姜京京，張成鋒，韓財(cái)安，田燦，張平，徐增洪，高楊，蘇勝?gòu)?* ，唐永凱,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214081； 2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081； 3.江西生物科技職業(yè)學(xué)院，江西 南昌 330220； 4.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 5.睢寧縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，江蘇 徐州 221200)

克氏原螯蝦Procambarusclarkii俗稱小龍蝦，因其肉質(zhì)緊實(shí)、味道鮮美，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，隨著市場(chǎng)需求量不斷增加，克氏原螯蝦已然成為淡水養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)品種之一[1]。在克氏原螯蝦的實(shí)際生產(chǎn)和科學(xué)研究過(guò)程中，經(jīng)常需要離水操作，不可避免地造成蝦體損傷，從而影響研究結(jié)果和后期存活率。為減少人為操作引起克氏原螯蝦應(yīng)激而造成蝦體損傷，需要科學(xué)合理地使用麻醉劑。

目前，常見(jiàn)的漁用麻醉劑主要包括MS-222、丁香油、2-苯氧乙醇和二氧化碳等[2]。丁香油由多種天然植物提取，為淡黃色或無(wú)色的透明狀液體，不溶于水，易溶于醇、醚或冰醋酸，帶有特殊的香氣[3]，作為典型的溫和麻醉劑，因其安全廉價(jià)，被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究中[4]。研究表明，丁香油和乙醇混合制成溶液具有較強(qiáng)的麻醉效果，丁香油和乙醇按體積比為1∶1.5混合溶解是達(dá)到飽和濃度的最小體積[5]，同時(shí)減少了乙醇用量。麻醉的方式有多種，不同方式的麻醉使用效果存在明顯差異[6-7]。對(duì)魚類的研究顯示，魚鰓部噴灑麻醉誘導(dǎo)時(shí)間較浸浴法短[8]，說(shuō)明噴灑麻醉可以提供滿意的麻醉效果。因水產(chǎn)動(dòng)物生活在水中，麻醉多采用浸浴的傳統(tǒng)方式，以最大程度地減輕對(duì)個(gè)體的傷害[9]，如徐濱等[10]采用浸浴麻醉的方式，將MS-222、丁香油等麻醉劑應(yīng)用于克氏原螯蝦的生產(chǎn)和選育過(guò)程的研究中。但克氏原螯蝦在生產(chǎn)和科研過(guò)程中多為脫水狀態(tài)，體表噴灑麻醉能夠有效降低其新陳代謝，同時(shí)方便操作。本試驗(yàn)中，研究了丁香油-乙醇溶液不同濃度和不同使用方式對(duì)克氏原螯蝦的麻醉效果的影響，以期確定克氏原螯蝦適宜的麻醉方式和濃度，為減少克氏原螯蝦在實(shí)際生產(chǎn)和科學(xué)研究中人為操作的損傷、提高存活率提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

克氏原螯蝦購(gòu)自湖南省岳陽(yáng)市水產(chǎn)研究所和江蘇盱眙龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展股份有限公司。用曝氣自來(lái)水將蝦剛好浸沒(méi)，暫養(yǎng)在透明玻璃缸(30 cm×15 cm×15 cm)內(nèi)。挑選體表完整、反應(yīng)敏捷的2種規(guī)格健康蝦為試驗(yàn)用蝦，各100只，體質(zhì)量分別為(6.17±0.20)、(29.54±0.30)g。

丁香油和乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。采用Loligo?·Systems魚類及水生無(wú)脊椎動(dòng)物呼吸代謝測(cè)量系統(tǒng)和FireSting O2裝置進(jìn)行溶氧量測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 浸浴麻醉試驗(yàn) 丁香油和乙醇按體積比為1∶1.5混合溶解后再溶于曝氣的自來(lái)水，水溫為(20±1) ℃，pH為7.5±0.1。設(shè)置質(zhì)量濃度為4、6、8、10 g/L的4組丁香油-乙醇溶液對(duì)小規(guī)格蝦進(jìn)行麻醉，設(shè)置質(zhì)量濃度為10、16、20、24 g/L的4組丁香油-乙醇溶液對(duì)大規(guī)格蝦進(jìn)行麻醉。將克氏原螯蝦放入麻醉溶液中，溶液剛好浸沒(méi)蝦體。每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放6只蝦，并設(shè)置空白對(duì)照。待完全麻醉后，將蝦反復(fù)沖洗幾次后放入曝氣水中，觀察蝦的行為，克氏原螯蝦麻醉和復(fù)蘇階段的行為特征判斷參考 Takahashi等[11]的方法，記錄麻醉、復(fù)蘇時(shí)間，24 h后記錄存活率。

