郝佳旭，楊麗娟，范 曉，查麗春，崔利利，程炳鐸，李元增，馬云淑*

復(fù)方蜘蛛香揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的建立及多組分定量分析

郝佳旭1, 2，楊麗娟1, 2，范 曉1, 2，查麗春1, 2，崔利利3，程炳鐸1, 2，李元增1, 2，馬云淑1, 2*

1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院暨云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500 2. 云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點實驗室，云南 昆明 650500 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

建立復(fù)方蜘蛛香揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜及其10個指標(biāo)成分的定量分析方法，為其質(zhì)量控制及評價提供參考。提取15批復(fù)方蜘蛛香揮發(fā)油，采用GC-MS技術(shù)建立指紋圖譜，使用中南大學(xué)“中藥指紋圖譜計算軟件”計算相似度，并對共有峰進(jìn)行歸屬。采用聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對指紋圖譜進(jìn)行評價。利用GC法測定揮發(fā)油中10個指標(biāo)成分的含量。15批揮發(fā)油得量在4.4～6.8 mL；GC-MS指紋圖譜有31個共有峰，其中峰1、11歸屬于蜘蛛香揮發(fā)油；峰31歸屬于木香揮發(fā)油；峰6～9、15、21歸屬于草果揮發(fā)油；峰2～5、10、18為蜘蛛香、草果揮發(fā)油共有；峰23、25、27、29、30為蜘蛛香、木香揮發(fā)油共有；峰12～14、16、17、19、20、22、24、26、28為蜘蛛香、木香、草果3者揮發(fā)油共有；15批樣品指紋圖譜與中位數(shù)法生成的指紋圖譜共有模式的相似度在0.798～0.998；聚類分析可以將樣品分為2類，其中S1、S2、S5、S6、S11、S14、S15為第1類；S3、S4、S7～S10、S12、S13為第2類；PCA及OPLS-DA可將樣品分為4類，其中S1、S2、S5、S6為第1類，S3、S4、S7～S9為第2類，S10、S12、S13為第3類，S11、S14、S15為第4類。異戊酸（峰1）、α-蒎烯（峰2）、β-蒎烯（峰3）、1,8-桉葉素（峰7）、α-松油醇（峰13）、香葉醇（峰15）、β-欖香烯（峰23）、β-丁香烯（峰25）、反式-橙花叔醇（峰28）、石竹素（峰29）的質(zhì)量濃度在19.49～43.24、2.90～13.15、7.47～17.19、182.94～248.19、12.83～20.48、21.82～57.63、1.54～2.83、3.07～6.50、12.06～19.02、2.94～5.43 mg/mL。建立的復(fù)方蜘蛛香揮發(fā)油指紋圖譜及定量分析方法分離度好、準(zhǔn)確性高，可為復(fù)方蜘蛛香揮發(fā)油質(zhì)量控制及評價提供參考。

復(fù)方蜘蛛香；揮發(fā)油；GC-MS；指紋圖譜；定量分析；質(zhì)量控制；聚類分析；主成分分析；正交偏最小二乘法-判別分析；蜘蛛香；木香；草果；異戊酸；α-蒎烯；β-蒎烯；1,8-桉葉素；α-松油醇；香葉醇；β-欖香烯；β-丁香烯；反式-橙花叔醇；石竹素

復(fù)方蜘蛛香（Compound Zhizhuxiang，CZ）源于中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)“香果健消片”［蜘蛛香（炒焦）250 g、草果（去殼、炒焦）100 g、木香（炒）70 g、糯米80 g］，去除糯米而成。方中蜘蛛香辛溫散寒，有消食健胃、理氣止痛的作用，為君藥；木香、草果行氣止痛、燥濕溫中、消食導(dǎo)滯，共為臣藥。全方以調(diào)暢氣機(jī)、疏通經(jīng)脈為治則，善治消化不良、氣脹飽悶、食積腹痛、胸滿腹脹。方中蜘蛛香、木香、草果3藥均含有揮發(fā)油類成分，且3藥揮發(fā)油類成分均具有一定的藥理活性。蜘蛛香揮發(fā)油中主要含有萜類、酯類、有機(jī)酸類等化合物[1]，且研究顯示其對脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化具有抑制作用[2]，可以通過增加腦組織中5-羥色胺、去甲腎上腺素、多巴胺的含量改善抑郁癥狀[3]，對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力[4]。木香揮發(fā)油對多種細(xì)菌均有一定的抑菌作用[5]，且對二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集有著顯著的抑制作用[6]。草果揮發(fā)油對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用[7]，還有具有一定的抗癌[8-9]、抗感染[10]、抗氧 化[11]等藥理活性。

