周佳，彭艷，陳信波*

高溫脅迫下不同耐熱性水稻品種的差異表達基因分析

周佳1,2，彭艷2，陳信波1,2*

(1.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

以耐熱水稻品種996和熱敏感水稻品種4628為材料，提取2個水稻品種在40 ℃高溫處理0、10、20、60 min和2 h的5～6期幼穗中的RNA進行微陣列分析。結果表明：高溫脅迫下2個不同耐熱性品種的差異表達基因顯著富集在苯丙烷生物合成、熱休克蛋白、四肽重復以及一些與非生物脅迫相關的過程；耐熱型水稻品種996的差異表達基因還顯著富集于細胞色素P450，而熱敏感水稻品種4628的差異表達基因顯著富集到五肽重復；對高溫脅迫下具有品種特異性表達的基因進行分析，推測可能是細胞色素P450家族基因的差異表達提高了耐熱水稻996的耐熱能力，基因的存在影響了熱敏感水稻4628的抗逆性。

水稻；高溫脅迫；耐熱；熱敏感；差異表達基因

高溫(超過35 ℃以上)是影響水稻產(chǎn)量和質量的重要因素，對水稻生殖生長影響顯著[1]。據(jù)國際水稻所研究，在水稻生長的環(huán)境敏感期和敏感溫度范圍，溫度每升高1 ℃，產(chǎn)量損失10%以上[2]。長江中下游地區(qū)水稻常常在抽穗開花前后一段時期內遭遇持續(xù)高溫，導致水稻花器官發(fā)育不良、授粉行為障礙、籽粒灌漿不飽滿、結實率下降、水稻大幅度減產(chǎn)[3]。此外，高溫還會引起淀粉糊化特性(糊化溫度、峰值黏度、保持黏度、最終黏度等)發(fā)生改變，導致稻米品質變劣[4–5]。

隨著工業(yè)進程化的加快以及溫室效應的加劇，高溫熱害已經(jīng)成為水稻生產(chǎn)的主要非生物脅迫之一。本研究中，以耐熱水稻品種996和熱敏感品種4628為材料，研究40 ℃高溫處理對水稻幼穗基因表達的影響，并對差異表達的基因進行功能富集分析，旨在為耐熱相關基因的篩選、鑒定以及耐熱機理的研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　供試水稻材料

耐熱型水稻品種996、熱敏感品種4628由湖南農業(yè)大學水稻研究所提供。

1.2　方法

1.2.1 高溫脅迫處理

2個水稻品種在湖南農業(yè)大學試驗田生長至孕穗期后，將生長基本一致的水稻移至實驗室的培養(yǎng)箱中，在溫度為32 ℃/28 ℃(白天/夜晚)、相對濕度80%、光照強度為600 μmol/(m2·s)的培養(yǎng)箱內預培養(yǎng)1 d，然后在40 ℃、相對濕度80%、光照強度600 μmol/(m2·s)的條件下處理10、20、60 min和2 h，取經(jīng)高溫處理的發(fā)育至5～6期的主穗中部的小花，混合后液氮速凍，–80 ℃保存，以備微陣列分析。

1.2.2基因芯片試驗

試驗材料為–80 ℃保存的經(jīng)高溫脅迫處理的幼穗，以未經(jīng)高溫處理的材料為對照。所用基因芯片為4×44 k 安捷倫寡核苷酸水稻芯片。試驗在上海生物芯片有限公司進行。試驗過程包括總RNA抽提、質量檢測和定量、逆轉錄、標記、芯片雜交、洗脫、掃描以及對雜交信號值進行扣本底、標準化。

1.2.3差異表達基因分析

采用GEO2R軟件比較分析2個水稻品種未處理組(對照組)數(shù)據(jù)和高溫處理(實驗組)數(shù)據(jù)，篩選差異表達基因。將4個時間點中有2個或2個以上時間點高溫處理表達變化滿足倍數(shù)變化(fold change, FC)大于2或小于0.5的基因定義為差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.2.4基因的功能富集分析

為分析差異表達基因的功能，運用生物信息學工具Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) v6.8(https://david. ncifcrf.gov/)進行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析、INTERPRO蛋白結構域富集分析等。選取錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于0.05的術語(terms)用于基因的功能分析。

