劉子嶷，李凱揚，王 鵬，李文韜，周祖陽，孫小勇，劉玉芳*

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056001；2.北京市畜牧總站，北京 100107；3.北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，北京 100191）

豬作為常見實驗動物模型，具有高繁殖潛力和維護成本低的特點[1]。卵母細胞體外成熟培養(yǎng)（IVM）作為產生豬胚胎的方式之一在生物醫(yī)學和農業(yè)應用中越來越重要[2-4]。IVM 通過判斷第一極體排出作為篩選成熟卵母細胞的主要標志[5]。此外，卵母細胞的發(fā)育離不開卵丘細胞，卵丘細胞在卵母細胞生長和成熟過程不斷提供營養(yǎng)，并介導激素對卵丘-卵母細胞復合體（COCs）產生影響[6-7]。卵丘擴張在卵母細胞成熟過程中也起著重要作用，卵丘越擴張說明卵母細胞發(fā)育潛力越大[8]。卵母細胞成熟過程中胞核和胞質的變化是顯示卵母細胞發(fā)育能力的關鍵，卵母細胞內谷胱甘肽（GSH）含量也被用作細胞質成熟的指標，較高的GSH 水平與原核形成呈正相關[9-10]。以往研究者進行了大量試驗來提高豬卵母細胞體外成熟率，如在成熟培養(yǎng)液中添加不同成分以促進其發(fā)育成熟[4,11-13]。

研究發(fā)現(xiàn)，胰島素和胰島素樣生長因子（IGFs）等多肽生長因子參與卵巢的生理功能，發(fā)揮積極作用[14-15]。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）是一種結構和功能上與胰島素密切相關的單鏈血清肽[16]，可促進細胞增殖、芳香化酶活性和孕酮生物合成[17]。研究發(fā)現(xiàn)IGF-1 可由豬卵泡和顆粒細胞釋放，培養(yǎng)基中添加IGF-1 可刺激豬卵母細胞的減數(shù)分裂和體外成熟[18]。研究證明，在豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度IGF-1（10～80 ng/mL）均可以促進細胞核成熟[19]。另有研究報道，較大直徑卵泡內的卵母細胞體外成熟率較高，且能提供較好的體外胚胎[20]。為深入了解IGF-1 對豬卵母細胞體外培養(yǎng)成熟率的影響，本研究評估了IGF-1對豬不同直徑卵泡中卵母細胞IVM 的影響，并檢測了卵母細胞中谷胱甘肽（GSH）和活性氧（ROS）含量，以期探究添加外源IGF-1 對3 種直徑卵泡卵母細胞成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及培養(yǎng)液的配置

1.1.1 主要試劑 氯化鈉（NaCl）、牛血清白蛋白（BSA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、葡萄糖（D-Glucose）、聚乙烯醇（PVA）、卵泡刺激素（FSH）、促黃體生成素（LH）、丙酮酸鈉（Na-Pyruvate）青霉素、鏈霉素均購自Sigma 公司（美國），表皮細胞生長因子（EGF）、IGF-1 均購自Novoprotein 公司（上海），透明質酸酶、石蠟油、多聚甲醛均購自Solarbio公司（北京），Medium 199 購自Gibco 公司（美國），Hochest 33342 購自Invitrogen 公司（美國）。

1.1.2 培養(yǎng)液的配置 洗卵液：3.3315 g NaCl+1.5 g BSA+1.1915 g Hepes+0.084 g NaHCO3，徹底溶解于滅菌純化水。

成熟培養(yǎng)基礎液：0.015 g NaHCO3+0.0275 gDGlucose+0.005 g Na-Pyruvate+0.05 g PVA+0.033 g 青霉素+0.025g 鏈霉素，徹底溶解于50 mL Medium199。

成熟培養(yǎng)工作液：基礎液+4.4 μL FSH+4.4 μL LH+4 μL EGF+400 μL 豬卵泡液。

將配好的成熟培養(yǎng)工作液過濾后加入到四孔板中，每孔700 μL，覆蓋石蠟油。置于39℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱平衡2 h。100 μL 成熟培養(yǎng)工作液制作洗滴并用石蠟油覆蓋，放培養(yǎng)箱平衡2 h。每個滴20～30個COCs，每個孔50 個COCs。

