羅榮耀，張穎帆，陳德坤，，張莎，曠敏，彭偉偉，黃琪，*，鄒振興*（.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 67000；.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長沙 400；.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，長沙 40008）

植物內(nèi)生真菌是與健康植物共生的一類微生物群落，同時(shí)也是天然藥用資源研究與開發(fā)的一大熱點(diǎn)[1]。研究表明植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物種類繁多且具有豐富多樣的生物活性，其在發(fā)現(xiàn)新藥或藥物先導(dǎo)化合物的研究中具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。

香青（Anaphalis sinicaHance）是菊科香青屬多年生草本植物，以全草入藥，具有祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘、止痢的功效，常用于外感咳嗽、支氣管炎、腸炎、痢疾等癥[3-4]。目前香青屬植物主要見于植物化學(xué)及中醫(yī)藥利用，而對其內(nèi)生真菌的研究還比較薄弱。為了進(jìn)一步開發(fā)利用香青內(nèi)生真菌資源，本研究從香青葉片組織中分離得到一株真菌XQ-4，依據(jù)菌種ITS 測序并與GenBank 數(shù)據(jù)庫比對分析鑒定為Metapochonia bulbillosaXQ-4。內(nèi)生真菌Metapochonia bulbillosaXQ-4 隸屬于麥角菌科泛普可尼亞菌屬，該菌為首次從香青中分離得到[5]，且國內(nèi)外目前尚未有針對其次級代謝產(chǎn)物的相關(guān)報(bào)道。香青對葡萄球菌和植物病原真菌有一定的抑制作用[6-8]，本研究基于香青的抗菌活性，選取其內(nèi)生真菌Metapochonia bulbillosaXQ-4 為研究對象，以期探索該真菌的次級代謝產(chǎn)物中是否有結(jié)構(gòu)新穎、抗菌活性優(yōu)良的先導(dǎo)化合物。采用色譜技術(shù)從該菌大米發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取部位分離得到8 個(gè)化合物（見圖1），經(jīng)分析波譜數(shù)據(jù)后鑒定為sescandelin B（1）、diorcinol（2）、cordyol E（3）、5-羥基-2，3-二甲基-7-甲氧基色原酮（4）、（－）-terpestacin（5）、對-羥基苯甲醛（6）、2，10，12-十三碳三烯-6，7-二元醇（7）、十八碳二烯酸單甘油酯（8），并初步對它們的腫瘤細(xì)胞毒活性和抗菌活性進(jìn)行評價(jià)。

圖1 化合物1～8 的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Chemical structures of compounds 1～8

1 材料

核磁共振波譜儀（Bruker AV-600，Bruker 公司）；Agilent 6500 系列Q-TOF 質(zhì)譜儀（Agilent 1290 UPLC-6545 accurate mass Q-TOF、分析型高效液相色譜儀（Agilent 1200/1100 series，配備DAD 紫外檢測器）；YMC-Pack ODS A 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、半制備型高效液相色譜儀（Agilent 1100 series，配備VWD 紫外檢測器）（Agilent 科技公司）；Autopol IV-T 全自動(dòng)旋光儀（美國魯?shù)婪蚬荆?；ODS 反相C18填料（日本 YMC 公司）；柱色譜用硅膠（200～300 目、80～100 目，青島永海硅膠有限公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（美國GE 公司）；HPD-100 型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；薄層色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；EYELA NN-1100S-W 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。抗菌活性實(shí)驗(yàn)菌株Staphylococcus aureus（S.aureus）（ATCC29213）、Enterococcus faecalis（E.faecalis）（ATCC29212）、Escherichia coli（E.coli）（ATCC25922）及Pseudomonas aeruginosa（P.aeruginosa）（ATCC27853）均來源于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院；細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)人源肝癌細(xì)胞HepG2 和SMMC-7721 來源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

香青植株于2019 年8 月采自湖南省常德市石門縣壺瓶山峰頂，經(jīng)中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院徐康平副教授鑒定。實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)菌株分離自香青葉片組織，委托擎科生物有限公司進(jìn)行ITS 測序，將DNA 測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫比對，鑒定為Metapochonia bulbillosaXQ-4，GenBank 登錄號為No.7X9904XT013。目前菌種保存于中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌株發(fā)酵

在酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂液體培養(yǎng)基（YPD 培養(yǎng)基）中植入XQ-4 菌株，于25℃、180 r·min－1振蕩培養(yǎng)7 d 后得到真菌種子液，平均倒入20 瓶裝有固體培養(yǎng)基的500 mL 錐形瓶（每瓶加入250 g 大米，250 g 超純水，121℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻至室溫后即得固體培養(yǎng)基），密封后于28℃恒溫下靜置培養(yǎng)28 d。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

待XQ-4 菌株在5 kg 固體培養(yǎng)基發(fā)酵28 d后，用乙酸乙酯冷浸萃取菌絲體和固體發(fā)酵物并減壓濃縮得到45.8 g 浸膏，采用大孔樹脂色譜柱以20%、80%和100%乙醇三個(gè)梯度進(jìn)行洗脫。80%乙醇洗脫部位采用硅膠柱色譜（200～300目），以石油醚-乙酸乙酯體系梯度洗脫，經(jīng)TLC點(diǎn)板監(jiān)測合并，共得到8 個(gè)流分（Fr.1～Fr.8）。其中Fr.2 經(jīng)ODS 色譜柱，以甲醇-水體系梯度洗脫，得到4 個(gè)流分（Fr.2-1～Fr.2-4）。Fr.2-1 經(jīng)半制備高效液相色譜（以乙腈-純水為流動(dòng)相，20%～40%乙腈洗脫30 min，3 mL·min－1）制備得到化合物6（7.2 mg），F(xiàn)r.2-2 經(jīng)半制備高效液相色譜（以乙腈-純水為流動(dòng)相，30%～60%乙腈洗脫30 min，3 mL·min－1）制備得到化合物2（5.1 mg），F(xiàn)r.2-3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，以甲醇為洗脫劑純化，最后經(jīng)半制備高效液相色譜（以乙腈-純水為流動(dòng)相，30%～70%乙腈洗脫40 min，3 mL·min－1）制備得到化合物3（4.3 mg）、4（4.7 mg）和7（8.0 mg）。Fr.6 采用硅膠柱色譜（300～400 目）分離，以二氯甲烷-甲醇體系梯度洗脫，TLC 點(diǎn)板監(jiān)測合并，得到6 個(gè)流分（Fr.6-1～Fr.6-6），其中Fr.6-6 經(jīng)半制備高效液相色譜（以乙腈-純水為流動(dòng)相，60%～95%乙腈洗脫30 min，3 mL·min－1）制備得到化合物8（5.1 mg）。Fr.7 經(jīng)ODS 色譜柱，以甲醇-水體系梯度洗脫，得到4 個(gè)流分（Fr.7-1～Fr.7-4）。Fr.7-3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，以甲醇為洗脫劑純化，最后經(jīng)半制備高效液相色譜（以乙腈-純水為流動(dòng)相，50%～95%乙腈洗脫30 min，3 mL·min－1）制備純化得到化合物1（5.8 mg），F(xiàn)r.7-4 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜，以甲醇為洗脫劑純化，最后經(jīng)半制備高效液相色譜（以乙腈-純水為流動(dòng)相，50%～95%乙腈-水洗脫30 min，3 mL·min－1）制備純化得到化合物5（5.8 mg）。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：棕色固體，易溶于甲醇。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：2.30（3H，s，H-9），4.42（2H，s，H-10），6.32（1H，s，H-7），6.63（1H，s，H-5）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：17.1（C-9），56.4（C-10），98.5（C-8a），101.7（C-7），102.0（C-5），113.7（C-4），140.1（C-4a），152.9（C-3），163.4（C-8），165.5（C-1），166.6（C-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故化合物1 鑒定為sescandelin B。