目前，對CZ揮發(fā)油成分的研究較為缺乏，尚未見有關(guān)報道，僅有本課題組對香果健消片揮發(fā)油的包合工藝進(jìn)行了研究[12]。課題組后續(xù)擬將CZ制為透皮貼劑，使用CZ揮發(fā)油作為促滲劑的同時，同時發(fā)揮一定的藥效作用，以期起到“雙效合一”的作用。故本研究擬通過GC-MS技術(shù)建立CZ揮發(fā)油指紋圖譜，結(jié)合聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）及正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）[13]對指紋圖譜進(jìn)行綜合評價，并進(jìn)行多指標(biāo)成分定量分析，以期為其質(zhì)量控制及評價提供參考，保證后續(xù)制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 7890a-5975c型氣質(zhì)聯(lián)用儀、Aglient 7820A型氣相色譜儀，美國Agilent公司；EX125ZH型分析天平，奧豪斯儀器有限公司。

1.2 材料

藥材樣品信息及組合見表1。所有批次藥材經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張潔副教授鑒定，蜘蛛香為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香Jones的干燥根莖和根、木香為菊科云木香屬植物木香Decne.的干燥根、草果為姜科砂仁屬植物草果Crevost et Lemaire的干燥成熟果實。

表1 樣品信息

對照品反式-橙花叔醇（批號M27N11LB0158，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.5%）、異戊酸（批號B24108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；α-蒎烯（批號110897-201803，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、β-蒎烯（批號111827-201202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、α-松油醇（批號111859-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.0%）、1,8-桉葉素（批號1110788-202108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）、香葉醇（批號111643-200602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.0%）、β-丁香烯（批號11819-202104，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.5%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品石竹素（批號DS021001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.3%）、β-欖香烯（批號DL026701，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.0%）購自森嵐科技有限公司；無水乙醇（批號20211001321）、無水硫酸鈉（批號2021062079），分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的配制 精密吸取0.1 mL CZ揮發(fā)油，加入無水乙醇稀釋至5 mL，搖勻，取適量溶液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.2 陰性供試品溶液的配制 按照“2.1”項下方法，同法分別提取S15樣品產(chǎn)地缺蜘蛛香、木香、草果的陰性揮發(fā)油及單味藥材揮發(fā)油。按照“2.2.1”項下方法制備陰性供試品溶液。

2.3 GC-MS指紋圖譜條件及方法學(xué)考察

2.3.1 GC-MS條件

（1）GC條件：J&W 122-5532石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），柱溫40 ℃（保持1 min），以5 ℃/min的速率升溫至180 ℃（保持2 min），以8 ℃/min的速率升溫至250 ℃（保持5 min），進(jìn)樣口溫度230 ℃，載氣為氦氣，柱體積流量1 mL/min；分流比40∶1，進(jìn)樣量1 μL，溶劑延遲4 min。

（2）質(zhì)譜條件：電離方式EI，離子源230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，輔助加熱290 ℃，掃描質(zhì)量范圍/50～600，質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫：NIST 11。

2.3.2 精密度試驗 取S1號樣品，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下GC-MS條件連續(xù)進(jìn)樣6針，以7號峰（1,8-桉葉素）為參照峰，計算各個共有峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD在0.02%～0.06%，相對峰面積的RSD在0.19%～4.64%，表明儀器精密度良好。

中老年人的身體骨骼已經(jīng)相對成熟，肌肉靈活度和柔韌性較差，因而肌肉拉傷、關(guān)節(jié)受傷等現(xiàn)象時常發(fā)生。這就要求中老年舞蹈培訓(xùn)與輔導(dǎo)的過程中，舞蹈動作難度要適宜，動作幅度和強(qiáng)度不能太大，否則只會加劇中老年人的身體負(fù)擔(dān)。舞蹈動作難度過大，一方面會誘使不安全因素的發(fā)生，增加舞蹈的危險系數(shù)；另一方面，會增加舞蹈的難度，不利于舞蹈動作的完成，弱化舞蹈的連貫性和整體性美感。而且，開展舞蹈培訓(xùn)與輔導(dǎo)活動之前，中老年人必須進(jìn)行基本的準(zhǔn)備工作，喚醒身體機(jī)能，提高身體的靈活性和敏感度，降低意外情況的發(fā)生概率。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取S1號樣品6份，按照“2.2.1”項下方法制備6份供試品溶液，按照“2.3.1”項下GC-MS條件進(jìn)樣，以7號峰（1,8-桉葉素）為參照峰，計算各個共有峰相對保留時間及相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD在0.03%～0.14%，相對峰面積的RSD在0.49%～4.89%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取S1號樣品，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.3.1”項下GC-MS條件，分別于制備后0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析，以7號峰（1,8-桉葉素）為參照峰，計算各個共有峰相對保留時間及相對峰留面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD在0.03%～0.09%，相對峰面積的RSD在0.29%～4.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 GC-MS指紋圖譜的建立及評價

