肖鑫鑫，駱小年*，符先飛，姜旭，段友健，李姣，劉英林

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連七水漁業(yè)發(fā)展有限公司，遼寧 大連116211)

達(dá)氏鰉Husodauricus隸屬于鱘形目Acipenseriformes鱘科Acipenseridae鰉屬Huso，是鱘科魚類中個(gè)體最大的魚類，壽命長(zhǎng)，素有“淡水魚王”之稱。施氏鱘Acipenserschrenckii隸屬于鱘形目Acipenseriformes鱘科Acipenseridae鱘屬Acipenser，俗稱“七粒浮子”，具有生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)和壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是中國(guó)最早開發(fā)利用的鱘類之一。

鱘形目魚類種間甚至屬間的雜交現(xiàn)象極為普遍，國(guó)外有歐洲鰉H.huso♀×小體鱘A.ruthenus♂、西伯利亞鱘A.baeri♀×小體鱘A.ruthenus♂、俄羅斯鱘A.gueldenstaedtii♀×小體鱘A.ruthenus♂和俄羅斯鱘A.gueldenstaedtii×歐洲鰉H.huso正反交等。國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的鱘雜交種以西伯利亞鱘A.baeri♀×施氏鱘A.schrenckii♂和達(dá)氏鰉H.dauricus♀×施氏鱘A.schrenckii♂為主[1]。通過鱘的屬間或種間雜交獲得的雜交種，在生長(zhǎng)和繁殖上往往表現(xiàn)出雜交優(yōu)勢(shì)，如歐洲鰉H.huso♀×小體鱘A.ruthenus♂[2]、施氏鱘A.schrenckii♀×西伯利亞鱘A.baeri♂[3]和達(dá)氏鰉H.dauricus♀×西伯利亞鱘A.baeri♂[4]等。

雜交鱘(達(dá)氏鰉♀×施氏鱘♂)，俗稱黑龍江雜交鱘、大雜和小鱘鰉，其過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量均接近或高于兩親本中較髙的一方[5]，同時(shí)其生長(zhǎng)較父本快，具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)性能[6]，其性成熟系數(shù)(GSI)和平均絕對(duì)繁殖力顯著高于其父母本[1]，性成熟年齡較母本提前，具有明顯的雜交優(yōu)勢(shì)。近年來，達(dá)氏鰉♀×施氏鱘♂已成為中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖鱘類，其苗種價(jià)格為其他鱘苗的兩倍以上，市場(chǎng)前景廣闊。然而，在生產(chǎn)上雜交鱘繁殖效率依然不高，究其原因，是對(duì)其繁殖特性的研究不夠透徹。本研究中，對(duì)雜交鱘及施氏鱘全人工繁殖過程中的胚胎發(fā)育進(jìn)行了觀察，比較了雜交鱘與其父母本胚胎發(fā)育的特點(diǎn)，以期為生產(chǎn)中進(jìn)一步提高鱘魚繁殖效率提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用親魚來自大連七水漁業(yè)發(fā)展有限公司。2021年3—5月，催產(chǎn)5批10組雜交鱘，達(dá)氏鰉母本18尾，15～17冬齡，體質(zhì)量為(69.0±5.0)kg；施氏鱘父本10尾，9～11冬齡，體質(zhì)量為(25.0±3.0)kg；催產(chǎn)1批2組施氏鱘，施氏鱘母本4尾，15～17冬齡，體質(zhì)量為(29.0±2.0)kg，施氏鱘父本2尾，9～11冬齡，體質(zhì)量為(25.0±3.0)kg。

1.2 方法

1.2.1 人工繁殖

1)親魚的選擇與成熟度鑒定。挑選體質(zhì)健壯、身體無(wú)傷的親魚，成熟良好的雌魚生殖孔紅腫外翻，腹部膨大且富有彈性，腹壁薄，體表黏液較多。用手術(shù)刀在魚體側(cè)面性腺的后中部扎一小口，將挖卵器從小口插入，在體內(nèi)旋轉(zhuǎn)一圈后抽出，取出少量卵細(xì)胞鏡檢以觀察卵母細(xì)胞發(fā)育狀況。成熟的卵細(xì)胞呈棕黃色或灰黃色，有光澤和彈性，鏡檢可見動(dòng)物極分化明顯，可見明顯的深色色素環(huán)和白色極斑(圖1)。雄魚的成熟度較難通過外表鑒別，需用挖卵器采精鑒別，取樣步驟和雌魚相同，若能取出乳白色塊狀物，則說明成熟度較好。

圖1 雌魚成熟度檢查Fig.1 Maturity inspection of female fish

2)人工催情。參照駱小年等[7]的催產(chǎn)藥物選擇和親魚注射方法。采用胸鰭基部注射，雌性親魚分兩次注射，施氏鱘注射促黃體素釋放激素類似物2號(hào)(LHRH-A2) 4～10 μg/kg+地歐酮DOM 1～5 mg/kg，達(dá)氏鰉注射LHRH-A25～10 μg/kg+DOM 1～5 mg/kg，第1次注射全部劑量的10%～20%，第2次注射剩余劑量；雄性親魚采用1次注射法，在雌魚注射第一針時(shí)同時(shí)注射，注射劑量為雌魚的一半。依照雌性親魚成熟度差異，施氏鱘兩次注射間隔8～11 h，達(dá)氏鰉兩次注射間隔為15～18 h。