化合物2：棕色固體，易溶于甲醇。HRESI-MS 顯示m/z[M＋H]＋231.1017（Calcd.for C14H15O3，231.1016），推測分子式為C14H14O3；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：2.18（6H，t，J＝1.8 Hz，H-7，H-7'），6.16（2H，s，H-2，H-2'），6.24（2H，s，H-4，H-4'），6.34（2H，s，H-6，H-6'），9.48（2H，s，3-OH，3'-OH）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：21.6（C-7，C-7'），103.4（C-2，C-2'），110.5（C-6，C-6'），111.6（C-4，C-4'），140.5（C-5，C-5'），158.1（C-3，C-3'），158.9（C-1，C-1'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故化合物2 鑒定為diorcinol。

化合物3：棕色固體，易溶于甲醇。HRESI-MS 顯示m/z[M＋H]＋245.1174（Calcd.for C15H17O3，245.1172），推測分子式為C15H16O3；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：2.18（3H，s，H-7'），2.24（3H，s，H-7），3.71（3H，s，H-8），6.16（1H，t，J＝1.8 Hz，H-2'），6.24（1H，brs，H-4'），6.34（1H，brs，H-2），6.36（1H，brs，H-6，H-6'），6.53（1H，brs，H-4）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：21.6（C-7），21.7（C-7'），55.6（C-8），102.6（C-2），103.3（C-2'），110.2（C-4），110.3（C-4'），111.7（C-6'），112.0（C-6），140.6（C-5'），140.8（C-5），158.0（C-1，C-3'），159.0（C-1'），160.9（C-3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故化合物3 鑒定為cordyol E。

化合物4：棕色固體，易溶于二氯甲烷。HRESI-MS 顯示m/z[M＋H]＋221.0810（Calcd.for C12H13O4，221.0808），推測分子式為C12H12O4；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：1.93（3H，s，H-10），2.40（3H，s，H-11），3.84（3H，s，H-12），6.34（1H，d，J＝1.8 Hz，H-2），6.56（1H，d，J＝1.8 Hz，H-4）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：9.3（C-11），18.7（C-10），56.4（C-12），92.3（C-4），98.1（C-2），104.2（C-6），114.9（C-8），157.6（C-7），161.6（C-5），164.2（C-1），165.3（C-3），181.7（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故化合物4 鑒定為5-羥基-2，3-二甲基-7-甲氧基色原酮（5-hydroxy-2，3-dimethyl-7-methoxychromone）。

化合物5：白色固體，易溶于二氯甲烷。HRESI-MS 顯示m/z[M＋H]＋403.2853（Calcd.for C25H39O4，403.2843），推測分子式為C25H38O4，比旋光度為－17.674（c0.17，MeOH）；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：0.85（3H，s，H-19），1.16（3H，d，J＝5.4 Hz，H-25），1.46（3H，s，H-22），1.49（2H，m，H-10），1.58（6H，s，H-20，H-21），1.63，2.18（2H，m，H-2），1.65，1.97（2H，m，H-9），1.80，2.30（2H，m，H-14），1.97，2.23（2H，m，H-5），2.17，2.23（2H，m，H-6），2.50（1H，m，H-23），2.62（1H，brd，J＝11.4 Hz，H-15），3.48，3.60（2H，dd，J＝7.8，9.0 Hz，H-24），3.81（1H，m，H-11），5.11（1H，m，H-7），5.22（1H，m，H-13），5.26（1H，m，H-3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：10.8（C-22），14.7（C-25），16.5（C-19），16.1（C-21），15.5（C-20），23.8（C-6），29.0（C-14），30.7（C-10），34.9（C-9），37.8（C-23），39.5（C-2），40.5（C-5），48.5（C-15），49.0（C-1），64.3（C-24），74.7（C-11），122.6（C-3），123.8（C-7），127.5（C-13），132.9（C-8），137.0（C-4），137.2（C-12），147.7（C-17），150.9（C-16），207.7（C-18）。以上核磁和旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故化合物5 鑒定為（－）-terpestacin。

化合物6：白色固體，易溶于二氯甲烷。HR-ESI-MS 顯示m/z[M＋H]＋123.0449（Calcd.for C7H7O2，123.0441），推測分子式為 C7H6O2；1H-NMR（600 MHz，D2O）δH：7.01（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，H-5），7.84（2H，d，J＝9.0 Hz，H-2，H-6），9.70（1H，s，H-7）；13C-NMR（150 MHz，D2O）δC：118.9（C-3，C-5），131.4（C-1），136.0（C-2，C-6），165.6（C-4），197.7（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故化合物6 鑒定為對-羥基苯甲醛（p-hydroxybenzaldehyde）。