2.4.1 指紋圖譜的建立 將15批CZ揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜導(dǎo)入中南大學(xué)“中藥指紋圖譜計算軟件”，設(shè)定時間窗寬為0.1 min，多點校正后以樣品S15色譜圖為參照，建立指紋圖譜共有模式，結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，15批CZ揮發(fā)油樣品指紋圖譜共標(biāo)定了31個共有峰，經(jīng)與質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫NIST 11比對及文獻(xiàn)檢索[1,5,7,14-16]，對31個共有峰進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2；以中位數(shù)法生成的對照指紋圖譜為基準(zhǔn)計算相似度，15批CZ揮發(fā)油指紋圖譜與中位數(shù)圖譜的相似度分別為0.879、0.912、0.995、0.991、0.912、0.914、0.994、0.996、0.998、0.994、0.882、0.997、0.995、0.829、0.798。

圖1 15批CZ揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜

2.4.2 色譜峰歸屬 將樣品S15的色譜圖與各陰性樣品色譜圖比較，可知峰1、11歸屬于蜘蛛香揮發(fā)油；峰31歸屬于木香揮發(fā)油；峰6～9、15、21歸屬于草果揮發(fā)油；峰2～5、10、18為蜘蛛香、草果揮發(fā)油共有；峰23、25、27、29、30為蜘蛛香、木香揮發(fā)油共有；峰12～14、16、17、19、20、22、24、26、28為蜘蛛香、木香、草果3者揮發(fā)油共有（圖2）。

2.4.3 聚類分析 為進(jìn)一步揭示15批CZ揮發(fā)油的差異性，使用SPSS 21軟件，以15批樣品的31個共有峰峰面積為變量，采用組間連接法，以平方歐氏距離為測量區(qū)間對15批樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)分類距離為10時，樣品可以分為2類，其中S1、S2、S5、S6、S11、S14、S15為第1類；S3、S4、S7～S10、S12、S13為第2類。其中，第1類除S11外，所有草果產(chǎn)地均為云南文山；而第2類草果產(chǎn)地主要為云南德宏及云南紅河。該結(jié)果與相似度結(jié)果相互印證，表明不同批次的CZ揮發(fā)油之間差異較大，可能對其質(zhì)量控制及藥理作用產(chǎn)生一定影響，而聚類分析結(jié)果表明，CZ揮發(fā)油質(zhì)量差異可能主要與草果產(chǎn)地有關(guān)。

2.4.4 PCA 將15批CZ揮發(fā)油樣品的31個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立PCA模型，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，PCA模型解釋率參數(shù)2為0.701，2為0.529，均大于0.5，表示建立的模型穩(wěn)定、可靠；15批樣品可以分為4類，其中S1、S2、S5、S6為第1類，S3、S4、S7～S9為第2類，S10、S12、S13為第3類，S11、S14、S15為第4類。第1類草果產(chǎn)地均為云南文山；第2類木香產(chǎn)地主要為云南大理；第3、4類蜘蛛香產(chǎn)地均為云南大理，提示3味藥材的產(chǎn)地均會對CZ揮發(fā)油質(zhì)量差異產(chǎn)生一定的影響。PCA結(jié)果與聚類分析整體相似，但將樣品分為4類，存在一定差距，可能是由于PCA時提取出的主成分僅能代表大部分樣品信息，卻不能代表全部樣品信息所致。

表2 15批CZ揮發(fā)油31個共有峰鑒定結(jié)果

a-S15揮發(fā)油 b-蜘蛛香揮發(fā)油 c-木香揮發(fā)油 d-草果揮發(fā)油 e-缺蜘蛛香揮發(fā)油 f-缺木香揮發(fā)油 g-缺草果揮發(fā)油