1.2 卵巢采集及處理 于屠宰場收集豬卵巢置于保溫桶中，浸泡于30～38℃含雙抗（青、鏈霉素）的滅菌生理鹽水中，4 h 內送回實驗室。用加入雙抗的37℃生理鹽水沖洗卵巢3～5 次，剪去卵巢上多余的結締組織。

1.3 卵母細胞收集 按照卵泡直徑分別收集2～3、3～5 mm和5～8 mm 3 組COCs，用注射器分別抽取卵泡液置于滅菌離心管中，37℃靜置15 min 至細胞沉淀，用抽卵針在顯微鏡下按照分組分別挑出胞質完整均勻且卵丘在3～5 層的COCs，用洗卵液洗3 遍。

1.4 卵母細胞成熟培養(yǎng) 挑選符合要求的COCs 在預熱的洗滴中洗3 遍，最后轉入四孔板中。在39℃，5%CO2，飽和濕度下體外培養(yǎng)卵母細胞成熟，48 h 后統(tǒng)計卵丘擴散率。再將細胞移至0.2%透明質酸酶中脫去卵丘細胞，裸卵用4%多聚甲醛固定1 h 后PBS 洗3 遍，用Hochest 33342 避光染色5 min，再用PBS 洗3 次后，顯微鏡下觀察統(tǒng)計第一極體的排出率。

1.5 實驗設計

1.5.1 IGF-1 對卵母細胞成熟的影響 在成熟培養(yǎng)工作液的基礎上+30 ng/mL IGF-1 進行體外培養(yǎng)，設置對照組，統(tǒng)計其卵丘擴展率和第一極體排出率，判定添加IGF-1 能否影響豬卵母細胞成熟率。

1.5.2 IGF-1 對不同直徑卵母細胞成熟的影響 根據(jù)不同直徑卵泡（2～3、3～5 mm 和5～8 mm）進行分組，分別添加IGF-1 的成熟培養(yǎng)工作液進行體外培養(yǎng)，統(tǒng)計其卵丘擴展率和第一極體排出率，判定IGF-1 是否影響不同直徑卵泡卵母細胞的成熟。

1.6 卵母細胞中GSH 的檢測 在成熟培養(yǎng)的44 h 取COCs，用0.2% 透明質酸酶去除卵丘細胞，采用碧云天試劑盒S0052（碧云天生物技術有限公司，北京）對卵母細胞中GSH 的含量進行檢測。每組30 枚卵母細胞移入新鮮配制的10 μL 蛋白去除試劑M 中，在液氮和37℃水浴鍋中反復凍融3 次，使用酶標儀進行標準品與樣品吸光值的檢測。采用動力學測定法繪制標準曲線：取某一濃度GSH 的標準樣品與GSH 檢測工作液混合，測定405 nm 處樣品吸光值。以不同GSH 標準濃度為橫坐標x，以與其對應濃度下OD412 吸光值為縱坐標y，繪制標準曲線，據(jù)曲線方程計算卵母細胞中GSH 含量。所有實驗重復3 次，顯示的數(shù)值為平均值±標準誤。

1.7 卵母細胞中ROS 的檢測 在成熟培養(yǎng)的44 h 后取COCs，用0.2%透明質酸酶去除卵丘細胞，根據(jù)碧云天S0033 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，北京）說明，按照1:1000 用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 mol/L。將卵母細胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA 中，置于37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。每隔5 min 顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用ROS 陽性對照刺激細胞30 min。使用488 nm激發(fā)波長，525 nm 發(fā)射波長，檢測刺激前后熒光的強弱，用Image J 進行分析。所有實驗重復3 次，顯示的數(shù)值為平均值±標準誤