化合物7：白色固體，易溶于二氯甲烷。HRESI-MS 顯示m/z[M＋H]＋211.1686（Calcd.for C13H23O2，211.1693），推測分子式為 C13H22O2；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：1.61（3H，d，J＝5.4 Hz，H-1），1.64～1.55（1H，m，H-5a），1.35～1.24（1H，m，H-5），2.20～2.26（2H，m，H-9），5.10，4.96（2H，dd，J＝16.8，10.2 Hz，H-13），5.40（1H，dq，J＝16.0，7.0 Hz，H-2），5.42（1H，dq，J＝16.0，7.0 Hz，H-3），5.77（1H，m，H-10），6.07（1H，dd，J＝15，10.2 Hz，H-11），6.31（1H，ddd，J＝16.8，10.2，6.6 Hz，H-12）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：18.3（C-1），28.9（C-9），32.8（C-8），33.3（C-5），73.6（C-7），73.7（C-6），115.3（C-13），124.5（C-2），131.1（C-11），132.2（C-3），136.3（C-10），137.8（C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故化合物7 鑒定為2，10，12-十三碳三烯-6，7-二元醇（2，10，12-triene-6，7-diol）。

化合物8：黃色油狀物，易溶于二氯甲烷。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：0.86（3H，t，J＝6.6 Hz，H-18），1.26（8H，m，H-4～7，H-15～17），1.51（2H，m，H-3），2.02（2H，m，H-8，H-14），2.28（2H，t，J＝7.8 Hz，H-2），2.74（2H，t，J＝6.6 Hz，H-11），3.63，3.90（2H，m，H-3'），4.03（2H，m，H-2'），4.85，4.61（2H，m，H-1'），5.34（4H，m，H-9，10，12，13）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：14.4（C-18），22.4（C-17），24.9（C-3），25.7（C-11），27.1（C-8），27.1（C-14），28.9（C-4），29.0（C-5），29.1（C-15），29.2（C-6），29.5（C-7），31.4（C-16），33.9（C-2），63.1（C-1'），66.0（C-3'），69.8（C-2'），128.2（C-10），128.2（C-12），130.2（C-9），130.2（C-13），173.4（C-1）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道一致，故化合物8 鑒定為十八碳二烯酸單甘油酯（glycerol-1-linoleate）。

2.4 生物活性評價(jià)

2.4.1 細(xì)胞毒活性 將兩株人源性肝癌細(xì)胞系HepG2 和SMMC-7721 植入含10%胎牛血清及100 U·mL－1青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基、37℃下培養(yǎng)，制成1×105個(gè)·mL－1細(xì)胞懸浮液接種于96 孔板中（100 μL·孔－1），于培養(yǎng)箱中37℃、5% CO2條件下孵育24 h 后，用1.25～80 μmol·L－1的目標(biāo)化合物和1.25～80 μmol·L－1的陽性對照藥索拉非尼處理細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入50 μL MTT（2 mg·mL－1），37℃下反應(yīng)4 h 后加入200 μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解甲瓚晶體，在450 nm 處測定吸光度值（OD450），平行測定3 次，取平均值[17]。計(jì)算化合物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，抑制率（%）＝[1－（OD實(shí)驗(yàn)孔－OD空白孔）/（OD對照孔－OD空白孔）]×100%，并采用非線性回歸模型繪制S 型劑量-抑制率曲線，計(jì)算各化合物的IC50值。結(jié)果顯示化合物8 對SMMC-7721、HepG2 細(xì)胞增殖具有抑制活性[IC50值分別為（58.01±1.62）和（53.30±2.97）μmol·L－1]，具體結(jié)果見表1。

表1 部分化合物細(xì)胞毒活性(±s，n＝3)Tab 1 Cytotoxicities of compounds against two human tumor cell lines(±s，n＝3)