圖3 15批CZ揮發(fā)油聚類分析結(jié)果

圖4 15批CZ揮發(fā)油PCA得分

2.4.5 OPLS-DA 將15批揮發(fā)油樣品的31個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立OPLS-DA模型，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，模型解釋參數(shù)22分別為0.701、0.649，2為0.525，均大于0.5，表明建立的模型穩(wěn)定可靠；15批樣品可以分為4類，其中S1、S2、S5、S6為第1類，S3、S4、S7～S9為第2類，S10、S12、S13為第3類，S11、S14、S15為第4類。以變量投影重要性值（VIP）＞1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出18個共有峰，結(jié)果見圖6。VIP值由大到小依次排序為6、28、8、2、4、20、3、19、16、9、24、14、22、5、26、15、10、17號峰，而上述18個共有峰分別來源于CZ中3味藥材的揮發(fā)油，表明蜘蛛香、木香、草果均對CZ揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜具有一定影響。

圖5 15批CZ揮發(fā)油OPLS-DA得分

圖6 CZ揮發(fā)油OPLS-DA的VIP值

2.5 多組分定量分析

2.5.1 色譜條件 毛細(xì)管柱Agilent 19091J-413 HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm），F(xiàn)ID檢測器；進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測器溫度250 ℃，柱溫以40 ℃為起始溫度，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持1 min，分流比40∶1，體積流量1.5 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

2.5.2 混合對照品溶液的配制 精密稱取異戊酸、α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、β-欖香烯、β-丁香烯、反式-橙花叔醇、石竹素對照品適量，溶于無水乙醇，搖勻，使之成為質(zhì)量濃度分別為1.06、0.40、0.42、7.92、0.54、1.45、0.11、0.21、0.46、0.16 mg/mL的混合對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的配制 同“2.2.1”項下方法。

2.5.4 專屬性考察 取無水乙醇、混合對照品溶液、供試品溶液，按照“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果顯示，各色譜峰峰形良好、分離度均大于1.5，結(jié)果見圖7。

2.5.5 線性關(guān)系考察 取“2.5.2”項中的混合對照品溶液1.67、3.33、6.67、8.33、10.00 mL置于10 mL量瓶中，加入適量無水乙醇，定容，搖勻，分別按照“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為異戊酸＝215.514 9－1.795 4，＝1.000 0，線性范圍0.18～1.06 mg/mL；α-蒎烯＝340.944 8＋9.149 6，＝0.999 8，線性范圍0.07～0.40 mg/mL；β-蒎烯＝350.287 9＋8.947 0，＝0.999 9，線性范圍0.07～0.42 mg/mL；1,8-桉葉素＝382.688 5＋69.213 9，＝0.999 8，線性范圍1.32～7.92 mg/mL；α-松油醇＝384.615 7＋3.127 6，＝0.999 5，線性范圍0.09～0.54 mg/mL；香葉醇＝365.406 7＋12.867 8，＝0.999 7，線性范圍0.24～1.45 mg/mL；β-欖香烯＝423.280 5＋2.532 9，＝0.999 6，線性范圍0.02～0.11 mg/mL；β-丁香烯＝449.043 2＋2.210 0，＝0.999 7，線性范圍0.04～0.21 mg/mL；反式-橙花叔醇＝353.389 7－4.525 6，＝0.999 6，線性范圍0.08～0.46 mg/mL；石竹素＝207.340 9＋0.302 1，＝ 0.999 8，線性范圍0.03～0.16 mg/mL。

2.5.6 精密度考察

（1）日內(nèi)精密度：取“2.5.5”項中稀釋后的混合對照品溶液，按照“2.5.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，結(jié)果顯示，異戊酸、α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、β-欖香烯、β-丁香烯、反式-橙花叔醇、石竹素的峰面積的RSD分別為1.43%、2.68%、1.01%、1.92%、1.85%、1.61%、1.91%、2.20%、2.05%、0.80%，表明儀器日內(nèi)精密度良好。

A-無水乙醇 B-混合對照品 C-供試品 1-異戊酸 2-α-蒎烯 3-β-蒎烯 4-1,8-桉葉素 5-α-松油醇 6-香葉醇 7-β-欖香烯 8-β-丁香烯 9-反式-橙花叔醇 10-石竹素

（2）日間精密度：取“（1）”項日內(nèi)精密度中混合對照品溶液，于第2、3天按相同條件分別連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，異戊酸、α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、β-欖香烯、β-丁香烯、反式-橙花叔醇、石竹素的峰面積的RSD分別為1.57%、1.78%、2.34%、1.98%、2.85%、1.45%、2.83%、2.46%、2.57%、2.71%，表明儀器日間精密度良好。