1.8 統(tǒng)計分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件通過卡方檢驗進行差異顯著性檢驗，使用LSD 法和Duncan's 法進行多重比較。結果以平均值± 標準誤表示，P＞0.05 為差異不顯著，P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 卵母細胞體外成熟培養(yǎng) 經過44 h 體外成熟培養(yǎng)，大部分COCs 擴展面積明顯增大（圖1）。在IVM 前形態(tài)較好的卵母細胞，其周圍卵丘細胞排列緊密，整個卵母細胞被卵丘細胞完全包裹。IVM 過程中COCs 逐步伸展，卵丘細胞之間的間隙變大，卵母細胞中央生發(fā)泡發(fā)生破裂，IVM 后44 h COCs 變得更加舒展，用0.2%透明質酸酶處理后得到卵母細胞，用顯微鏡觀察到卵母細胞卵周間隙中第一極體（PbI）的排出（圖2）。

圖1 3～5 層卵丘的COC（左）與培養(yǎng)44 h 卵丘擴展的COC（右）

圖2 卵母細胞第一極體排出

2.2 IGF-1 對卵母細胞體外成熟的影響 COC 體外成熟培養(yǎng)44 h 后，觀察到卵丘層大部分擴展且面積變?yōu)槌跏? 倍左右大小，可說明該COC 整體擴展效果較好[21]。結果發(fā)現(xiàn)，添加IGF-1 組COC 擴展數(shù)為356 個，擴展率為92.0%；對照組有295 個擴展，擴展率為87.5%，添加組的擴展率高于對照組（P＜0.05）。從第一極體排出情況來看，添加組排出數(shù)為152，對照組排出數(shù)為108，添加IGF-1 和對照組的第一極體排出率分別為39.3%和32.0%（P＜0.05）（表1）。

表1 添加IGF-1 進行卵母細胞體外培養(yǎng)的卵丘擴展數(shù)和第一極體排出數(shù)

2.3 IGF-1 對豬不同直徑卵泡中卵母細胞成熟的影響添加IGF-1 成熟培養(yǎng)組中卵丘細胞擴展率為3～5 mm 組＞5～8 mm 組＞2～3 mm 組（P＞0.05），第一極體排出率為3～5mm 組＞5～8 mm 組＞2～3 mm 組（P＜0.05）（表2）。

表2 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外培養(yǎng)中添加IGF-1卵丘擴展率和第一極體排出率

將337 個未添加外源IGF-1 的COC 也分別按照3種卵泡直徑進行體外成熟培養(yǎng)，設置為對照組，結果如表3 所示，5～8 mm 組卵丘擴展率最高（89.9%），其次是3～5 mm 組（89.3%），2～3 mm 組最低（82.1%）且與上述2 組間差異顯著，但3～5 mm 和5～8 mm 差異不顯著。5～8 mm 組第一極體排出率最高（40.8%），其次是3～5 mm 組（34.5%），最低是2～3 mm 組（18.9%），3 組間差異顯著。添加組3～5 mm 的卵丘擴展率和第一極體排出率為最高。

表3 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外培養(yǎng)中未添加IGF-1卵丘擴展率和第一極體排出率

2.4 GSH 含量檢測 按照總谷胱甘肽試劑盒說明書操作，先用GSH 標準品繪制標準曲線（圖3），以總谷胱甘肽標準品含量為橫坐標x，405 nm 吸光值為縱坐標y，繪制標準曲線，得出方程y=0.1354x+0.1195，其中R2=0.998 7～0.990 0，吻合程度較高。

圖3 GSH 標準曲線

如表4 所示，與對照組相比，添加IGF-1 組GSH含量較高（P＜0.05）。由表5 可知，添加IGF-1 組中各直徑卵母細胞GSH 含量為5～8 mm 組與3～5 mm 組顯著高于2～3 mm 組，前2 組間無顯著差異。

表4 添加IGF-1 和對照組卵母細胞體外成熟培養(yǎng)44 h 測定GSH 含量

表5 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液添加IGF-1 的GSH 含量

由表6 可知，未添加IGF-1 組中，3 種直徑卵泡來源卵母細胞在培養(yǎng)44 h 后GSH 含量差異不顯著。

表6 豬不同直徑卵泡卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液未添加IGF-1 的GSH 含量

2.5 卵母細胞ROS 的檢測 如表7 所示，在添加IGF-1組中，5～8 mm 卵泡卵母細胞體外培養(yǎng)，其ROS 平均熒光強度為0.201，而2～3 mm 的熒光強度最高為0.376。3～5 mm 和5～8 mm 組間差異不顯著，但與2～3 mm 組差異顯著。如表8 所示，3 種直徑卵泡來源卵母細胞在培養(yǎng)44 h 后ROS 熒光強度差異不顯著。