1.2.5維恩分析

采用在線工具venny 2.1 (https://bioinfogp.cnb. csic.es/tools/venny/) 編制Venn圖。

2　結果與分析

2.1　高溫脅迫下2個水稻品種的基因表達

高溫脅迫下，從耐熱品種996中鑒定出3113個DEGs，從熱敏感品種4628中鑒定出7297個DEGs(圖1)。高溫脅迫下，熱敏感品種差異表達基因比耐熱品種多，可能是因為熱敏感品種對高溫更敏感，進而觸發(fā)級聯(lián)反應，致使更多基因差異表達。

“↑”和“↓”分別表示高溫脅迫下基因表達上調和下調。

2.2　高溫脅迫下2個水稻品種DEGs的功能富集分析

2.2.1DEGs的GO富集分析

從圖2可以看出，高溫脅迫下，耐熱品種996的DEGs主要富集到22個GO terms，包括6個生物過程(biological process，BP)，4個細胞組分(cellular component，CC)及12個分子功能(molecular function，MF)。GO富集分析表明，這6個生物過程為熱響應、次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳水化合物代謝、幾丁質分解代謝、毒素分解代謝、草酸代謝；在細胞組分中，質外體、胞外區(qū)、膜和細胞壁的DEGs最為顯著；分子功能中，富集基因較多的為血紅素結合、轉錄因子活性的序列特異性DNA結合、鐵離子結合，各有104、94、77個差異表達基因。高溫脅迫下，熱敏感品種4628的DEGs主要富集到5個GO terms，包括2個生物過程和3個細胞組分，沒有顯著富集的分子功能。

圖2　高溫脅迫下耐熱型、熱敏感型水稻DEGs的GO terms

2.2.2DEGs的KEGG通路富集分析

從表1可以看出，耐熱品種996的DEGs主要富集在4條KEGG通路，富集基因最多的是內質網(wǎng)中的蛋白質加工，為62個。熱敏感品種4628的DEGs主要富集在7條KEGG通路，其中代謝途徑富集的基因最多，為504個。2個品種的DEGs都顯著富集到苯丙烷生物合成。

表1　高溫脅迫下2個不同耐熱性水稻品種DEGs富集的KEGG通路

2.2.3DEGs的INTERPRO蛋白結構域分析

為了識別品種996與品種4628 DEGs蛋白結構域的特征，采用DAVID在線工具進行INTERPRO蛋白結構域的富集分析。結果(圖3)表明，品種996 DEGs主要富集到20個蛋白質結構域。富集基因排在前5的蛋白結構域有細胞色素P450、細胞色素P450的E類I組、細胞色素P450的保守位點、糖苷水解酶超家族、糖苷水解酶的催化結構域，分別為69、64、62、62、56個。品種4628 DEGs主要富集到類HSP20分子伴侶、α–晶體蛋白/Hsp20結構域、五肽重復、糖苷水解酶超家族、糖苷水解酶的催化結構域等5個蛋白質結構域。

圖3 高溫脅迫下2個水稻品種DEGs的INTERPRO蛋白結構域富集分析結果

2.3　高溫脅迫下2個水稻品種中差異表達一致基因的功能富集分析

選取2個品種在高溫處理差異表達一致的基因(314個)進行富集分析。GO富集分析結果(圖4)表明，2個品種差異表達一致的基因主要富集到5個基本生物學過程，沒有顯著富集的細胞組分和分子功能。在KEGG富集分析中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下2個品種差異表達一致的基因主要富集在1條通路，即內質網(wǎng)中的蛋白質加工。INTERPRO蛋白結構域富集分析結果(圖4)表明，2個品種差異表達一致的基因富集到8個蛋白質結構域，主要為熱休克蛋白和四肽重復相關的蛋白結構域。

圖4　高溫脅迫下2個水稻品種差異表達一致基因的功能富集分析結果

2.4　高溫脅迫下2個水稻品種中差異表達相反的基因功能富集分析

選取了2個品種在高溫處理差異表達相反的基因(在品種4628表達上調而在品種996表達下調的429個；在品種996表達上調而在品種4628表達下調的149個)進行富集分析。GO富集分析結果(圖5)表明，在品種4628表達上調而在品種996表達下調的基因主要富集到6個GO terms，包括1個生物過程、1個細胞組分及4個分子功能；在品種996表達上調而在品種4628表達下調的基因沒有顯著富集到生物過程、細胞組分及分子功能。在本GO富集分析中，所富集到的基因在草酸鹽代謝過程、草酸脫羧酶活性部分和錳離子結合部分完全一致，均為基因。