1.2.2 噴灑麻醉試驗(yàn) 設(shè)置質(zhì)量濃度為1、2、4、8 g/L的4組丁香油-乙醇溶液對(duì)小規(guī)格蝦進(jìn)行麻醉，設(shè)置質(zhì)量濃度為8、10、16、20 g/L的4組丁香油-乙醇溶液對(duì)大規(guī)格蝦進(jìn)行麻醉，丁香油-乙醇的配比、平行組和對(duì)照的設(shè)置同浸浴麻醉試驗(yàn)。將蝦放入干燥的塑料盒中，使用裝有混合麻醉溶液的噴壺，對(duì)克氏原螯蝦體表均勻噴灑1 min，觀察蝦的行為，記錄麻醉、復(fù)蘇時(shí)間，24 h后記錄存活率。

1.2.3 耗氧率的測(cè)定 分別采用8、4 g/L丁香 油-乙醇溶液浸浴和噴灑麻醉小規(guī)格克氏原螯蝦，待完全麻醉，將蝦反復(fù)沖洗后快速放入呼吸室中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量，計(jì)算耗氧率，同時(shí)對(duì)未進(jìn)行麻醉操作的克氏原螯蝦進(jìn)行耗氧率測(cè)定，作為空白對(duì)照。耗氧率計(jì)算公式為

R=(DO0-DOt)×V/(W×t)。

其中：R為耗氧率(mg/(kg·h))；DO0、DOt分別為試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)水中溶解氧的含量(mg/L)；W為試驗(yàn)動(dòng)物濕質(zhì)量(kg)；V為呼吸室水體積(L)；t為試驗(yàn)用時(shí)(h)。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)的測(cè)定 分別采用20、16 g/L丁香油-乙醇溶液浸浴和噴灑麻醉大規(guī)格克氏原螯蝦，待完全麻醉，將蝦反復(fù)沖洗后轉(zhuǎn)移至曝氣水中復(fù)蘇，分別于0、1、3、6、12、24 h后取血液和鰓組織樣品。將血液于4 ℃下靜置24 h，離心取上清液；取鰓樣本約0.1 g，在900 μL體積分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水中均質(zhì)，4 ℃下勻漿，以2 500 r/min離心10 min，棄上脂層，收集上清。采用南京建成生物科技有限公司的試劑盒測(cè)定血清和鰓組織中的超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用t檢驗(yàn)法分析組間差異，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度麻醉劑對(duì)克氏原螯蝦的麻醉效果

2.1.1 浸浴麻醉效果 在水溫為(20±1)℃下，以不同濃度的丁香油-乙醇溶液對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)行浸浴麻醉。結(jié)果顯示，丁香油-乙醇質(zhì)量濃度為8、20 g/L時(shí)，分別在7.8、4.5 h能夠快速麻醉小規(guī)格和大規(guī)格的克氏原螯蝦，復(fù)蘇時(shí)間均達(dá)到30 min以上，2種蝦的存活率均為100%(表1)。

表1 浸浴麻醉克氏原螯蝦的麻醉與復(fù)蘇時(shí)間及存活率

2.1.2 噴灑麻醉效果 在室溫和水溫為(20±1)℃下，以不同濃度的丁香油-乙醇溶液對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)行噴灑麻醉。結(jié)果顯示，隨著濃度升高，完全麻醉時(shí)間逐漸縮短，丁香油-乙醇質(zhì)量濃度為4、16 g/L時(shí)，分別在6.4、5.4 h時(shí)能夠快速麻醉小規(guī)格和大規(guī)格克氏原螯蝦，且復(fù)蘇時(shí)間均達(dá)到30 min以上，2種蝦的存活率均為100%(表2)。

