05、P08、P10、P11、P17、P25、P31和P37共9對引物為吉林省主推玉米品種純度鑒定的核心引物。這9對核心引物雜合度在82%～100%，平均雜合度為91.5%，PIC值在0.44～0.75，平均PIC值為0.63，相比于基礎(chǔ)引物均有所提高。平均DP值為0.73，最高為0.81，最低為0.52，在0.50～0.60的引物有1對，在0.60～0.70的引物有2對，在0.70以上的引物有6對。在50份樣品中，有9個雜合位點的樣品量最多，占樣品總數(shù)的56%，雜合位點在5個及以上的占樣品總數(shù)的100%，雜合位點在6個及以上的占樣品總數(shù)的98%（圖1）。

圖1 SSR引物組合在50份樣品中雜合位點的分布Fig.1 Distribution of heterozygous loci of SSR primer combinations in 50 samples

利用SSR標記法進行純度鑒定時主要依靠雙親互補位點，在雙親信息缺失而無法判斷雙親互補位點的情況下，品種的雜合度是判斷某組引物能否用于該品種純度鑒定的重要標準，50份樣品在40對引物中的雜合度在55.00%～85.00%，平均雜合度為68.55%，在GB/T 39914-2021《主要農(nóng)作物品種真實性和純度SSR分子標記檢測 玉米》中推薦的8對引物中雜合度在50.00%～87.50%，平均雜合度為75.75%，而在9對引物中的雜合度為56.00%～100.00%，平均雜合度為91.56%，高于在40對基礎(chǔ)引物及行業(yè)標準提供的8對引物中的雜合度，更適用于吉林省主推玉米品種的純度鑒定（圖2）。

圖2 50份樣品分別在8對、9對及40對引物中的雜合度Fig.2 The heterozygosities of 50 samples in eight pairs,nine pairs and 40 pairs of primers,respectively

2.3 核心引物多重擴增體系的構(gòu)建

將篩選出的9對引物組成2重、4重、6重、8重及9重擴增體系，隨機從50份樣品中選擇6個品種進行多重擴增體系的構(gòu)建（圖3），多重體系的擴增效果大都表現(xiàn)良好，無異常擴增，但由于存在競爭關(guān)系，多重擴增體系部分引物間的電泳圖譜峰高差距較大，且隨著多重體系的增加差距逐漸增大，從9重體系擴增結(jié)果來看，引物P03、P05、P08及P31的峰值整體低于其他引物，主要基因型峰值在2000～4000，推測可能由于擴增效率較低導(dǎo)致；P37的峰值遠高于其他引物，超過22 000；其余引物的主要基因型峰值在4000～9000，引物間峰值差異較大，會影響軟件數(shù)據(jù)自動化采集，導(dǎo)致最終的純度鑒定結(jié)果出現(xiàn)誤差。

圖3 各多重組合電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of multiple combinations

2.4 核心引物多重擴增體系的優(yōu)化

針對9對引物的表現(xiàn)，對核心引物多重擴增體系進行優(yōu)化，以2×TaqPlus Master Mix量（A）、峰值較低的引物（B）、峰值一般的引物（C）和峰值較高的引物（D）為考察因素，每個因素各4個水平（表3），利用IBM SPSS Statistics 23軟件設(shè)計L16(44)正交試驗（表4），對各組試驗結(jié)果比較，分析每個因素下各水平組電泳結(jié)果，選擇每個因素下引物峰高表現(xiàn)最佳的水平，確定核心引物多重擴增的最佳體系組合為2×TaqPlus Master Mix 14.00μL，P03、P05、P08 和 P31 各 0.45μL，P10、P11、P17和 P25各 0.15μL，P37 0.10μL。

表3 正交試驗設(shè)計因素水平Table 3 Factor level of orthogonal experimental design μL

表4 L16(44)正交試驗表Table 4 L16(44)orthogonal experiment table μL

用確定的最佳擴增體系組合進行驗證試驗，電泳結(jié)果如圖4所示，9對引物的主要基因型峰值在3000～9000，經(jīng)過優(yōu)化后的體系各引物間峰值差異過大的情況得到明顯改善。

圖4 優(yōu)化擴增體系后電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis results after optimizing amplification system

2.5 試驗材料種子純度鑒定的引物推薦

依據(jù)篩選出的9對引物在樣品中的擴增效果及是否為雜合位點，針對50個吉林省主推玉米品種選出4對候選引物和2對優(yōu)選引物用于品種種子純度檢測（表5）。當只需鑒定品種種子的自交苗時，選擇2對優(yōu)選引物進行鑒定，當還需鑒定品種種子中的異交種及混雜株時，選擇4對候選引物可滿足鑒定需求。

表5 50個吉林省主推玉米品種種子的純度鑒定引物推薦Table 5 Seed purity identification and primer recommendation of 50 main maize varieties in Jilin province

續(xù)表5 Table 5(continued)