在KEGG通路富集分析(圖5)中發(fā)現(xiàn)，在品種4628表達上調而在品種996表達下調的基因主要富集在4條KEGG通路，富集基因最多的是代謝途徑，為53個。對在品種4628表達下調而在品種996表達上調的基因進行富集分析后，發(fā)現(xiàn)只有1條KEGG通路，即內質網(wǎng)中的蛋白質加工。

INTERPRO蛋白結構域分析結果(圖5)表明，在品種4628表達上調而在品種996表達下調的基因主要富集到6個蛋白質結構域，前2位顯著富集的蛋白結構域為糖苷水解酶的超家族和糖苷水解酶的催化結構域，這2個蛋白結構域富集的基因數(shù)量較多，分別為20和17。在品種996表達上調而在品種4628表達下調的基因沒有顯著富集到INTERPRO蛋白結構域。在本INTERPRO蛋白結構域富集分析中，萌發(fā)素的錳結合位點、萌發(fā)素以及Cupin超家族蛋白所富集的基因一致，均為基因。

“↑”和“↓”分別表示高溫脅迫下基因表達上調和下調。

2.5　高溫脅迫下具有品種特異性表達的基因

對2個品種DEGs的功能進行富集分析發(fā)現(xiàn)，耐熱型水稻996 DEGs蛋白結構域富集到細胞色素P450、細胞色素P450的E類I組、細胞色素P450保守位點的基因基本一致，包括LOC_Os09g28390 ()、LOC_Os02g36150()、LOC_Os 02g36190()、LOC_Os02g36070()、LOC_Os04g48170()、LOC_Os05g40384 ()等。其中在高溫脅迫下表達上調，、、、在高溫脅迫下表達下調。熱敏感水稻4628 DEGs顯著富集在五肽重復，包括LOC_Os09g24680 ()、LOC_Os12g17080()等。其中在高溫脅迫下表達上調，在高溫脅迫下表達下調。品種4628顯著富集于草酸鹽代謝過程、草酸脫羧酶活性、錳離子結合、萌發(fā)素的相關基因在高溫脅迫下特異上調，這些基因包括LOC_Os08g08980 ()、LOC_Os08g08960 ()、LOC_Os01g18170 ()、LOC_Os08g3576 0()、LOC_Os08g09000 ()、LOC_Os03g589 80()等。

3　結論與討論

本研究中，通過對高溫脅迫下2個水稻品種的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)耐熱水稻品種996與熱敏感水稻品種4628的DEGs均顯著富集在一些基本的或者與脅迫密切相關的生物學過程、代謝途徑以及蛋白結構域。苯丙烷代謝有多個分支，可產(chǎn)生包括木質素、類黃酮、木脂素、類苯丙酸酯、羥基肉桂酸酰胺和單寧的前體在內的代謝物[6]。維管植物需要木質素為細胞壁提供機械支持，使得植物能夠長得更高[7]。研究[8–9]發(fā)現(xiàn)，木質素有助于植物對各種非生物脅迫的響應；類黃酮可減少由非生物脅迫引起的ROS積累造成的氧化損傷[10]。熱休克蛋白(HSP)通常起分子伴侶的作用，根據(jù)其相對分子質量大小和序列同源性可分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小熱休克蛋白sHsp(如Hsp40、Hsp20)。Hsp90可能對非生物脅迫具有直接的保護能力，并在信號轉導中發(fā)揮作用[11–14]。Hsp70蛋白可增強植物對熱和其他非生物脅迫的耐受性[15]。研究[16]表明，線粒體Hsp70可通過調控ROS含量來抑制水稻原生質體中的細胞編程性死亡。植物中含量最多的一類熱休克蛋白為小熱休克蛋白(sHsp)，它能防止熱誘導的蛋白質聚集，防止蛋白的變性以及不可逆的沉淀，促進變性蛋白正確的重折疊[17]。熱休克蛋白表達的誘導是對非生物脅迫的最佳反應之一[18–20]。四肽重復與水稻抗性有關[21]，且與伴侶蛋白有特定的相互作用。有研究[22]報道，基因的重復和基因的啟動子區(qū)TFBs (transcription factor binding sites)的后續(xù)變異可能是基因及其啟動子對水稻生物和非生物脅迫耐受性的新功能化的結果。