3)成熟精液的采集和儲(chǔ)備。采卵前應(yīng)首先準(zhǔn)備好充足的精液，將雄魚置于專用的采精平臺(tái)上，腹部朝上，用手輕壓雄魚腹部使精液流出，用干燥的采精盒收集精液。在滴有清水的載玻片上滴一滴精液，鏡檢精子活力，如觀察到大多數(shù)精子呈直線迅速游動(dòng)，快速游動(dòng)時(shí)間可達(dá)4 min，表明精子活力較強(qiáng)。將采集的精液在2～4 ℃條件下冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

4)成熟卵子的采集。輕壓雌魚腹部，生殖孔有少量卵粒流出時(shí)，即可進(jìn)行采卵。采用手術(shù)方法采卵，將雌魚置于采卵床，腹部朝上。先以生殖孔為中心，按照由尾至生殖孔和由頭至生殖孔的方向推壓魚腹，使游離在輸卵管里的卵排出體外。再用乙醇棉球擦拭魚體腹部生殖孔前5～10 cm的區(qū)域，用消毒手術(shù)刀在生殖孔前開一個(gè)2～3 cm的小口，同時(shí)以切口為中心，按照由頭至切口的方向推壓魚腹，使腹腔中的大部分卵排出后，再按照由尾至切口的方向推壓腹部，使后腹腔中遺留的卵排出。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水重復(fù)清洗腹腔2次，使腹腔中剩余的卵粒排出。雌魚若在手術(shù)過程中出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，可向其口中塞入乙醇棉球用于短暫麻醉。卵子采集完成后，用酒精棉擦拭傷口，用醫(yī)用縫合針和醫(yī)用可吸收縫線縫合切口，同時(shí)保持親魚微流水，消毒處理后用醫(yī)用膠涂抹切口，用吹風(fēng)機(jī)吹干后將親魚放入恢復(fù)池中。

5)人工授精。采用干法授精，取成熟的卵粒直接倒入精液，按照1 kg卵粒加入5 mL精液的比例，不斷攪拌均勻，然后加入清水，攪動(dòng)均勻后靜置3～5 min，濾掉污水，再重復(fù)漂洗幾次，去除卵中混有的黏液。再向魚卵中慢慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～20%的滑石粉懸濁液，然后倒入特制的脫黏裝置中脫黏，不斷向脫黏裝置中通入氧氣，以攪動(dòng)受精卵，避免其缺氧。持續(xù)脫黏1 h后即可將魚卵移入孵化器中孵化。經(jīng)過脫黏的魚卵仍具有黏性，為防止其相互粘連或粘在孵化器底部而造成出苗率下降，人工授精后需經(jīng)常攪動(dòng)，并根據(jù)受精卵的黏性變化，每次攪動(dòng)間隔時(shí)間隨孵化時(shí)間的延長(zhǎng)而相應(yīng)延長(zhǎng)。

6)人工孵化。采用鱘1號(hào)孵化器孵化，一個(gè)規(guī)格為43 cm×35 cm×21 cm的孵化篩可容納魚卵5～6萬(wàn)粒，水溫為16～17 ℃，溶解氧質(zhì)量濃度為6.0 mg/L以上，水流從孵化篩上方進(jìn)入，同時(shí)定期攪動(dòng)魚卵，以防止其缺氧。放入孵化器的第1天受精卵黏性較大，需每隔10～20 min人工攪動(dòng)1次；第2～3天魚卵黏性減小，每隔20～40 min人工攪動(dòng)1次；第4～5天黏性基本消失，每隔1～2 h人工攪動(dòng)1次；第6～7天開始有仔魚孵出時(shí)不再攪卵。孵化過程中受精卵出現(xiàn)水霉時(shí)，應(yīng)及時(shí)漂洗魚卵。孵出的仔魚從孵化篩中游出，順著水流進(jìn)入側(cè)面的圓形玻璃鋼水池中。

1.2.2 胚胎發(fā)育觀察 在體式顯微鏡(奧林帕斯MOTIC ST-36)下觀察鱘受精卵孵化期的形態(tài)特征變化。鱘受精卵為沉性黏性卵，將脫黏后的卵放在顯微鏡下觀察，可見卵外有一層很厚的膠膜，膠膜上黏附殘留的滑石粉，不易觀察卵的形態(tài)特點(diǎn)。用于本研究的卵未經(jīng)過滑石粉脫黏，受精卵表面相對(duì)透明，易于觀察。第1次卵裂前，每隔10～30 min觀察1次并拍照，從第1次卵裂開始到原腸胚期，每隔1～2 h觀察1次并拍照，從原腸胚期開始到仔魚孵出時(shí)，每隔2.5～5.0 h觀察1次并拍照，每次取樣20粒以上，當(dāng)有50%以上的卵出現(xiàn)新特征時(shí)記為魚卵發(fā)育至新時(shí)期的起始時(shí)間。

1.2.3 繁殖效率評(píng)價(jià)指標(biāo)

