李昌亮，尚金鳳，廖正華，蔡立榮，易必新，馬曉寧*（.湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 4000；2.藥用輔料工程技術研究重點實驗室，長沙 4000；.天地恒一制藥股份有限公司，長沙 40）

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺是美國吉利德公司在富馬酸替諾福韋二吡呋酯基礎上所開發(fā)的新一代核苷類逆轉錄酶抑制劑（見圖1）。吉利德公司報道合成富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的工藝路線主要有兩條，一條是2001年報道的早期合成路線，一條是2012年報道的一種制備光學純替諾福韋艾拉酚胺的不對稱合成工藝[1-2]。兩條合成路線中均使用了L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽作為反應物，用量較大會有殘留[3-7]。富馬酸替諾福韋艾拉酚胺在放置過程中也可能降解產生L-丙氨酸異丙酯。檢索發(fā)現，L-丙氨酸異丙酯的檢測方法較少，雖然有報道高效液相色譜法檢測本品中的有關物質，但未將L-丙氨酸異丙酯作為特定雜質進行檢測[8]，尚未發(fā)現有采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測富馬酸替諾福韋艾拉酚胺中L-丙氨酸異丙酯含量的報道[9-12]。因此本研究建立一種液質聯(lián)用法測定富馬酸替諾福韋艾拉酚胺中的L-丙氨酸異丙酯含量，以保障藥品質量安全及滿足藥品監(jiān)管需要。

圖1 富馬酸替諾福韋艾拉酚胺（A）和L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽（B）的結構式Fig 1 Structural of tenofovir alafenamide fumarate（A）L-alanine isopropyl ester hydrochloride（B）

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 超高效液相色譜儀、Thermo TSQ Endura 三重四極桿質譜儀（美國賽默飛）；Mettler Toledo XP205 電子分析天平（美國梅特勒）。

1.2 試藥

富馬酸替諾福韋艾拉酚胺（批號：200501、200502、200601，含量：98.8%、99.2%、99.7%，天地恒一制藥股份有限公司）；L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽對照品（批號：1-WS-117-1，來源：TRC，純度：98%）；甲酸、乙腈均為色譜純；純化水為Thermo Scientific Barnstead Genpure 純化水系統(tǒng)制得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 3 C18-AR（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（見表1）；流速：0.4 mL·min－1；柱溫：40℃；進樣器溫度：10℃；進樣量：1 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2 質譜條件

離子源：ESI 源；檢測模式：正離子模式，多重反應監(jiān)測（MRM）；離子對：母離子m/z132，子離子m/z90、44；接口電壓為4.5 kV，接口溫度為300℃，DL 管溫度為180℃，加熱塊溫度為200℃，干燥器流速為5 L·min－1，m/z132/90 碰撞能量為16 V，m/z132/44 碰撞能量為16 V，碰撞氣體為高純氬氣。

2.3 溶液配制

2.3.1 空白溶劑 即稀釋劑，為20%乙腈水溶液。

2.3.2 供試品溶液 取富馬酸替諾福韋艾拉酚胺約15 mg，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加稀釋劑適量，超聲使溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 對照品溶液 取L-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽（分子量：167.6）對照品約15 mg，精密稱定，置200 mL 量瓶中，用稀釋劑適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液[L-丙氨酸異丙酯（分子量：131.1）質量濃度約為60 μg·mL－1]；精密量取對照品儲備液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑至刻度，搖勻，制成對照品溶液（L-丙氨酸異丙酯質量濃度約為0.6 μg·mL－1）。

2.4 專屬性

分別取空白溶劑、供試品溶液和對照品溶液進樣分析并記錄色譜圖，結果供試品溶液色譜圖中L-丙氨酸異丙酯的保留時間與對照品一致，空白溶劑無干擾，表明方法專屬性良好，見圖2。

