劉 林， 張良英， 程貴蘭， 何 丹， 張力飛， 孟凡麗

( 遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院， 遼寧 營口 115009 )

報春花與杜鵑、龍膽并稱為“三大高山花卉”(王睿，2016)，因其花色豐富、花期多樣，具有極高的觀賞價值，而被廣泛應用于園林造景及人工栽培(周琳等，2020)。豐富的種質(zhì)資源是良種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)。我國的報春花屬(Primula)植物種類繁多，約有 300 種(Hu & Sylvia, 1996)，占全世界總數(shù)的 60%，資源分布量巨大。其中，云南、四川及西藏東南部等高山地區(qū)為我國報春花屬植物資源的分布與多樣化中心(劉淑娟，2014；吳興，2017；黎昌漢，2017)。然而，國內(nèi)現(xiàn)階段對該屬植物資源的研究和利用尚顯欠缺，亟須加強對我國報春花屬植物資源的調(diào)查研究，以充分發(fā)掘資源優(yōu)勢，為種質(zhì)資源的開發(fā)利用及新品種培育奠定基礎(chǔ)。

與植物的莖、葉等器官的表型特征相比，花粉形態(tài)具有較強的遺傳保守性，在植物系統(tǒng)分類、遺傳多樣性等方面具有積極的參考價值(王盼盼等，2016)。報春花屬植物的孢粉學特征可為種間及組間等分類階元的區(qū)分提供重要參考。Anderberg等(2000)對倒卵葉報春組(Sect.Carolinella)的7種植物研究認為，其在花粉形態(tài)特別是萌發(fā)孔的數(shù)量與分布上存在顯著的種間差異，組內(nèi)花粉形態(tài)多樣性豐富。報春花屬植物多數(shù)具有花柱二型性，而長、短花柱類型的花粉在形態(tài)特征上會存在一定差異，如黃花九輪草(P.veris)的不同花柱類型花粉在花粉大小、萌發(fā)溝數(shù)量等方面存在一定差異(Halbritter et al., 2018)。目前，國內(nèi)對報春花屬花粉形態(tài)的研究尚少，且主要集中于不同居群或花柱類型的花粉形態(tài)差異、毛茛葉報春組(Sect.Ranunculoides)的孢粉學分類意義等方面。徐叢云(2019)對安徽羽葉報春(Primulamerrilliana)32 個居群的花粉研究發(fā)現(xiàn)，該種存在多溝型與散孔型兩種花粉，推測其可能為包含2個(及以上)物種的復合體。對胭脂花(P.maximowiczii) 的7個居群進行孢粉學研究表明，由于長花柱類型的花粉性狀平均變異系數(shù)較小，因此比短花柱植株的性狀更為穩(wěn)定(邊曉萌等，2016)?，F(xiàn)有研究對報春花屬植物不同種間的孢粉學特征涉及較少，且缺乏對本屬植物不同種類花粉形態(tài)的詳細數(shù)據(jù)。

西藏是我國報春花資源的主要分布地之一，約有 115 種(鄭維列，1992)，許多為當?shù)靥赜蟹N(Hu & Sylvia, 1996)。但目前，對西藏報春花屬植物的研究、保護及利用相對不足(鄭維列，1992；張杰等，2017；劉林等，2018)。色季拉山地處藏東南半濕潤區(qū)與濕潤區(qū)的過渡地帶，海拔 2 100～5 200 m，垂直落差大，蘊藏著豐富的植物資源。報春屬植物在該區(qū)域有 12 種及變種，主要分布于海拔 3 000 m 以上地帶(鄭維列，1992)，其中不少為當?shù)靥赜蟹N。

該研究以西藏色季拉山為研究區(qū)域，依托該地區(qū)豐富的特色報春花屬植物資源，調(diào)查和收集了10種報春花粉，采用掃描電鏡技術(shù)，通過觀測、比較不同種類的花粉形態(tài)特征，并分析其親緣關(guān)系，擬探討以下問題：(1)通過研究供試10種報春花粉形態(tài)特征分析該區(qū)域的報春花粉與其他地區(qū)同屬或同組植物在花粉形態(tài)上的異同；(2)孢粉學特征在報春花屬植物分類和系統(tǒng)演化方面的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

10種報春花屬植物的花粉于 2017 年 4—6 月在色季拉山采集，其鑒定參考Hu和Sylvia(1996)的分類方法，供試 10 種報春具體信息見表1。對每種報春分別從 5 個單株上采集成熟且尚未散開的新鮮花藥，置于戊二醛保存液低溫保存，送西北農(nóng)林科技大學電鏡室掃描供試10種報春花粉，拍照。