催產(chǎn)率=產(chǎn)卵魚數(shù)/催情魚總數(shù)×100%，

受精率=原腸中期活卵數(shù)/產(chǎn)卵總數(shù)×100%，

孵化率=水花魚苗/受精卵總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 繁殖結(jié)果

2021年3—5月共催產(chǎn)了5批雜交鱘和1批施氏鱘，雜交鱘和施氏鱘的催產(chǎn)率分別為100%、75%。雜交鱘繁殖共獲卵379萬(wàn)粒，平均受精率為82.9%，獲苗217.6萬(wàn)尾；施氏鱘繁殖共獲卵87萬(wàn)粒，平均受精率為82.2%，共獲苗54.2萬(wàn)尾。其中，4月17日催產(chǎn)的第一批雜交鱘受精率和孵化率最高，分別達(dá)到了97.8%和89.8%，4月28日催產(chǎn)的第三批雜交鱘的受精率最低(75.9%)，4月17日催產(chǎn)的施氏鱘孵化率較低(63.2%)(表1)。

表1 2021年試驗(yàn)雜交鱘和施氏鱘催產(chǎn)情況Tab.1 Propagation of hybrid sturgeon Huso dauricus♀× Acipenser schrenckii♂ and Amur sturgeon A.schrenckii in 2021

2.2 雜交鱘胚胎發(fā)育

在16～17 ℃水溫下，雜交鱘胚胎發(fā)育歷經(jīng)123～155 h孵化出膜，總積溫為2 102～2 445 ℃·h。根據(jù)雜交鱘胚胎發(fā)育順序及形態(tài)特點(diǎn)，并參照劉洪柏等[8]的方法，將雜交鱘胚胎發(fā)育過程分成受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、卵黃栓期、神經(jīng)胚期、器官形成期、心臟形成搏動(dòng)期和孵出期共9個(gè)階段，根據(jù)每個(gè)階段形態(tài)學(xué)特征和發(fā)生順序，又細(xì)分為32個(gè)時(shí)期，各時(shí)期發(fā)育的主要特征和所需時(shí)間見圖2。雜交鱘胚胎發(fā)育分期描述如下：

受精卵：卵受精后，卵膜吸水膨脹，動(dòng)物極中央逐漸形成一極性暗斑，顏色呈中央深邊緣淺，暗斑周圍有一環(huán)狀較寬的明亮帶。30 min后，受精卵轉(zhuǎn)動(dòng)到動(dòng)物極，動(dòng)物極始終朝上，植物極始終在下(圖2A)。

卵裂期：受精后3.5 h進(jìn)入卵裂期，受精卵第1次卵裂為經(jīng)裂，動(dòng)物極率先開始分裂，出現(xiàn)一條由邊緣向中央不斷加深的凹陷，隨著凹陷的加深形成分裂溝，動(dòng)物極分裂為2個(gè)大小相等的分裂球，稱為2細(xì)胞期(圖2B)。受精后4.4 h開始第2次卵裂，仍為經(jīng)裂，2個(gè)分裂球分別分裂1次，形成4個(gè)大小相等的分裂球，此時(shí)縱橫動(dòng)物極的兩條分裂溝相互垂直，稱為4細(xì)胞期(圖2C)。受精后5.2 h，胚胎進(jìn)入8細(xì)胞期，第3次卵裂仍為經(jīng)裂，每個(gè)分裂球再次一分為二，分裂成8個(gè)大小不等的分裂球，同時(shí)第1次分裂溝在植物極閉合(圖2D)。受精后6.2 h，胚胎進(jìn)入16細(xì)胞期，第4次分裂出現(xiàn)橫向分裂溝，為緯裂，胚胎被分成16個(gè)大小不等的分裂球，同時(shí)第2次分裂溝在植物極閉合(圖2E)。受精后7.3 h，胚胎進(jìn)入32細(xì)胞期，胚胎被分成32個(gè)分裂球，同時(shí)第3次分裂溝在植物極閉合(圖2F)。受精后8.5 h，胚胎進(jìn)入多細(xì)胞期，動(dòng)物極被分裂成很多不規(guī)則的細(xì)胞，動(dòng)物極開始出現(xiàn)色素(圖2G)。

囊胚期：受精后9.5 h，胚胎進(jìn)入囊胚期，動(dòng)物極分裂球變小，細(xì)胞界限清晰可見，植物極分裂球較大，稱為囊胚初期(圖2H)。受精后14.3 h，動(dòng)物極分裂球變得更小，細(xì)胞核分裂不同步，分裂球之間有明顯間隙，稱為囊胚中期(圖2I)。受精后15.0 h，動(dòng)物極細(xì)胞進(jìn)一步分裂變小，細(xì)胞界限模糊不清，下延到赤道處，稱為囊胚晚期(圖2J)。

原腸胚期：受精后22.0 h，胚胎進(jìn)入原腸胚期，此時(shí)外胚層開始下包，在赤道處出現(xiàn)一條狹窄的暗色條帶，稱為原腸胚初期(圖2K)。受精后24.4 h，暗色條帶繼續(xù)下延，逐漸超過赤道處，并形成了一個(gè)狹縫狀胚孔，稱為原腸胚中期(圖2L)。受精后29.0 h，形成側(cè)唇和腹唇，外胚層細(xì)胞繼續(xù)下包，動(dòng)物極覆蓋胚胎表面的3/4，稱為原腸胚晚期(圖2M)。