圖2 L-丙氨酸異丙酯測定的典型色譜圖Fig 2 Typical chromatogram of L-alanine isopropyl ester

2.5 檢測限和定量限

精密移取“2.3.3”項下對照品溶液，逐級稀釋合適倍數后進樣，分別將信噪比（S/N）為3 和10 的質量濃度作為檢測限和定量限。結果L-丙氨酸異丙酯的檢測限為0.02 μg·mL－1，定量限為0.06 μg·mL－1。

2.6 線性關系考察

分別精密移取“2.3.3”項下對照品儲備液0.1、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL，置100 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，制得系列線性溶液。以L-丙氨酸異丙酯峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸計算，結果回歸方程為Y＝1.821×107X－1.568×105，r＝0.9994，線性范圍為0.06～1.19 μg·mL－1。

2.7 精密度

取“2.3.3”項下對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄L-丙氨酸異丙酯的峰面積和保留時間。結果顯示，L-丙氨酸異丙酯峰面積的RSD為1.5%，保留時間的RSD為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性和中間精密度

按“2.3.2”項下方法平行配制6 份供試品溶液，進樣測定，結果L-丙氨酸異丙酯含量的RSD為2.8%，表明方法重復性良好。不同分析人員在不同日期重復上述試驗，結果顯示兩人共12份重復性供試品溶液中L-丙氨酸異丙酯含量的RSD為2.9%，表明方法中間精密度良好。

2.9 回收試驗

精密稱取樣品9 份（批號：200501），每份約60 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，分別加入一定量對照品儲備液，制成L-丙氨酸異丙酯濃度相當于對照品溶液的50%、150%、200%的供試品加標溶液，進樣測定，結果L-丙氨酸異丙酯的回收率在102.3%～108.3%，RSD均＜2.0%。

2.10 穩(wěn)定性

取“2.3.2”項下供試品溶液和“2.3.3”項下對照品溶液，在10℃條件下放置，分別于0、2、4、6、10 和14 h 進樣分析，結果各溶液中L-丙氨酸異丙酯的峰面積RSD均小于5.5%，表明溶液在10 ℃條件下穩(wěn)定性良好。

2.11 耐用性

改變柱溫、流速和不同型號色譜柱以考察分析環(huán)境的微小變動對方法的影響，發(fā)現在各個色譜條件下L-丙氨酸異丙酯的檢測均不會受到干擾，方法耐用性良好，結果見表2。

表2 耐用性試驗結果Tab 2 Robustness

2.12 樣品檢測

分別取3 批富馬酸替諾福韋艾拉酚胺樣品（批號：200501、200502、200601）進行檢測，結果分別為0.044%、0.052%、0.054%，結果均低于擬訂限度0.10%。

3 討論

3.1 流動相選擇

本研究在前期方法摸索時分別考察了水-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇和0.1% 甲酸溶液-乙腈溶液3 種流動相。經比較發(fā)現，水-甲醇體系下L-丙氨酸異丙酯峰形矮胖、響應較低，通過在水相中添加甲酸能夠明顯改善上述問題。而在0.1%甲酸溶液-甲醇體系下基線噪音較大，不利于L-丙氨酸異丙酯的檢出。因此，為保證試驗結果準確，最終選擇0.1%甲酸溶液-乙腈。

3.2 離子源選擇

在離子源的選擇上，先后比較了電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源（APCI）兩種常用的離子源。使用APCI 時發(fā)現L-丙氨酸異丙酯響應較低，靈敏度較差；而ESI 可以較好地解決這一問題，因此，最終選擇ESI＋為電離方式。

3.3 小結

本研究建立了液質聯(lián)用色譜法檢測富馬酸替諾福韋艾拉酚胺原料藥中L-丙氨酸異丙酯并完成了相應的方法學驗證。結果顯示，該方法可以對富馬酸替諾福韋艾拉酚胺原料藥中的L-丙氨酸異丙酯進行準確定量分析，可為富馬酸替諾福韋艾拉酚胺的質量研究提供參考，保障藥品質量安全。