2.5.7 重復(fù)性考察 取S1號樣品6份，按照“2.2.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別按照“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算各成分含量，結(jié)果顯示，異戊酸、α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、β-欖香烯、β-丁香烯、反式-橙花叔醇、石竹素平均質(zhì)量濃度分別為28.14、13.15、13.07、211.46、12.83、41.59、1.84、4.82、12.61、2.94 mg/mL，其RSD分別為1.28%、2.56%、0.68%、0.98%、2.52%、2.93%、2.17%、2.79%、2.88%、2.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 穩(wěn)定性考察 取“2.2.1”項中制備的S1號供試品溶液，按照“2.5.1”項下色譜條件，分別于制備后0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，結(jié)果顯示，異戊酸、α-蒎烯、β-蒎烯、1，8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、β-欖香烯、β-丁香烯、反式-橙花叔醇、石竹素峰面積的RSD分別為1.74%、2.61%、2.59%、1.62%、2.54%、2.95%、2.04%、2.79%、2.52%、2.86%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.9 加樣回收率考察 取S1號樣品6份，加入樣品中對應(yīng)成分含量約1∶1的混合對照品，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.5.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，結(jié)果顯示，異戊酸、α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、β-欖香烯、β-丁香烯、反式-橙花叔醇、石竹素的平均加樣回收率分別為100.87%、99.18%、98.00%、100.81%、99.77%、99.19%、102.36%、99.63%、99.31%、99.12%，RSD分別為2.32%、1.67%、1.54%、2.23%、2.00%、1.33%、1.88%、1.57%、2.19%、2.39%。

2.5.10 樣品測定 取S1～S15號樣品，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.5.1”項色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，計算樣品中10個成分的含量，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，異戊酸、α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、α-松油醇、香葉醇、β-欖香烯、β-丁香烯、反式-橙花叔醇、石竹素的質(zhì)量濃度分別在19.49～43.24、2.90～13.15、7.47～17.19、182.94～248.19、12.83～20.48、21.82～57.63、1.54～2.83、3.07～6.50、12.06～19.02、2.94～5.43 mg/mL。

3 討論

3.1 指紋圖譜的建立

蜘蛛香主要分布于我國西南及東北地區(qū)，在云南、貴州、四川等地有著廣泛的分布[17]。木香主要栽培于云南、四川等地，木香是云南的重要道地藥材[18]。云南是草果的主要產(chǎn)地，草果的種植面積和產(chǎn)量均占全國的90%以上，主產(chǎn)于紅河、文山、德宏等地[19]。本研究在組合形成15批CZ樣品時，依據(jù)課題組前期對3味藥材揮發(fā)油指紋圖譜的研究[20]，選擇了各藥的主產(chǎn)地或道地產(chǎn)地。以3味藥材為影響因素，藥材產(chǎn)地為因素水平，建立L9(34)正交試驗設(shè)計（S2～S5、S7～S9、S12、S14），并在此基礎(chǔ)上隨機(jī)組合其余批次樣品（S1、S6、S10、S11、S13、S15），科學(xué)的形成15批樣品。在建立GC-MS指紋圖譜及定量分析的過程中，考察了不同初始溫度（40、50、60 ℃）、不同分流比（10∶1、20∶1、40∶1）對譜圖的影響，結(jié)果顯示初始溫度為40 ℃、分流比為40∶1時，譜圖峰形、分離度較好。

表3 15批CZ揮發(fā)油中10個成分的定量分析

3.2 定量分析指標(biāo)成分的選擇

CZ揮發(fā)油中成分復(fù)雜，且方中蜘蛛香、木香、草果3味藥材均含有一定的揮發(fā)油類成分，故在指標(biāo)成分選擇時需兼顧3者。研究顯示異戊酸可以改善卵巢切除所致的骨質(zhì)疏松[21]，歸屬于蜘蛛香揮發(fā)油。1,8-桉葉素為CZ揮發(fā)油中含量最多的成分，具有抗水腫[22]、抗炎[22]、抗心力衰竭[23]等多種藥理活性；香葉醇對多種癌細(xì)胞[24-25]增殖均具有抑制作用，對糖尿病所致腎病有著一定的治療作用[26]，二者均歸屬于草果揮發(fā)油。α-蒎烯具有神經(jīng)保護(hù)作用[27]；β-蒎烯具有抗癌作用[28]，二者均有一定的抗菌、抗病毒[29-30]活性，二者為草果、蜘蛛香揮發(fā)油共有。β-欖香烯具有抗癌作用[31]，β-丁香烯可以減輕腦部缺血再灌注的損傷[32]，石竹素具有鎮(zhèn)靜作用[33]，3者為蜘蛛香、木香揮發(fā)油共有。α-松油醇具有抗炎[34]、心血管保護(hù)[35]作用，反式-橙花叔醇對高血壓有著一定的緩解作用[36]，二者為3藥揮發(fā)油共有。此外，α-蒎烯、β-蒎烯、香葉醇、反式-橙花叔醇為OPLS-DA中所得對CZ揮發(fā)油影響較大的成分。綜上分析，故本研究選擇上述10個成分進(jìn)行定量分析。