A—受精卵(0 h)；B—2細(xì)胞期(3.5 h)；C—4細(xì)胞期(4.4 h)；D—8細(xì)胞期(5.2 h)；E—16細(xì)胞期(6.2 h)；F—32細(xì)胞期(7.3 h)；G—多細(xì)胞期(8.5 h)；H—囊胚初期(9.5 h)；I—囊胚中期(14.3 h)；J—囊胚晚期(15.0 h)；K—原腸胚初期(22.0 h)；L—原腸胚中期(24.4 h)；M—原腸胚晚期(29.0 h)；N—大卵黃栓期(31.0 h)；O—小卵黃栓期(34.0 h)；P—隙狀胚孔期(38.5 h)；Q—神經(jīng)胚早期(44.0 h)；R—寬神經(jīng)板期(46.9 h)；S—神經(jīng)褶靠攏期(48.0 h)；T—神經(jīng)胚晚期(49.5 h)；U—神經(jīng)管閉合期(50.5 h)；V—視泡形成期(53.0 h)；W—尾芽形成期(59.1 h)；X—尾芽分離期(64.5 h)；Y—短心管期(70.1 h)；Z—長(zhǎng)心管期(75.5 h)；a—心臟變形期(83.0 h)；b—肌肉效應(yīng)期(88.5 h)；c—心跳期(95.5 h)；d—尾達(dá)頭部期(106.0 h)；e—出膜前期(119.5 h)；f、g—出膜期(123～155 h)。A—fertilized egg(0 h); B—2-cell stage(3.5 h); C—4-cell stage(4.4 h); D—8-cell stage(5.2 h); E—16-cell stage(6.2 h); F—32-cell stage(7.3 h); G—morula stage(8.5 h); H—early blastula stage(9.5 h); I—mid-blastula stage(14.3 h); J—late blastula stage(15.0 h); K—early gastrula stage(22.0 h); L—mid-gastrula stage(24.4 h); M—late gastrula stage(29.0 h); N—big yolk plug stage(31.0 h); O—small yolk plug stage(34.0 h); P—lyriform blastopore formation(38.5 h); Q—early neurula stage(44.0 h); R—wide neural plate formation(46.9 h); S—neural fold closing stage(48.0 h); T—late neurula stage(49.5 h); U—neural tube closing stage(50.5 h); V—eye vesicle formation(53.0 h); W—tail bud appearance(59.1 h); X—tail bud separating stage(64.5 h); Y—short-tubular heart formation(70.1 h); Z—long-tubular heart formation(75.5 h); a—stage of heart metamorphosing(83.0 h); b—stage of muscular effect(88.5 h); c—stage of heart beating(95.5 h); d—the tail touches the head(106.0 h); e—prehatching stage(119.5 h); f，g—hatching(123-155 h).圖2 雜交鱘胚胎發(fā)育圖Fig.2 Embryonic development of hybrid sturgeon Huso dauricus♀× Acipenser schrenckii♂

卵黃栓期：受精后31.0 h，動(dòng)物極色素較淺，植物極色素較深，兩極界限明顯，較大的卵黃栓像一個(gè)大塞子嵌在胚環(huán)內(nèi)，稱為大卵黃栓期(圖2N)。受精后34.0 h，植物極僅有一個(gè)很小的卵黃栓，其余部分均被明亮的動(dòng)物極所覆蓋，稱為小卵黃栓期(圖2O)。

神經(jīng)胚期：受精后38.5 h，卵黃栓逐漸消失，胚孔的邊緣越來越靠近，只留下狹窄的縫隙，稱為隙狀胚孔期(圖2P)。受精后44.0 h，胚胎從背部隙狀胚孔處開始形成神經(jīng)溝，并逐漸膨大形成腦部，腦部周圍出現(xiàn)神經(jīng)褶，稱為神經(jīng)胚早期(圖2Q)。受精后46.9 h，胚胎背部形成增厚的神經(jīng)板，似“馬蹄”形，神經(jīng)板向下增長(zhǎng)，并分為內(nèi)外兩部分，稱為寬神經(jīng)板期(圖2R)。受精后48.0 h，腦部的神經(jīng)褶中部下陷，邊緣升高，并逐漸靠攏，神經(jīng)板下陷、變窄，在軀干部?jī)蓚?cè)出現(xiàn)排泄原基，稱為神經(jīng)褶靠攏期(圖2S)。受精后49.5 h，腦部的神經(jīng)褶繼續(xù)靠攏，神經(jīng)板最后閉合成神經(jīng)管，稱為神經(jīng)胚晚期(圖2T)。受精后50.5 h，神經(jīng)褶閉合成神經(jīng)管，逐漸膨大加長(zhǎng)，頭部分化出3個(gè)腦泡，胚胎軀體小、尾部大，在軀體上可見直線肌節(jié)，稱為神經(jīng)管閉合期(圖2U)。