耐熱型水稻996 的DEGs顯著富集在細胞色素P450。基因在控制水稻脫落酸水平和非生物脅迫中起重要作用[23]。本研究中，在高溫脅迫下表達上調，說明其可能是提高水稻耐高溫性的關鍵基因。CYP87A3蛋白可能是生長素對生長反應的負調控因子，應用生長素可快速誘導的表達[24]。本研究中，在高溫脅迫下表達下調，說明其可能不利于水稻開花。催化ent–異貝殼杉烯的C2–羥基化，催化ent–卡薩二烯的C2–羥基化[25]。是一種多功能/混雜羥化酶，可催化ent–卡薩–12，15–二烯的C11位羥基化[26](也稱)編碼細胞色素P450單加氧酶，該酶作為赤霉素失活酶，催化非13–羥基化GA的16α、17–環(huán)氧化[27]。本研究中，和在高溫脅迫下表達下調，說明它們可能在脅迫反應中起負調控作用。的啟動子區(qū)域包含多種順式作用元件，其中非生物脅迫響應元件包括ABRE(脫落酸響應元件)、TGACG–motif (MeJA響應元件)、ERE(乙烯響應元件)、LTR(低溫響應元件)、TATC/GARE(赤霉素響應元件)、TCA–Element(水楊酸響應元件)、MBS(干旱誘導響應元件)、TGA–Element(生長素響應元件)和AuxRR– Core(生長素響應元件)等[28]。推測耐熱水稻996可能是因為細胞色素P450家族基因的差異表達提高了其耐熱能力。

熱敏感水稻4628的DEGs顯著富集于五肽重復(PPR)。PPR蛋白在植物發(fā)育過程以及非生物脅迫反應中發(fā)揮重要作用，且基因可能在水稻對環(huán)境脅迫的反應中發(fā)揮作用[29]。保護RNA轉錄物免受核糖核酸酶降解[30]。本研究中，在高溫脅迫下表達上調，說明其可能在水稻非生物脅迫下發(fā)揮重要作用。水稻編碼一種含有DYW基序的五肽重復蛋白[31]，對線粒體中的RNA編輯至關重要。推測可能是基因在水稻耐熱性上發(fā)揮了特定作用，可見2個品種的不同耐熱性是由不同基因的差異表達導致的。

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Analysis of differentially expressed genes in rice varieties with different heat tolerance under high temperature stress

ZHOU Jia1,2，PENG Yan2，CHEN Xinbo1,2*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China)

In this study, using heat tolerance line 996 and heat sensitive line 4628 as materials, we performed microarray analysis on the RNA extracted from the 5-6 stage young panicles of the two rice varieties treated with 40 ℃ for 0 min, 10 min, 20 min, 60 min and 2 h. The results showed that the differentially expressed genes of the two varieties were significantly enriched in phenylpropane biosynthesis, heat shock protein, tetratricopeptide repeat, and processes related to abiotic stress. In addition, heat tolerance line 996 differentially expressed genes were also significantly enriched in cytochrome P450. The heat sensitive rice 4628 differentially expressed genes were significantly enriched to pentatricopeptide repeat. With the results from this study, we could conclude that heat tolerance rice 996 may improve its own heat tolerance due to the differential expression of cytochrome P450 family genes, and heat sensitive rice 4628 may be due to the existence ofgene to affect its own stress resistance. The differentially expressed genes in the heat tolerance line 996 and heat sensitive line 4628-- provided information for further heat resistant gene identification and clarification of the heat resistant mechanism.

rice; high temperature stress; heat tolerance; heat sensitive; differentially expressed genes

周佳，彭艷，陳信波．高溫脅迫下不同耐熱性水稻品種的差異表達基因分析[J]．湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2022，48(5)：536–542．

ZHOU J，PENG Y，CHEN X B．Analysis of differentially expressed genes in rice varieties with different heat tolerance under high temperature stress[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(5)：536–542．

http://xb.hunau.edu.cn

S511; Q786

A

1007-1032(2022)05-0536-07

10.13331/j.cnki.jhau.2022.05.005

2021–12–01

2022–09–27

湖南省自然科學基金項目(2015JJ-3081)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目(CX2015B241)

周佳(1996—)，女，湖南邵陽人，碩士研究生，主要從事植物分子生物學研究，1010964041@qq.com；*通信作者，陳信波，博士，教授，主要從事植物分子生物學研究，xinbochen@live.cn

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正