4 結(jié)論

本研究中的CZ源于香果健消片，去除糯米而成。課題組前期使用原方中4味藥材制備透皮貼劑，發(fā)現(xiàn)加入糯米后貼劑難以成型；同時，考慮糯米在原方中主要起澀腸作用，其主要成分為淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，難以透過皮膚發(fā)揮功效。綜合考慮，去除方中糯米進(jìn)行研究。

課題組將CZ制為透皮貼劑，使用CZ揮發(fā)油作為促滲劑的同時，同時發(fā)揮一定的藥效作用，以期起到“雙效合一”的作用[37]，為保證后續(xù)制劑質(zhì)量穩(wěn)定性，故建立了CZ揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜及其中10個指標(biāo)成分的定量分析方法。方中含揮發(fā)油類成分的3味藥材揮發(fā)油均有表征，較全面地反映了CZ揮發(fā)油的化學(xué)成分，可以為其質(zhì)量控制及評價提供參考。通過結(jié)合聚類分析、PCA、OPLS-DA評價不同產(chǎn)地來源的藥材對質(zhì)量的影響，結(jié)果提示，3味藥材的產(chǎn)地均會對其質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響，提示在后續(xù)實驗過程中需嚴(yán)格控制藥材產(chǎn)地來源，以保證后續(xù)制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性。但CZ揮發(fā)油的藥理作用尚未明確，且揮發(fā)油類成分往往受多種因素影響，其成分差異較大，何種差異成分與其藥效相關(guān)，這些都有待后續(xù)深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 龍慶德, 楊南赟, 李啟瑞, 等. 蜘蛛香不同部位揮發(fā)性化學(xué)成分分析 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2021, 36(10): 6193-6197.

[2] 楊南赟, 曾凡利, 張旭, 等. 蜘蛛香揮發(fā)油抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2021, 37(4): 79-83.

[3] Sah S P, Mathela C S, Chopra K. Involvement of nitric oxide (NO) signalling pathway in the antidepressant activity of essential oil ofPatchouli alcohol chemotype [J]., 2011, 18(14): 1269-1275.

[4] 趙兵, 郝萍, 高昂, 等. 纈草與蜘蛛香揮發(fā)油的抗菌抗氧化活性研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(8): 1037-1040.

[5] 唐飛, 劉美辰, 敖慧. 木香與川木香揮發(fā)油化學(xué)成分及抗菌活性的對比研究 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2020, 38(6): 165-168.

[6] 侯鵬飛, 陳文星, 趙新慧, 等. 木香揮發(fā)性成分氣質(zhì)聯(lián)用分析及其抑制血小板聚集作用的研究 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2008, 14(7): 26-30.

[7] 劉娜, 夏咸松, 趙毅, 等. 不同產(chǎn)地草果揮發(fā)油GC-MS成分分析及抑菌試驗研究 [J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2021, 30(2): 97-103.

[8] 張琪, 楊揚(yáng). 草果揮發(fā)油對肝癌H22荷瘤小鼠的抑瘤作用 [J]. 武漢大學(xué)學(xué)報: 理學(xué)版, 2015, 61(2): 179-182.

[9] 高鳴鄉(xiāng), 蔣佩文, 李敏惠, 等. 草果揮發(fā)油誘導(dǎo)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2021, 33(6): 992-997.

[10] Dai M, Peng C, Sun F H. Anti-infectious efficacy of essential oil from Caoguo () [J]., 2016, 36(6): 799-804.

[11] Yang S Y, Xue Y F, Chen D J,.-Crevost & Lemarié: A comprehensive review on traditional uses, botany, phytochemistry, and pharmacology [J]., 2022, 21: 1487-1521.

[12] 郝佳旭, 查麗春, 范曉, 等. 基于信息熵權(quán)法優(yōu)選香果健消片揮發(fā)油羥丙基-β-環(huán)糊精包合工藝及其表征 [J]. 中草藥, 2022, 53(13): 3962-3971.