器官形成期：受精后53.0 h，胚胎頭部繼續(xù)分化，腦容積增大，可分為前、中、后3個(gè)腦泡，在前腦形成兩個(gè)眼凸，即眼原基，稱為視泡形成期(圖2V)。受精后59.1 h，腦部稍隆起，尾芽形成，呈扁平狀，稱為尾芽形成期(圖2W)。受精后64.5 h，胚體繼續(xù)隆起，高出球面，排泄系統(tǒng)原基從身體中部一直延到尾端，尾芽突出，呈棒狀，開始與球體分離，稱為尾芽分離期(圖2X)。

心臟形成搏動(dòng)期：受精后70.1 h，心臟原基在頭部前下方發(fā)育成短管狀，稱為短心管期(圖2Y)。受精后75.5 h，心臟原基呈長(zhǎng)管狀，頭部抬高，視泡明顯，稱為長(zhǎng)心管期(圖2Z)。受精后83.0 h，頭部明顯抬高，心臟變形呈“C”狀，有微弱搏動(dòng)，稱為心臟變形期(圖2a)。受精后88.5 h，胚胎尾部向腹面彎曲加長(zhǎng)，尾的末端靠近心臟，肌肉開始顫動(dòng)，稱為肌肉效應(yīng)期(圖2b)。受精后95.5 h，心臟呈大“C”狀，心臟有明顯搏動(dòng)，尾末端到達(dá)心臟，稱為心跳期(圖2c)。

孵出期：受精后106.0 h，尾部末端繼續(xù)伸長(zhǎng)并接觸頭部，胚胎在卵內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，卵黃囊上血管明顯，稱為尾達(dá)頭部期(圖2d)。受精后119.5 h，尾部末端略過頭部，尾部鰭?cǎi)拮儗?，尾牙游離，心臟搏動(dòng)加快，胚體在膜內(nèi)自由扭動(dòng)，稱為出膜前期(圖2e)。受精后123 h，仔魚開始從膜中孵出，受精后128 h仔魚大量孵出，進(jìn)入出膜期，至155 h仔魚基本全部孵出。初孵仔魚在水中做垂直運(yùn)動(dòng)，軀體呈透明色，頭部略向尾部彎曲，眼中有色素斑點(diǎn)(圖2f、g)。

2.3 施氏鱘胚胎發(fā)育

在水溫為16～17 ℃下，施氏鱘發(fā)育歷時(shí)116～138 h，總積溫為1 856～2 108 ℃·h。根據(jù)施氏鱘胚胎發(fā)育特點(diǎn)，并參照劉洪柏等[8]的方法，將施氏鱘的胚胎發(fā)育過程分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、卵黃栓期、神經(jīng)胚期、器官形成期、心臟形成搏動(dòng)期和孵出期9個(gè)階段28個(gè)時(shí)期。各時(shí)期的所需時(shí)間和主要特征見圖3。施氏鱘胚胎發(fā)育分期描述如下：

受精卵：卵受精后吸水膨脹，富有彈性，開始出現(xiàn)黏性。受精后15 min左右大部分受精卵動(dòng)物極和植物極分化，動(dòng)物極始終朝上，植物極始終朝下，稱為兩極轉(zhuǎn)動(dòng)期(圖3A)。受精后30 min動(dòng)物極逐漸出現(xiàn)暗斑，暗斑周圍有一圈明亮帶，卵膜膨脹，卵間隙明顯，稱為卵周隙形成期(圖3B)。受精后1 h左右動(dòng)物極略隆起，稱為胚胎隆起期。

卵裂期：受精后3 h開始第1次卵裂，為經(jīng)裂，首先在動(dòng)物極出現(xiàn)分裂溝，將受精卵平均分成相等的2個(gè)分裂球，稱為第1次卵裂期(圖3C)。第2次卵裂仍為經(jīng)裂，分裂溝常與第1次分裂形成的分裂溝相垂直，將受精卵分成4個(gè)大小基本相等的分裂球，稱為第2次卵裂期(圖3D)。第3次卵裂仍為經(jīng)裂，大部分受精卵的分裂溝呈現(xiàn)“Ж”形，將受精卵分成8個(gè)大小不等的分裂球，稱為第3次卵裂期(圖3E)。第4次卵裂為緯裂，將受精卵分成16個(gè)大小不等的分裂球，稱為第4次卵裂期(圖3F)。第5次卵裂仍為緯裂，將受精卵分成 32個(gè)大小不等的分裂球，稱為第5次卵裂期(圖3G)。每次卵裂間隔大約1 h。受精卵被分成越來越多更小的不規(guī)則細(xì)胞，稱為多裂期(圖3H)。

囊胚期：受精后12 h，胚胎進(jìn)入囊胚期，此時(shí)動(dòng)物極色素變淺，細(xì)胞界線不清晰，植物極色素加深，細(xì)胞仍較大，細(xì)胞界線明顯，稱為囊胚中期(圖3I)。受精后16 h，動(dòng)物極細(xì)胞界線完全模糊不清，并下延到赤道處，動(dòng)物極稍隆起形成，稱為囊胚晚期。