表2 噴灑麻醉克氏原螯蝦的麻醉與復(fù)蘇時(shí)間及存活率

2.2 克氏原螯蝦麻醉后的行為特征

克氏原螯蝦的浸浴麻醉行為特征同對(duì)蝦[12]。而在對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)行噴灑麻醉過(guò)程中，開始蝦反應(yīng)劇烈，倒退或立螯；隨后緩慢爬行，并左右失去平衡，螯足彎曲且左右不對(duì)稱；然后縮在角落，用玻璃棒撥動(dòng)，對(duì)機(jī)械刺激反應(yīng)遲鈍，螯足平直并張開一定角度；最后靜止不動(dòng)，對(duì)機(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)，螯足平直無(wú)力與身體平行，螯足兩指閉合(圖1)。

圖1 噴灑麻醉后克氏原螯蝦的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of red swamp crayfish Procambarus clarkii after sprinkling anesthesia

2.3 不同麻醉方式下的耗氧率

從圖2可見(jiàn)：與對(duì)照組相比，2種麻醉處理顯著降低了克氏原螯蝦的耗氧率(P<0.05)，且噴灑麻醉的耗氧率顯著低于浸浴麻醉(P<0.05)；隨著麻醉時(shí)間的延長(zhǎng)，浸浴麻醉組的耗氧率變化不大，而噴灑麻醉組耗氧率則不斷降低。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level.圖2 浸浴、噴灑麻醉對(duì)克氏原螯蝦耗氧率的影響Fig.2 Effects of anesthesia of immersion bath and spraying on oxygen consumption rate of red swamp crayfish Procambarus clarkia

2.4 不同麻醉方式下的氧化應(yīng)激

從表3可見(jiàn)：與對(duì)照組相比，2種麻醉處理顯著升高了克氏原螯蝦體的SOD和CAT活性(P<0.05);2種方式的麻醉處理組間SOD和CAT活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而鰓組織中,噴灑麻醉處理組的SOD、CAT酶活性顯著低于浸浴麻醉組(P<0.05)。

表3 不同麻醉處理組間SOD、CAT酶活力差異

從圖3可見(jiàn)，麻醉處理后0～3 h時(shí)，浸浴和噴灑麻醉組血清CAT活性增強(qiáng)，隨后被抑制，而SOD活性則在0～6 h時(shí)增強(qiáng)，隨后被抑制。

圖3 不同麻醉處理組血清酶活力的變化Fig.3 Changes in serum enzyme activity between different anesthesia treatment groups

3 討論

3.1 噴灑麻醉階段行為特征判斷標(biāo)準(zhǔn)——螯足

甲殼類動(dòng)物的螯足雖在形態(tài)上笨重，但執(zhí)行著防御、威脅和獲取食物等多種功能[11]。甲殼類行為由神經(jīng)調(diào)控。研究顯示，神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量與附肢的活動(dòng)量成正比，而在附肢中螯足的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量最多，排列也最緊密[13-14]，因此,通過(guò)螯足的活動(dòng)狀態(tài)可相對(duì)準(zhǔn)確地反映神經(jīng)系統(tǒng)活躍強(qiáng)度。麻醉劑主要是通過(guò)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻痹個(gè)體，使行動(dòng)減緩、耗氧降低[15]，理論上可通過(guò)螯足的形態(tài)來(lái)判斷麻醉效果。本研究的噴灑麻醉過(guò)程中，不同麻醉階段克氏原螯蝦的螯足表現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，表明螯足的行為特征可作為判斷麻醉效果的標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 呼吸方式的轉(zhuǎn)變對(duì)麻醉效果的影響