表 1 供試材料的基本信息Table 1 The essential informations of the experimental materials

1.2 方法

將置入戊二醛溶液的花粉用 pH 值 6.8、濃度 0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液漂洗 5 次，每次10 min；依次用 30%、50%、70%、80%、90% 濃度的乙醇脫水 1 次，每次15 min；100% 濃度乙醇脫水3次，每次30 min；乙酸異戊酯置換 2 次，每次20 min；將花粉緊密包裹于濾紙中用 CO2臨界點干燥儀干燥。

用導電膠帶將處理后的花粉固定于樣品臺上，利用離子濺射儀噴金、掃描電鏡(S-4800)觀察、拍照。

測定供試花粉的極軸長(P)、赤道軸長(E)、萌發(fā)孔寬、網(wǎng)眼大小、網(wǎng)脊寬等數(shù)量指標，每種的樣本量為 20 粒?；ǚ哿Ｐ螤钜?P/E 值表示，表面紋飾的描述參考王伏雄等(1995)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

采用SPSS 22軟件進行多重比較與聚類分析。依據(jù)P/E、萌發(fā)孔寬、萌發(fā)溝數(shù)量、網(wǎng)眼寬、網(wǎng)脊寬、網(wǎng)眼寬/網(wǎng)脊寬6個數(shù)量指標，結(jié)合復合溝有無，將數(shù)據(jù)標準化處理后參考荊玲俠等(2020)的方法，采用組間連接與歐氏距離法對供試材料進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒大小及形狀

供試10 種報春中，寬裂掌葉報春、巨傘鐘報春、林芝報春、工布報春和折瓣雪山報春5種據(jù)記載為西藏特有種，而中甸燈臺報春是我國特有種。對 10 種報春花屬植物的花粉形態(tài)進行觀察，結(jié)果見圖1、圖2和表2。供試花粉均為單粒花粉，花粉粒較小，且不同種間的花粉粒大小存在顯著差異。其中，工布報春的花粉粒最小，平均極軸和赤道軸長分別為 7.07 μm × 8.32 μm；暗紫脆蒴報春的花粉粒最大，為 16.41 μm × 22.43 μm。

花粉形狀以 P/E 比值表示，P/E 在 0.88～1.14 之間，為近球形，0.50～0.88 為扁球形(王開發(fā)和王憲曾，1983)。供試 10 種報春中，中甸燈臺報春與西藏報春的 P/E 值相對較大，花粉粒外觀為近球形；其余 8 種報春的 P/E 值均在 0.50～0.88 之間，為扁球形，其中暗紫脆蒴報春和雜色鐘報春的 P/E 值最小，僅為 0.73。10 種報春單粒花粉極面觀多為鈍三角形或近圓形，赤道面觀多為扁球形、近球形。

2.2 花粉萌發(fā)溝

供試花粉的萌發(fā)孔類型可分為3 孔溝型與多溝型兩大類。其中，西藏報春為多溝型花粉，一般具 6 溝。由于其余 9 種花粉均為 3 孔溝型，且大部分花粉(中甸燈臺報春除外)的 3 溝均在極區(qū)匯合，形成復合溝(圖1，圖2)，因此對萌發(fā)溝長度的觀測較為困難，未進行測量。萌發(fā)溝的寬度與花粉大小存在一定的一致性，仍以暗紫脆蒴報春的萌發(fā)溝最寬(3.50 μm)，工布報春和西藏報春最窄,分別為 0.49、0.53 μm。

A(A1-A3). 寬裂掌葉報春; B(B1-B3). 暗紫脆蒴報春; C(C1-C3). 中甸燈臺報春; D(D1-D3). 雜色鐘報春; E(E1-E3). 巨傘鐘報春; F(F1-F3). 林芝報春。1和2分別為花粉粒極面觀和赤道面觀， 3為花粉表面紋飾。下同。A(A1-A3). P. latisecta; B(B1-B3). P. calderiana; C(C1-C3). P. chungensis; D(D1-D3). P. alpicola; E(E1-E3). P. florindae; F(F1-F3). P. ninguida. 1 and 2 represent the polar and equatorial view of pollen grains respectively, 3 represents the pollen exine sculpture. The same below.圖 1 6種報春花屬植物花粉形態(tài)的電鏡觀察Fig. 1 Pollen morphology of six Primula species by SEM