原腸胚期：受精后25 h，胚胎進(jìn)入原腸胚期，囊胚層不斷下包，赤道處可見一條狹窄的深色條紋，稱原腸胚早期(圖3J)。受精后30 h，隨著動(dòng)物極細(xì)胞的下包，動(dòng)、植物極細(xì)胞的界線不斷下移，動(dòng)物極占3/4左右，稱原腸胚中期(圖3K)。

卵黃栓期：受精后35 h，胚胎進(jìn)入卵黃栓期，此時(shí)動(dòng)物極細(xì)胞呈現(xiàn)亮黃色，植物極色素較深，動(dòng)、植物極界限清晰。植物極的卵黃栓較大，像個(gè)大塞子，此時(shí)稱為大卵黃栓期(圖3L)。受精后39 h，植物極的卵黃栓僅剩很小的一個(gè)圓形區(qū)域，稱為小卵黃栓期(圖3M)。

神經(jīng)胚期：受精后43 h，胚胎進(jìn)入神經(jīng)胚期，卵黃栓越來越小，胚孔邊緣逐漸靠近，呈縫隙狀，稱為隙狀胚孔期。受精后46 h，隙狀胚孔膨大形成神經(jīng)溝，稱為神經(jīng)胚早期(圖3N)。受精后44 h，在胚胎背面形成馬蹄形的神經(jīng)板，稱寬神經(jīng)板期。受精后52 h，神經(jīng)褶膨大增長(zhǎng)，形成神經(jīng)管，頭部分化出3個(gè)腦泡，稱神經(jīng)管閉合期(圖3O)。

器官形成期：受精后55 h，胚胎進(jìn)入視泡形成期，頭部前方形成2個(gè)眼凸(圖3P)。受精后59 h，尾芽突出，稍與球體胚胎分離，稱尾芽分離期(圖3Q)。

心臟形成搏動(dòng)期：受精后62 h，胚胎進(jìn)入心臟形成搏動(dòng)期，起初心管較短，位于頭部下方，略超出頭部，稱短心管期(圖3R)。受精后65 h，心管變長(zhǎng)并略有彎曲，稱為長(zhǎng)心管期(圖3S)。受精后68 h，心臟進(jìn)一步彎曲，呈“S”型，并開始微弱的跳動(dòng)，胚胎可在卵內(nèi)扭動(dòng)，稱為心臟變形期(圖3T)。受精后71 h，心管由頭部方向呈波浪狀均勻跳動(dòng)，稱為心臟搏動(dòng)期。受精后 85 h，尾部接近心臟，胚胎在卵內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，稱為肌肉效應(yīng)期(圖3U)。

孵出期：受精后95 h，胚胎進(jìn)入孵出期，尾部繼續(xù)伸長(zhǎng)并到達(dá)頭部，胚胎在卵內(nèi)活動(dòng)更劇烈，稱為尾達(dá)頭部期。受精后108 h，尾部略超過頭部，胚胎轉(zhuǎn)動(dòng)更為頻繁。受精后116 h，胚胎尾部劇烈運(yùn)動(dòng)，開始有仔魚孵出，至138 h仔魚基本全部孵出，稱為出膜期(圖3V)。

A—兩極轉(zhuǎn)動(dòng)期(0.25 h)；B—卵周隙形成期(0.5 h)；C—第1次卵裂期(3 h)；D—第二卵裂期(4 h)；E—第3次卵裂期(5 h)；F—第5次卵裂期(6 h)；G—第5次卵裂期(7 h)；H—多裂期(8 h)；I—囊胚中期(12 h)；J—原腸早期(25 h)；K—原腸中期(30 h)；L—大卵黃拴期(35 h)；M—小卵黃拴期(39 h)；N—神經(jīng)胚早期(46 h)；O—神經(jīng)管閉合期(52 h)；P—視泡形成期(55 h)；Q—尾芽分離期(59 h)；R—短心管期(62 h)；S—長(zhǎng)心管期(65 h)；T—心臟變形期(68 h)；U—肌肉效應(yīng)期(85 h)；V—出膜期(116～138 h)。A—pole conversion period(0.25 h); B—perivitelline space formation(0.5 h); C—2-cell stage(3 h); D—4-cell stage(4 h); E—8-cell stage(5 h); F—16-cell stage(6 h); G—32-cell stage(7 h); H—morula stage(8 h); I—mid-blastula stage(12 h); J—early gastrula stage(25 h); K—mid-gastrula stage(30 h); L—big yolk plug stage(35 h); M—small yolk plug stage(39 h); N—early neurula stage(46 h); O—neural tube closing stage(52 h); P—eye vesicle formation(55 h); Q—tail bud separating stage(59 h); R—short-tubular heart formation(62 h); S—long-tubular heart formation(65 h); T—stage of heart metamorphosing(68 h); U—stage of muscular effect(85 h); V—hatching(116-138 h).圖3 施氏鱘胚胎發(fā)育圖Fig.3 Embryonic development of Amur sturgeon Acipenser schrenckii