表1 部分化合物細(xì)胞毒活性(±s，n＝3)Tab 1 Cytotoxicities of compounds against two human tumor cell lines(±s，n＝3)

化合物IC50 /（μmol·L－1）HepG2SMMC7721化合物1－－化合物3－－化合物4－－化合物6－－化合物7－－化合物853.30±2.9758.01±1.62索拉非尼（陽性對照） 2.19±0.04 4.80±0.08

2.4.2 抗菌活性 將4 種致病菌株分別植入Mueller-Hinton 肉湯培養(yǎng)基（MHB），37℃下培養(yǎng)，制成1×106CFU·mL－1的菌液接種于96 孔板（50 μL/孔），用1～64 μg·mL－1的目標(biāo)化合物及相同濃度梯度的陽性對照藥萬古霉素、硫酸阿米卡星處理后，再于各孔中加入50 μL 刃天青顯色液，35℃下培養(yǎng)8 h 后目視觀察法讀取結(jié)果。結(jié)果顯示化合物1、3、4、6、7、8 對S.aureus和P.aeruginosa具有抑制活性，對P.aeruginosa的MIC值均為64 μg·mL－1，對S.aureus的MIC值分別為16、16、4、16、32、4 μg·mL－1。所有被測化合物在最大濃度64 μg·mL－1下對E.faecalis和E.coli均未顯示抑菌活性，結(jié)果見表2。

表2 部分化合物抗菌活性Tab 2 Antimicrobial activities of compounds against 4 pathogenic bacteria

3 討論

藥用植物內(nèi)生真菌是與植物共生的一類種群龐大的微生物群體，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富及活性多樣的次級代謝產(chǎn)物，如萜類、生物堿類、黃酮類、苯丙素類和肽類等，具有優(yōu)良的抗菌、抗腫瘤等生物活性。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已陸續(xù)在藥用植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了紫杉醇等與宿主植物相同或相似的活性物質(zhì)。藥用植物香青中主要含有黃酮類、糖苷類及甾體類等化學(xué)成分，其中槲皮素、山柰酚等黃酮類物質(zhì)具有明顯的抗腫瘤活性[17-18]；亦含有萜類及薁型衍生物等豐富的揮發(fā)油成分，其中α-葎草烯、α-蒎烯等多種萜類物質(zhì)具有明顯的抗菌、抗腫瘤、抗炎及鎮(zhèn)咳祛痰等作用，薁型衍生物具有抗菌、抗腫瘤及殺蟲等作用[19-21]。本研究基于藥用植物香青的抗菌活性，以前期活性篩選得到的內(nèi)生真菌Metapochonia bulbillosaXQ-4 為研究對象，以期探索該真菌次級代謝產(chǎn)物中是否有結(jié)構(gòu)新穎、生物活性優(yōu)良的先導(dǎo)化合物。本研究首次從中分離出內(nèi)生真菌Metapochonia bulbillosaXQ-4，并對該真菌的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從香青中分離得到1 個(gè)香豆素（1）、2 個(gè)二苯醚（2 和3）、1 個(gè)色原酮（4）、1 個(gè)萜類（5）、1 個(gè)苯酚類（6）和2 個(gè)長鏈化合物（7 和8）。體外活性測試結(jié)果顯示，化合物1、3、4、6、7 和8 對S.aureus、P.aeruginosa均具有不同程度的抑制活性，化合物8 對SMMC-7721 和HepG2 細(xì)胞的增殖有微弱的細(xì)胞毒活性。通過比較內(nèi)生真菌Metapochonia bulbillosaXQ-4 次級代謝產(chǎn)物與其宿主植物香青的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)其間并沒有表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似性，但對該菌株次級代謝產(chǎn)物的研究結(jié)果表明，其中次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型豐富、生物活性多樣，這為后續(xù)對該菌株及香青的其他內(nèi)生真菌的深入研究奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究首次對真菌Metapochonia bulbillosaXQ-4 次級代謝產(chǎn)物和生物活性進(jìn)行研究，豐富了藥用植物香青的內(nèi)生真菌資源多樣性，同時(shí)為真菌Metapochonia bulbillosaXQ-4 次級代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步研究與利用提供參考。