3.3 麻醉方式的選擇

鰓是魚體重要的多功能組織，參與呼吸、酸堿平衡、離子平衡、含氮廢物排泄和滲透壓調(diào)節(jié)等過(guò)程。鰓與環(huán)境直接接觸，具有表面積大、化學(xué)物質(zhì)吸收率高的特點(diǎn)，因此，鰓是水生污染物和藥物的主要靶器官之一，并且鰓較易受損傷，常會(huì)導(dǎo)致水生動(dòng)物生長(zhǎng)速度降低或大量死亡。本試驗(yàn)中，浸浴麻醉達(dá)到適宜麻醉效果所需的麻醉劑濃度較高，且鰓組織中2種應(yīng)激酶活性較噴灑麻醉顯著升高，表明浸浴麻醉處理組克氏原螯蝦鰓組織氧化損傷較嚴(yán)重。丁香油降低耗氧率的方式主要是通過(guò)減緩體內(nèi)代謝和鰓運(yùn)動(dòng)輸氧能力，麻醉處理后，水產(chǎn)動(dòng)物行動(dòng)減緩，耗氧率降低，且麻醉程度越深，耗氧率就越低[21]。本試驗(yàn)中，噴灑麻醉的克氏原螯蝦耗氧率在麻醉過(guò)程中明顯低于浸浴麻醉的蝦，這說(shuō)明噴灑麻醉程度較深。丁香油不溶于水而溶于乙醇，將丁香油-乙醇混合溶液溶于水后浸浴麻醉克氏原螯蝦，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，乙醇揮發(fā)，丁香油與水分離，漂浮在水表面并揮發(fā)，麻醉效果逐漸減弱[22]，而噴灑可使丁香油和乙醇附在克氏原螯蝦體表，而乙醇能夠加速外用藥物的吸收[23]，通過(guò)作用于神經(jīng)、脊髓，使之進(jìn)入深度鎮(zhèn)靜，呼吸減弱。溫度影響丁香油的麻醉誘導(dǎo)效果及恢復(fù)時(shí)間[24]，本試驗(yàn)中，噴灑麻醉的克氏原螯蝦暴露在空氣中，而浸浴麻醉在水中，兩者存在溫差，麻醉效果也有所不同，但本實(shí)驗(yàn)室室溫與水溫均在20 ℃左右。因此，作為可長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣的甲殼類，噴灑麻醉相對(duì)于浸浴麻醉效果更好，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.4 耗氧率與抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性

活性氧的產(chǎn)生來(lái)源于氧化代謝和ATP的合成，是氧正常代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物。莊平等[25]研究發(fā)現(xiàn)，中華鱘幼魚經(jīng)不同濃度丁香酚麻醉后，耗氧率均呈先升高后降低的趨勢(shì)，其原因是低濃度的麻醉劑對(duì)魚體產(chǎn)生脅迫作用，活動(dòng)能力增強(qiáng)，呼吸頻率加快，而后在麻醉劑持續(xù)作用下進(jìn)入麻醉的各個(gè)時(shí)期，隨麻醉程度加深，耗氧率變低。與此結(jié)果一致，本研究中，不同麻醉處理方式均能顯著降低克氏原螯蝦的耗氧率，且麻醉程度越深，耗氧率越低。由于細(xì)胞內(nèi)活性氧主要在線粒體中產(chǎn)生，同時(shí)線粒體為氧化應(yīng)激損傷的主要細(xì)胞器，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞氧供不足，有研究顯示，缺氧條件下魚類降低代謝率以適應(yīng)環(huán)境，表現(xiàn)為耗氧率降低[26]。同時(shí)，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，SOD和CAT活性增強(qiáng)，以消除自由基的不利影響，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體作用，可見(jiàn)耗氧率與氧化應(yīng)激指標(biāo)存在線性關(guān)聯(lián)。本試驗(yàn)中，麻醉處理后0～1 h時(shí)，SOD和CAT活性均增強(qiáng)，耗氧率下降，驗(yàn)證了這一說(shuō)法。

4 結(jié)論

1)隨著丁香油-乙醇麻醉溶液濃度升高，克氏原螯蝦個(gè)體麻醉時(shí)間縮短，復(fù)蘇時(shí)間延長(zhǎng)。

2)噴灑和浸浴兩種麻醉方式均顯著降低了克氏原螯蝦的耗氧率，表明兩種方式均可用于克氏原螯蝦的麻醉，但與浸浴麻醉相比，體表噴灑麻醉可顯著降低克氏原螯蝦耗氧率，且對(duì)個(gè)體鰓組織應(yīng)激損傷也較小，表明麻醉效果相對(duì)更好。