2.4 雜交鱘、施氏鱘胚胎發(fā)育時(shí)序比較

從表2可見，雜交鱘的胚胎發(fā)育分9個(gè)階段32個(gè)時(shí)期，而施氏鱘胚胎發(fā)育分9個(gè)階段28個(gè)時(shí)期。與雜交鱘胚胎發(fā)育相比，施氏鱘的受精卵階段從兩極轉(zhuǎn)動(dòng)到卵周隙形成再到胚胎隆起，具有明顯的特征，故分別劃分為兩級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)期、卵周隙形成期和胚胎隆起期3個(gè)時(shí)期，然而，施氏鱘在囊胚初期、原腸胚晚期、神經(jīng)褶靠攏期、神經(jīng)胚晚期、尾芽形成期和出膜前期的胚胎發(fā)育特征不明顯，故未做出應(yīng)有時(shí)期的劃分。

表2 雜交鱘、施氏鱘胚胎發(fā)育時(shí)序的比較

3 討論

3.1 雜交鱘與父本施氏鱘人工繁殖及胚胎發(fā)育的異同

本試驗(yàn)中,人工催產(chǎn)雜交鱘和施氏鱘自交分別獲得了催產(chǎn)率為100%和75%的結(jié)果，雜交鱘采用的催產(chǎn)方法與朱華等[9]得到的俄羅斯鱘人工催產(chǎn)最佳藥物劑量和注射方式基本相同，但在4月17日，雜交鱘的受精率、孵化率均高于施氏鱘，是否是由于達(dá)氏鰉母本卵發(fā)育得更好，有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本試驗(yàn)中采用的剖腹手術(shù)方法取卵適用于兩種鱘類，取卵切口僅2～3 cm，相比于郗云強(qiáng)等[10]的手術(shù)方法(切口4 cm)，此方法切口更小，更有利于親魚的恢復(fù)。

雜交鱘與父本施氏鱘胚胎發(fā)育的相似之處主要表現(xiàn)在：一是，兩者的受精卵均為沉黏性卵，受精卵卵膜外有一層較厚的膠膜，對(duì)卵起到保護(hù)作用[11]；二是，兩者的胚胎發(fā)育時(shí)序相似，卵裂方式均為輻射卵裂，前3次卵裂均為經(jīng)裂，第4次卵裂為緯裂，受精卵的第1次卵裂溝總是跟第2次卵裂溝相互垂直，前2次卵裂是均等卵裂，將動(dòng)物極細(xì)胞分成大小相等的細(xì)胞，第2次卵裂之后為不均等卵裂，細(xì)胞大小開始出現(xiàn)明顯的區(qū)別。與大部分冷水硬骨魚類的盤狀卵裂不同[12-13]，這種卵裂方式在鱘類中普遍存在[14-16]。

雜交鱘與父本施氏鱘胚胎發(fā)育的區(qū)別主要表現(xiàn)在：雜交鱘平均卵徑比施氏鱘大[4](表3)，貯存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，條件相同時(shí)，雜交鱘胚胎發(fā)育所需時(shí)間較長(zhǎng)，較大的卵黃利于為其提供充足的營(yíng)養(yǎng)；胚胎發(fā)育至心臟形成搏動(dòng)期時(shí)，雜交鱘的心管呈“C”型，而施氏鱘的心管則成“S”型；雜交鱘胚胎心臟開始有規(guī)律的搏動(dòng)時(shí)，尾末端已經(jīng)接近心臟，而施氏鱘胚胎尾末端還未接近心臟時(shí)，心臟就已經(jīng)開始均勻跳動(dòng)[8]；施氏鱘的發(fā)育速度快于雜交鱘；胚胎發(fā)育至孵出前期時(shí)，雜交鱘仔魚出膜前尾末端超過頭部，而施氏鱘仔魚出膜前尾末端達(dá)到頭部或略超過頭部；剛孵出的雜交鱘比剛孵出的施氏鱘個(gè)體略大，這與郭長(zhǎng)江等[11]得到的鱘科魚類出膜前期胚胎尾部末端所到達(dá)位置與出膜仔魚體長(zhǎng)成正比的研究結(jié)果一致。雜交鱘仔魚開口時(shí)間較晚，胚后發(fā)育時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，反映出雜交鱘仔魚對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及占據(jù)生態(tài)位的能力較強(qiáng)，具有成為較大個(gè)體的潛力。

表3 雜交鱘與其父母本胚胎發(fā)育異同

3.2 雜交鱘與母本達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育的異同

本試驗(yàn)中未進(jìn)行母本達(dá)氏鰉的人工繁殖和胚胎發(fā)育試驗(yàn)，但郭長(zhǎng)江等[11]將達(dá)氏鰉胚胎發(fā)育過程分成受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、心跳期和出膜期8個(gè)階段，根據(jù)每個(gè)階段的發(fā)生順序和形態(tài)特征，又細(xì)分為36個(gè)時(shí)期，達(dá)氏鰉心管呈“C”型，與本試驗(yàn)中雜交鱘心管類型相同；孵出時(shí)，本試驗(yàn)中雜交鱘與達(dá)氏鰉仔魚的尾末端均超過頭部，整個(gè)胚胎發(fā)育過程中，雜交鱘與其母本的胚胎發(fā)育時(shí)序和胚胎發(fā)育特征基本相似，呈現(xiàn)偏母遺傳特征。兩者的差別主要表現(xiàn)在：雜交鱘比達(dá)氏鰉發(fā)育更快，原腸胚中期時(shí)，雜交鱘受精卵的動(dòng)物極占胚胎表面的3/4左右，而達(dá)氏鰉受精卵的動(dòng)物極約占胚胎表面的2/3(表3)；胚胎發(fā)育過程中，雜交鱘的總需積溫略低于達(dá)氏鰉，表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)(表4)。