表7 豬不同直徑卵泡中卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液添加IGF-1 的ROS 熒光強度

表8 豬不同直徑卵泡中卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液未添加IGF-1 的ROS 熒光強度

3 討 論

生長因子在卵母細胞成熟和卵泡發(fā)育過程中起重要作用，它們可能是促進卵泡內卵母細胞成熟的決定性因素[22]。IGF-1 在體內協(xié)同促性腺激素，類固醇激素和其他的分子調節(jié)卵泡發(fā)育，同時IGF-1 也能促進卵母細胞體外核成熟，這一結果有助于詮釋調節(jié)卵母細胞體外成熟的因子的作用機制[23]。Sato 等[24]證實了添加IGF-1對犬卵母細胞成熟率和卵丘擴張有積極的影響，但是需要較高水平的IGF-1（50 μg/mL）。在牛卵母細胞發(fā)育相關研究中發(fā)現(xiàn)，IGF-1（100 ng/mL）已被證明能刺激牛卵母細胞的卵丘擴張和核成熟[25]。卵丘擴張是反映卵母細胞成熟以及隨后的發(fā)育能力的一個指標[26]。本研究通過對第一極體排出、GSH 含量測定分析，發(fā)現(xiàn)添加IGF-1 后對豬卵母細胞體外成熟率顯著優(yōu)于未添加組，表明添加IGF-1 可以促進豬卵母細胞體外成熟。

在哺乳動物的研究中，卵泡大小對卵母細胞成熟、排卵及人工授精具有重要意義[27]。目前，用于體外胚胎研究的卵母細胞通常取自直徑3～6 mm 卵泡，但卵巢中存在大量直徑小于3 mm 的卵泡[28]。為獲得小于3 mm 卵泡卵母細胞體外成熟情況，Yoon 等[29]研究發(fā)現(xiàn)直徑小于3 mm 的豬卵泡卵母細胞體外發(fā)育能力明顯弱于直徑大于3 mm 的卵泡。本研究統(tǒng)計了添加IGF-1 體外成熟44 h 后不同直徑的成熟率，發(fā)現(xiàn)直徑為3～5 mm的COCs 卵丘擴展率顯著比2～3 mm 和5～8 mm 高，第一極體排出率最高為3～5 mm（46.9%），證明添加外源IGF-1 后3～5 mm 卵泡卵母細胞成熟率較高。

卵母細胞生長發(fā)育過程中活性氧的產生會導致DNA損傷和線粒體功能障礙，影響卵母細胞的發(fā)育[30-31]。而在IVM 過程中，ROS 產生量比體內成熟的產生量多，過多的ROS 會使卵母細胞退化，影響成熟效率，而GSH 可保護細胞免受ROS 損害[32]。GSH 在卵母細胞體外成熟過程中協(xié)助卵母細胞抵抗氧壓力，參與氨基酸轉運，為蛋白合成提供原料，保障DNA 和蛋白合成所需的能量、協(xié)助微管合成，影響紡錘體的形態(tài)，在卵母細胞中起到重要作用[33]。因此，卵母細胞內GSH 含量也是衡量卵母細胞成熟質量的關鍵指標[34]。本研究中添加組5～8mm 卵泡COCs 中GSH 含量最高，但僅與2～3 mm 組差異顯著，而未添加組的3 種直徑間差異不顯著。檢測ROS 結果可知，添加組5～8 mm 平均熒光強度最低，而2～3 mm 的熒光強度最高，5～8 mm 與2～3 mm 組差異顯著，但與3～5 mm 差異不顯著。未添加組中三種直徑間ROS 差異不顯著。

4 小 結

綜上所述，經過對豬不同直徑卵泡中COCs 44 h 體外成熟培養(yǎng)，比較卵丘擴展、第一極體、GSH 和ROS含量來看，添加IGF-1 使3～5 mm 卵泡卵丘擴展率和第一極體排出率增高。同時添加組3～5 mm 和5～8 mm 中GSH 顯著降低了卵母細胞ROS 水平，改善卵母細胞氧化還原狀態(tài)。