[13] 宋馳, 葛威, 鄒佳莉, 等. 北柴胡及醋北柴胡標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量差異性分析 [J]. 中草藥, 2022, 53(8): 2331-2340.

[14] 龍慶德, 楊南赟, 龍春升, 等. 不同海拔蜘蛛香揮發(fā)油GC-MS分析[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2022, 41(10): 182-185.

[15] 沈華, 唐藝玲, 杜春燕, 等. 不同方法提取草果油的GC-MS分析 [J]. 食品與發(fā)酵科技, 2021, 57(3): 145-151.

[16] 何俏明, 覃潔萍, 黃艷, 等. 草果果仁及果殼揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2013, 19(14): 112-117.

[17] 黃寶康, 鄭漢臣, 秦路平, 等. 國產(chǎn)纈草屬藥用植物資源調(diào)查 [J]. 中藥材, 2004, 27(9): 632-634.

[18] 鄭加梅, 尚明越, 王嘉樂, 等. 木香的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用研究進(jìn)展及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測 [J]. 中草藥, 2022, 53(13): 4198-4213.

[19] 楊青, 陳達(dá)菊, 楊羚鈺, 等. 云南省草果產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策 [J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2020(1): 245-247.

[20] 郝佳旭, 程炳鐸, 查麗春, 等. 草果揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用指紋圖譜的建立及化學(xué)識別模式研究[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2022, 42(17): 1750-1754.

[21] Cho K M, Kim Y S, Lee M Y,. Isovaleric acid ameliorates ovariectomy-induced osteoporosis by inhibiting osteoclast differentiation [J]., 2021, 25(9): 4287-4297.

[22] Martins A, Rodrigues L B, Cesário F R A S,. Anti-edematogenic and anti-inflammatory activity of the essential oil fromleaves and its major constituent 1,8-cineole (eucalyptol) [J]., 2017, 96: 384-395.

[23] Wang Y, Zhang X, Fu Y,. 1,8-Cineole protects against ISO-induced heart failure by inhibiting oxidative stress and ER stressand[J]., 2021, 910: 174472.

[24] Yang H W, Liu G H, Zhao H C,. Inhibiting the JNK/ERK signaling pathway with geraniol for attenuating the proliferation of human gastric adenocarcinoma AGS cells [J]., 2021, 35(8): e22818.

[25] Fatima K, Wani Z A, Meena A,. Geraniol exerts its antiproliferative action by modulating molecular targets in lung and skin carcinoma cells [J]., 2021, 35(7): 3861-3874.

[26] El-Said Y A M, Sallam N A A, Ain-Shoka A A M,. Geraniol ameliorates diabetic nephropathy via interference with miRNA-21/PTEN/Akt/mTORC1 pathway in rats [J]., 2020, 393(12): 2325-2337.

[27] Khan-Mohammadi-Khorrami M K, Asle-Rousta M, Rahnema M,. Neuroprotective effect of alpha-pinene is mediated by suppression of the TNF-α/NF-κB pathway in Alzheimer's disease rat model [J]., 2022, 36(5): e23006.

[28] Machado T Q, Felisberto J R S, Guimar?es E F,. Apoptotic effect of β-pinene on oral squamous cell carcinoma as one of the major compounds from essential oil of medicinal plantKunth [J]., 2022, 36(6): 1636-1640.

[29] Freitas P R, de Araújo A C J, Barbosa C R,. Inhibition of efflux pumps by monoterpene (α-pinene) and impact onresistance to tetracycline and erythromycin [J]., 2021, 22(2): 123-126.

[30] Qiu B, Wei F, Su J,. The effects of β-pinene, a pine needle oil monoterpene, on adenovirus type 3 [J]., 2022, 172(3): 345-351.

[31] 李琳, 成光宇, 李慶杰, 等. β-欖香烯對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制研究[J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2021, 23(10): 3571-3577.

[32] 趙虹霞, 鄧玲, 王萱, 等. β-石竹烯對小鼠腦缺血再灌注損傷作用機(jī)制的研究 [J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2021, 37(13): 1684-1687.

[33] Dougnon G, Ito M. Essential oil from the leaves of, and sesquiterpene caryophyllene oxide induce sedative activity in mice [J]., 2021, 14(7): 651.

[34] Kumar Bose S, Sharma K, Chhibber S,. Therapeutic potential of nanolipoidal α-terpineol in combating keratitis induced byin the murine model [J]., 2021, 594: 120175.