以施氏鱘為母本、西伯利亞鱘為父本的雜交鱘(施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂)與其父母本的胚胎發(fā)育特點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn)，雖然在胚胎發(fā)育到原腸胚中期時(shí)，雜交鱘(施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂)動(dòng)物極覆蓋胚胎表面的2/3，與其父本西伯利亞鱘相同(其母本施氏鱘動(dòng)物極覆蓋胚胎表面的3/4)，但在心跳期雜交鱘心管呈“S”型，與其母本相同(其父本心管呈“C”型)，且雜交鱘胚胎發(fā)育時(shí)序和形態(tài)特征與母本基本相同[8,17-18]。通過比較兩種雜交鱘與其父母本的異同可知， 施氏鱘♀×西伯利亞鱘♂[18]與本研究中對(duì)達(dá)氏鰉♀×施氏鱘♂的研究結(jié)果基本一致，均呈現(xiàn)偏母遺傳特征。這與鲇Silurusasotus♀×南方鲇S.meridionalis♂[19]、牙鲆Paralichthysolivaceus♀×圓斑星鰈Veraspervariegatus♂[20]雜交種的胚胎發(fā)育具有偏母遺傳的結(jié)果相同。

3.3 雜交鱘胚胎發(fā)育時(shí)間和積溫

探索雜交鱘胚胎發(fā)育所需積溫，對(duì)雜交鱘規(guī)模化苗種培育的影響及確定合理的培養(yǎng)溫度等具有一定的指導(dǎo)意義。鱘類正常發(fā)育水溫一般為14～20 ℃[21]，不同鱘發(fā)育積溫略有不同(表4)。在16～17 ℃流水中孵化，施氏鱘116 h開始有仔魚孵出，138 h全部孵出，胚胎發(fā)育所需總積溫為1 856～2 108 ℃·h，相比野生施氏鱘子代胚胎發(fā)育[8]所需積溫略高。本試驗(yàn)中，雜交鱘123 h開始孵出仔魚，155 h基本全部孵出，整個(gè)過程所需總積溫為2 102～2 445 ℃·h，低于西伯利亞鱘[10]和匙吻鱘Polyodonspathula[22]，高于施氏鱘(本試驗(yàn))、雜交鱘A.schrenckii♀×A.baeri♂[15]、中華鱘A.sinensis[23]、達(dá)氏鱘A.dabryanus[24]、閃光鱘A.stellatus[25]和小體鱘A.ruthenus[26]，與母本達(dá)氏鰉[16](2 148～2 592 ℃·h)相近，再次表明雜交鱘呈現(xiàn)偏母遺傳特征。

表4 幾種鱘類及雜交種胚胎發(fā)育比較

除鱘科魚類外，許多雜交魚類也具這種特性，如雜交鱒(虹鱒Oncorhynchusmykiss♀×山女鱒O.masou♂)[27]及翹嘴鱖Sinipercachuatsi與斑鱖S.schezeri[28]正反交雜交子代胚胎發(fā)育積溫也與母本相當(dāng)，說明卵細(xì)胞對(duì)胚胎發(fā)育所需積溫也具有決定性影響。

4 結(jié)論

1)本試驗(yàn)條件下，雜交鱘卵平均受精率為82.9%，平均孵化率為70.44%，施氏鱘卵平均受精率為82.2%，平均孵化率為63.20%。這說明雜交鱘達(dá)氏鰉♀×施氏鱘♂繁殖效率較父本高效。

2)水溫16～17 ℃條件下，雜交鱘經(jīng)123～155 h孵化出膜，總積溫需2 102～2 445 ℃·h，同等條件下，施氏鱘經(jīng)116～138 h孵化出膜，總積溫需1 856～2 108 ℃·h。這說明雜交鱘胚胎發(fā)育積溫較其父本長(zhǎng)，與母本接近。

3)雜交鱘的胚胎發(fā)育分9個(gè)階段32個(gè)時(shí)期，而施氏鱘胚胎發(fā)育分9個(gè)階段28個(gè)時(shí)期。雜交鱘和施氏鱘典型的區(qū)別是胚胎發(fā)育至心臟形成搏動(dòng)期時(shí)，雜交鱘的心管呈“C”型，而施氏鱘的心管則成“S”型；二者的差異還表現(xiàn)在心臟開始規(guī)律搏動(dòng)時(shí)，雜交鱘胚胎尾末端已接近心臟，而施氏鱘還未接近心臟，出膜前期雜交鱘仔魚尾末端超過頭部，而施氏鱘剛達(dá)到或略超過頭部。這說明雜交鱘與其父本胚胎發(fā)育既有相似之處又有不同點(diǎn)。雜交鱘胚胎發(fā)育所需積溫介于父本施氏鱘和母本達(dá)氏鰉之間，但更接近于母本達(dá)氏鰉，在胚胎發(fā)育和積溫等方面，雜交鱘呈現(xiàn)偏母遺傳特征。