2.6 核心引物的純度鑒定結(jié)果分析

用篩選出的核心引物檢測隨機選擇的6個品種，每個品種各檢測100個單株，將SSR分子標記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果進行比較（表6），田間鑒定檢測出6份樣品平均自交苗、異型株和純度值比例分別為1.67%、1.17%和97.17%，SSR分子標記技術(shù)分別為1.67%、1.16%和97.17%。經(jīng)t檢驗相關(guān)性分析，2種方法檢測的純度相關(guān)性系數(shù)為0.766，相關(guān)性較高，差異不顯著。針對田間鑒定與SSR分子標記鑒定存在的差異，推測由于田間鑒定時植株受到環(huán)境條件的影響，導(dǎo)致個別植株性狀表現(xiàn)不完全或表現(xiàn)異常，此外還受檢驗員的經(jīng)驗影響，導(dǎo)致可能出現(xiàn)將異型株誤判為小苗、將正常株誤判為異型株的情況。

表6 6份樣品純度鑒定結(jié)果Table 6 Purity identification results of six samples %

3 討論

種子純度的高低關(guān)系到糧食的產(chǎn)量，GB 4404.1-2008《糧食作物種子 第1部分：禾谷類》規(guī)定，玉米種子純度指標不低于96.0%。影響純度指標的因素主要有在玉米制種過程中出現(xiàn)的自交、異交及混雜株等，種子收獲后要進行品種純度鑒定檢測。目前純度鑒定檢測方法有田間種植鑒定法、鹽溶蛋白電泳鑒定法和SSR分子標記鑒定法。田間種植鑒定需要一個玉米生育周期，鑒定時間長。目前采取的田間種植鑒定法一是冬天在海南種植鑒定，但成本高，二是本地同期種植鑒定，但結(jié)果滯后。鹽溶蛋白電泳鑒定法和SSR分子標記鑒定法是實驗室快速檢測純度的方法，不受生長季節(jié)的限制，在實驗室1d就可完成檢測。鹽溶蛋白電泳鑒定法采用從種子中提取的鹽溶蛋白在聚丙烯酰胺凝膠的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電流分離的電荷效應(yīng)作用下進行分離，通過染色顯示蛋白質(zhì)譜帶類型，不同玉米品種由于遺傳組成的不同，種子內(nèi)所含的蛋白質(zhì)種類有差異，這種差異可利用電泳圖譜加以鑒別，從而對種子品種純度進行鑒定，但該方法對親緣關(guān)系較近的品種無法鑒定。SSR分子標記鑒定法能準確鑒定出品種的差異，結(jié)果一致性高，且本試驗使用熒光毛細管電泳平臺，通過SSR指紋分析專用軟件SSR Analyser[17]分析數(shù)據(jù)，比較峰值圖差異，以此來對品種純度進行鑒定，該平臺用時短且分辨率高[18]，區(qū)分能力強，對于一些親緣關(guān)系相近的品種也可準確將其區(qū)分開來。本試驗建立的純度鑒定體系中，利用熒光毛細管電泳平臺，只需經(jīng)過1次擴增1次電泳即可完成純度鑒定，大大縮短了鑒定時長。對于SSR分子檢測而言，篩選合適的引物進行純度鑒定是至關(guān)重要的一步，品種不同，用于純度鑒定的引物也有所不同，相同品種，選擇不同的引物也可能會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)差異[19]，而本試驗所建立的吉林省主推玉米品種純度鑒定體系避免了因所篩選引物不同而導(dǎo)致純度鑒定結(jié)果出現(xiàn)差異的情況。

目前，種子純度鑒定的需求主要有企業(yè)自控以及政府外控。對于企業(yè)而言，需要在生產(chǎn)過程中及收貨后銷售前控制品種純度，檢測的品種背景清晰，檢測重點在于自交苗，因此，選擇本文中推薦的2對優(yōu)選引物進行鑒定可滿足一般需要，也可降低檢測成本，如還需鑒定種子中的異交種及混雜株，選擇4對候選引物可滿足鑒定需求。在玉米品種純度的政府外控監(jiān)督抽查時，面對品種數(shù)量多、樣品數(shù)量大且制種過程不清楚，則需要選擇更多的標記以保證鑒定結(jié)果的準確性，本試驗篩選出的9對引物對于吉林省主推的50個玉米品種至少有5個位點為雜合，可將自交苗及主要異型株辨別出來，建立的玉米品種純度鑒定體系節(jié)約了篩選引物以及單重擴增的時間和成本，提高了檢測效率。相比于純度鑒定標準中推薦的8對引物，本試驗篩選出的9對引物著眼于吉林省主推玉米品種，更高程度地滿足了吉林省玉米品種種子純度檢測的需要，為質(zhì)量監(jiān)管部門打擊假劣種子、保護品種權(quán)利提供技術(shù)支撐，為農(nóng)業(yè)糧食安全提供保障，也為構(gòu)建其他地區(qū)玉米純度鑒定體系提供參考。

4 結(jié)論

基于SSR分子標記檢測技術(shù)，針對吉林省主推的50個玉米品種，從40對引物中篩選出9對雜合度和多態(tài)性較高的引物用于純度鑒定，分別為P03、P05、P08、P10、P11、P17、P25、P31 和 P37，并優(yōu)化為9重擴增體系，體系中2×TaqPlus Master Mix 14.00μL，P03、P05、P08 和 P31 各 0.45μL，P10、P11、P17和 P25各0.15μL，P37為 0.10μL。建立的純度鑒定多重擴增體系可用于吉林省主推玉米品種的純度鑒定，針對不同的應(yīng)用場景，為兼顧檢測效率和成本，可從本試驗所篩選出的9對引物中靈活選擇純度鑒定引物，為其他作物建立通用的高效純度鑒定方案提供參考。