此外，雜色鐘報春、巨傘報春、林芝報春和白心球花報春4 種報春在電子顯微鏡下都捕捉到極少量的具 4 溝的花粉存在(圖2)。由于捕捉到的 4 溝花粉粒數(shù)量有限，因此其具體特點有待后續(xù)研究。

G(G1-G3). 折瓣雪山報春; H(H1-H3). 西藏報春; I(I1-I3). 工布報春; J(J1-J3). 白心球花報春。4為3種報春的4孔溝花粉極面觀。G(G1-G3). P. advena; H(H1-H3). P. tibetica; I(I1-I3). P. kongboensis; J(J1-J3). P. atrodentata. 4 represents stephanocolpate pollen of three Primula species. 圖 2 7種報春花屬植物花粉形態(tài)的電鏡觀察Fig. 2 Pollen morphology of seven Primula species by SEM

2.3 花粉紋飾形態(tài)特征

供試 10 種報春花粉粒外壁紋飾為網(wǎng)狀、穴狀，網(wǎng)眼形狀呈現(xiàn)為圓形、橢圓形及不規(guī)則形狀(表 2)。不同種間及同一種花粉粒外壁網(wǎng)眼大小不一，西藏報春網(wǎng)眼(0.82 μm)最大，白心球花報春(0.10 μm)最小，二者相差 0.72 μm。10 種報春的網(wǎng)脊寬不同，最大的西藏報春網(wǎng)脊寬為 0.33 μm，雜色鐘報春、巨傘鐘報春及白心球花報春網(wǎng)脊寬相對較小，分別為 0.14、 0.15、0.15 μm，最大與最小網(wǎng)脊寬之間僅相差 0.19 μm。因此認為，與網(wǎng)脊寬相比，報春花粉的網(wǎng)眼寬度在種間區(qū)別更明顯。

表 2 10 種報春花屬植物的花粉形態(tài)特征Table 2 Pollen morphological characters of 10 Primula species

2.4 基于花粉性狀的聚類分析

由聚類分析(圖3)可知，在輔助線 1(距離 3.5)處，鐘花報春組的雜色鐘報春與巨傘鐘報春花粉的大部分性狀較為接近，首先聚合，表明二者親緣關(guān)系較近；雪山報春組的林芝報春、折瓣雪山報春與指葉報春組的寬裂掌葉報春聚合；分屬粉報春組與球花報春組的工布報春與白心球花報春聚在一處。輔助線 2(遺傳距離約 14.0)將供試材料分為 2 個類群，其中粉報春組的西藏報春由于 P/E 值、網(wǎng)眼寬、網(wǎng)脊寬和網(wǎng)眼寬/網(wǎng)脊寬較大，萌發(fā)溝數(shù)量多、萌發(fā)溝較窄、無復合溝等特點，單獨聚為一類；而另一類群中，雖然中甸燈臺報春具備 P/E 值、網(wǎng)眼寬及網(wǎng)眼寬/網(wǎng)脊寬較大，無復合溝等與西藏報春花粉特征上的相似性，但二者卻未在輔助線 2 處聚在一起，而與另外 8 種報春聚為一類，表明二者之間萌發(fā)溝類型上的差異可能在聚類分析中起到更為重要的作用。

圖 3 10 種報春花屬植物花粉形態(tài)特征聚類圖Fig. 3 Clustering analysis of pollen morphological characteristics in 10 Primula species

3 討論

3.1 西藏 10 種報春花屬植物孢粉學特征

報春花屬植物的花粉一般以單粒形式存在，為扁球形、近球形至長球形?？傮w來看， 10種報春花的花粉粒大小存在一定差異，其中大部分花粉大小在 10～25 μm 之間，屬于小型花粉(王開發(fā)和王憲曾，1983)。而工布報春因極軸與赤道軸長均小于 10 μm，為極小型花粉。供試報春在不同種間的花粉大小均有所差異，但并未表現(xiàn)出組間的區(qū)別，這可能與供試種類的數(shù)量較少有一定關(guān)系。加之，考慮到花柱二型性對花粉大小的影響(劉小梅等，2015；邊曉萌等，2016)，花粉大小可能不宜作為組間或種間劃分的依據(jù)。