[35] Paulino E T, Rodrigues A K B F, Machado M,. Alpha-terpineol prevents myocardial damage against isoproterenol-MI induced in Wistar-Kyoto rats: New possible to promote cardiovascular integrity [J]., 2022, 290: 120087.

[36] Lin Y M, Badrealam K F, Kuo C H,. Small molecule compound nerolidol attenuates hypertension induced hypertrophy in spontaneously hypertensive rats through modulation of Mel-18-IGF-IIR signalling [J]., 2021, 84: 153450.

[37] 張定堃, 傅超美, 林俊芝, 等. 中藥制劑的“藥輔合一”及其應(yīng)用價值 [J]. 中草藥, 2017, 48(10): 1920-1929.

Establishment of GC-MS fingerprint and quantitative analysis of multi- components of volatile oil from Compound Zhizhuxiang

HAO Jia-xu1, 2, YANG Li-juan1, 2, FAN Xiao1, 2, ZHA Li-chun1, 2, CUI Li-li3, CHENG Bing-duo1, 2, LI Yuan-zeng1, 2, MA Yun-shu1, 2

1. College of Chinese Materia Medica and Yunnan Key Laboratory of Southern Medicinal Utilization, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. The Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology in University of Yunnan Province, Kunming 650500, China 3. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To establish the GC-MS fingerprint of the volatile oil of Compound Zhizhuxiang (CZ) and quantitative analysis method of 10 index components, providing a reference for the quality control and evaluation of volatile oil of CZ.A total of 15 batches of volatile oil from the CZ were extracted. The GC-MS technology was used to establish the fingerprint of volatile oils, then the “” of Central South University was used to evaluate the similarity, and the common peaks were assigned. Fingerprints were assessed by cluster analysis (CA), principal component analysis (PCA), and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA). The contents of 10 index components in CZ were determined by GC.The volatile oil yield of 15 batches of CZ was between 4.4 and 6.8 mL. 31 Common peaks were identified in the GC-MS fingerprint. Among them, peaks 1, 11 belonged to the volatile oil from Zhizhuxiang (et, VJRR); Peak 31 belonged to the volatile oil from Muxiang (, AR); Peaks 6—9, 15, and 21 belonged to the volatile oil from Caoguo (, TF); Peaks 2—5, 10, 18 were shared by the volatile oil from VJRR and TF; Peaks 23, 25, 27, 29, 30 was shared by the volatile oil from VJRR, and AR, peaks 12—14, 16, 17, 19, 20, 22, 24, 26, 28 shared by the volatile oil from VJRR, AR and TF. The similarity between the 15 batches of sample fingerprints and the median fingerprint was between 0.798 and 0.998. The samples could be divided into two categories by cluster analysis, among S1, S2, S5, S6, S11, S14, and S15 are the first category; S3, S4, S7—S10, S12, and S13 are the second category. The samples could be divided into four categories by PCA and OPLS-DA; among them, S1, S2, S5, and S6 are the first category; S3, S4, S7—S9 are the second category; S10, S12, and S13 are the third category; S11, S14, and S15 are the fourth category. The content of isovaleric acid (peak 1), α-pinene (peak 2), β-pinene (peak 3) 1,8-cineole (peak 7), α-terpineol (peak 13), geraniol (peak 15), β-elemene (peak 23), β-caryophyllene (peak 25), nerolidol (peak 28), caryophyllene oxide (peak 29) was between 19.49—43.24, 2.90—13.15, 7.47—17.19, 182.94—248.19, 12.83—20.48, 21.82—57.63, 1.54—2.83, 3.07—6.50, 12.06—19.02, 2.94—5.43 mg/mL.The established GC-MS fingerprint and quantitative analysis method of volatile oil from CZ have good separation and high accuracy. It can provide a reference for the quality control and evaluation of the volatile oil from CZ.

Compound Zhizhuxiang; volatile oil; GC-MS; fingerprint; quantitative analysis; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis;et;;; isovaleric acid; α-pinene; β-pinene; 1,8-cineole; α-terpineol; geraniol; β-elemene; β-caryophyllene; nerolidol; caryophyllene oxide

R283.6

A

0253 - 2670(2022)22 - 7048 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.22.008

2022-05-27

國家自然科學(xué)基金資助項目（82174065）；云南省科技人才和平臺計劃（202105AG070012）

郝佳旭，男，碩士研究生，研究方向為中藥藥劑學(xué)。E-mail: zermattbm@163.com

馬云淑，女，博士，教授，研究方向為中藥藥劑學(xué)。Tel: (0871)65918217 E-mail: yunshuma2@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]