從花粉萌發(fā)溝類型來看，報春花屬大部分種類具 3 溝或 3 孔溝，有少部分報春花為多溝或散孔型花粉(Chen, 2009；徐叢云，2019)。除西藏報春外，供試報春一般為 3 萌發(fā)孔溝，且大部分種類的花粉萌發(fā)溝在極區(qū)匯合，形成復合溝，這一研究結(jié)果與前人研究結(jié)論相一致，故該區(qū)域的研究結(jié)果可以為本屬植物的分類提供參考。西藏報春的花粉由于萌發(fā)溝為多溝型，且網(wǎng)眼大小、網(wǎng)眼寬/網(wǎng)脊寬比值均較大，外壁紋飾為粗網(wǎng)狀等特點，因此與其余 9 種報春尤其是同為粉報春組的工布報春均存在較大差異，表明粉報春組花粉形態(tài)可能存在豐富的多樣性。目前，已知多溝型花粉主要發(fā)現(xiàn)于報春花屬的倒卵葉報春組、藏報春組、毛茛葉報春組和 Sect.Armerina等 5 個組(Anderberg et al., 2000；Shao et al., 2012)，而歐洲、北美將西藏報春歸為 Sect.Armerina(Hu & Sylvia, 1996)，這間接印證了西藏報春為多溝型花粉的結(jié)論。

根據(jù)花粉外壁紋飾類型，可將觀察的報春花屬植物歸納為穴狀和網(wǎng)狀兩種類型，網(wǎng)狀紋飾又分為細網(wǎng)與粗網(wǎng)狀兩種情況。其中，雜色鐘報春、工布報春與白心球花報春為穴狀紋飾， 其余為網(wǎng)狀紋飾；網(wǎng)狀紋飾中只有西藏報春和中甸燈臺報春為粗網(wǎng)狀類型。前人研究認為，花粉的外壁紋飾呈現(xiàn)出由簡單平滑向復雜類型演化的趨勢(Walker, 1974)。與外壁紋飾無穿孔的花粉相比，具穿孔的較進化，穿孔直徑與網(wǎng)脊寬度比值大的花粉進化程度更高。袁濤和王蓮英(1999)研究認為，野生牡丹的花粉表面紋飾演化順序大致為小穴狀—穴狀—網(wǎng)狀—粗網(wǎng)狀 4 個階段。這一觀點是否適用于報春屬植物尚有待于驗證。但是，若據(jù)此推測，西藏報春、中甸燈臺報春則相對較為進化，雜色鐘報春、工布報春與白心球花報春較為原始。而從萌發(fā)孔的演化順序來看，一般認為先由3溝到多溝、散溝型，再向散孔型演化(M. 溫坎坡和鄭卓，1990；徐叢云，2019)。由此可初步推斷，多溝型的西藏報春花粉可能是相對較為進化的一種類型，但準確的結(jié)論仍需進一步深入研究其系統(tǒng)發(fā)育才能得出。

3.2 花粉形態(tài)對研究報春花分類的意義

基于花粉形態(tài)的聚類分析與供試報春的植物學形態(tài)分類表現(xiàn)出一定的一致性。其中，鐘花報春組的雜色鐘報春與巨傘鐘報春花粉親緣關(guān)系較近。雪山報春組的林芝報春、折瓣雪山報春雖然具有較近的親緣關(guān)系，但與指葉報春組的寬裂掌葉報春未區(qū)分開。同屬粉報春組的工布報春和西藏報春則由于在孢粉學特征上的明顯差異，因此保持了相對較遠的親緣關(guān)系，這與粉報春組較為龐雜，可能不是自然類群的觀點類似(黎昌漢，2017)。

一般認為，花粉的形態(tài)結(jié)構(gòu)在屬、種間具有一定的保守性，可為植物分類及親緣關(guān)系分析提供重要佐證。但需要注意的是，花粉的部分形態(tài)特征易受居群、個體及地理環(huán)境等因素影響(顧欣和張延龍，2013)，具有其復雜性。因此，在利用孢粉學特征進行分類時，主要指標的選取往往十分關(guān)鍵。張碩等(2014)認為萌發(fā)溝的數(shù)量在鳳仙花種內(nèi)缺乏穩(wěn)定性，不宜作為該屬植物的分類依據(jù)。雖然也有研究表明，受花柱二型性、地理環(huán)境等因素影響，報春花的花粉形態(tài)在同一物種內(nèi)可能存在一定程度的變異，但其主要與花粉大小、外壁紋飾等有關(guān)(劉小梅等，2015；邊曉萌等，2016)。相對而言，報春花屬的萌發(fā)孔類型較為保守(劉小梅等，2015)，這與鳳仙花屬的研究恰恰相反，可能與不同屬的具體情況有關(guān)。

總之，供試10 種報春花屬植物的孢粉學特征存在一定的種間差異，對植物學分類有積極的參考價值，但植物分類是一門非常復雜的學科，分類過程中仍需結(jié)合形態(tài)學特征、分子生物學等多方面綜合考慮。