呂麗靜，屈青松，周晴，盛夢柯，李智勛，石艷雙，盧建秋*，史新元*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 0488）

隨著中醫(yī)藥事業(yè)的蓬勃發(fā)展，中藥制造業(yè)產(chǎn)生了大量中藥藥渣。中藥提取后的藥渣大多被作為廢棄物處理，造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)，藥渣的處理成為目前中藥制藥企業(yè)面臨的難題[1-2]。藥渣中除了殘留的藥用成分外，還含有許多有價(jià)值的成分，可通過不同的方法將其充分利用。研究表明，藥渣可作為飼料添加劑用于養(yǎng)殖業(yè)[3-4]。但藥渣中纖維含量較高，將其直接作為飼料添加劑，活性成分的吸收利用率低，且適口性差[4]，在一定程度上限制了其在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。

現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)因其安全、無毒、簡單、效果理想等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域[5]。采用微生物發(fā)酵技術(shù)對藥渣進(jìn)行發(fā)酵，微生物產(chǎn)生的多種酶系可降低藥渣中纖維素的含量，促進(jìn)有效成分的析出，提高藥渣利用率[6]。益生菌具有改善或維持健康的功能，可抑制有害細(xì)菌增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，從而發(fā)揮機(jī)體調(diào)節(jié)、預(yù)防疾病等功效[7]。有研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵蒲公英可以提高其抗氧化活性[8]。鑒于上述特點(diǎn)，益生菌可被用作中藥藥渣發(fā)酵的菌種。

甘草是常用大宗藥材，有“十方九草”“國老”之美譽(yù)?，F(xiàn)代研究表明，甘草主要活性成分是三萜皂苷、黃酮和多糖類，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗炎抑菌等多種藥理活性[9-10]。每年有大量甘草被用于生產(chǎn)，隨之產(chǎn)生了大量的甘草固體廢棄物[11]。本文以農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第2045號公告中規(guī)定的可用于飼料微生物添加劑的兩種益生菌（植物乳桿菌和釀酒酵母）作為發(fā)酵菌種進(jìn)行混合發(fā)酵，以甘草藥渣作為發(fā)酵基質(zhì)，以甘草總黃酮含量為檢測指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)化最佳發(fā)酵條件，并分析發(fā)酵前后成分含量的變化及抗氧化活性，為甘草藥渣開發(fā)利用提供依據(jù)，使藥渣的利用更加高效、環(huán)保。

1 材料

1.1 儀器

FW-100 型高速粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），Synergy-2 型多功能酶標(biāo)儀（美國 BIOTEK 公司），PB303-S 型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），KQ-250E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），2695 型高效液相色譜儀（Waters 美國公司），BBS-DDC 型超凈工作臺（北京哈東聯(lián)儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

甘草藥渣（北京康仁堂藥業(yè)有限公司）。植物乳桿菌（批號：cf201109，江蘇菌鑰生命科技發(fā)展有限公司），釀酒酵母（批號：ky2008613，中國典型培養(yǎng)物保藏中心）。對照品甘草酸、甘草苷、甘草素、異甘草素（批號分別為B20417、B20414、B20416、B21525，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（Fisher，色譜級）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌種活化及種子液制備

將植物乳桿菌、釀酒酵母菌菌懸液分別劃線于MRS、YM 固體培養(yǎng)基中，并分別于37℃、30℃靜置培養(yǎng)36 h，分離得到單一菌落。挑取單一菌落接種于MRS、YM 液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r·min－1培養(yǎng)2 d，獲得發(fā)酵用種子液，冷藏備用。

2.2 發(fā)酵甘草藥渣培養(yǎng)基的制備

將甘草藥渣粉碎并過40 目篩，稱定10.00 g置于250 mL 錐形瓶中，加去離子水調(diào)整料水比為1∶1，121℃、20 min 高壓蒸汽滅菌備用。

2.3 甘草總黃酮含量測定

采用70%的乙醇超聲提取樣品中的總黃酮[12]，利用NaNO2-A1（NO3）3比色法測定總黃酮含量[13]。建立回歸方程：A＝6.5C＋0.0186，R2＝0.9996，利用回歸方程計(jì)算總黃酮含量。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

圖1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Fig 1 Single-factor optimization experiment results

2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對接種比例、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)因素，各選3 個(gè)水平，分別以－1、0、1 進(jìn)行編碼。采用 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)模型，設(shè)計(jì)4 因素3水平中心組合試驗(yàn)條件，以總黃酮含量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化復(fù)合益生菌發(fā)酵甘草藥渣工藝條件。試驗(yàn)因素水平及編碼見表1，結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken 的中心組合因素水平表Tab 1 Factor and level of the central composition of Box-Behnken

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab 2 Box-Benhnken experiment design and results

應(yīng)用Design-expert 8.0.6 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y＝1.81＋0.046A＋0.078B＋0.061C＋0.046D＋0.041AB－ 0.055AC＋0.01AD＋0.14BC－0.11BD－0.2CD＋0.047A2－0.17B2－0.14C2－0.13D2。

由表3可知，回歸模型F值為 19.63，P值＜0.0001，表明回歸模型極顯著。方程的相關(guān)系數(shù)R2＝0.9515，R2＞0.95，說明此模型擬合度較好，能很好地反映真實(shí)的實(shí)驗(yàn)情況。失擬項(xiàng)P＝0.0960 ＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著。模型的調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)Radj2＝0.9030，說明該模型能解釋約90.30%響應(yīng)值的變化。

表3 方差分析Tab 3 Variance analysis

根據(jù)F值的大小，得出總黃酮含量受各因素的影響次序?yàn)椋喊l(fā)酵時(shí)間（B）＞發(fā)酵溫度（C）＞接種比例（A）＞接種量（D）。各因素之間兩兩交互作用對甘草總黃酮含量的影響見圖2。由軟件分析得到，益生菌發(fā)酵甘草藥渣最優(yōu)發(fā)酵工藝條件是接種比例釀酒酵母與植物乳桿菌為1∶3、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度34 ℃、接種量8%，在此條件下甘草總黃酮含量的預(yù)測值為1.99%。

圖2 不同因素對甘草總黃酮含量影響的響應(yīng)面分析圖Fig 2 Response surface analysis of the effect of different factors on the total flavonoid content of licorice

2.4.3 回歸模型的驗(yàn)證 為驗(yàn)證模型的可靠性及有效性，對優(yōu)化后的最佳條件進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，得到總黃酮含量為（1.98±0.02）%，與預(yù)測值相比無顯著差異，表明預(yù)測值和實(shí)際值相吻合，優(yōu)化模型可靠，對實(shí)際生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

對工程實(shí)踐能力而言，深入企業(yè)頂崗鍛煉與虛擬仿真實(shí)習(xí)，參與企業(yè)技術(shù)攻關(guān)與承擔(dān)企業(yè)科研課題，企業(yè)掛職與企業(yè)調(diào)研相結(jié)合，促進(jìn)工科新教師熟悉工程發(fā)展動(dòng)態(tài)，豐富工程實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，發(fā)展解決實(shí)際工程問題的能力。

此外，試驗(yàn)測得發(fā)酵前總黃酮含量為（1.46±0.09）%，發(fā)酵后比發(fā)酵前增加了35.62%，說明優(yōu)化方案設(shè)計(jì)合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠顯著提高總黃酮含量。

2.5 HPLC 測定甘草酸及3 種黃酮類成分含量

2.5.1 色譜條件 采用高效液相色譜法測定甘草酸及3 種黃酮類成分的含量[14]。安捷倫C18色譜柱ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱，流動(dòng)相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B），洗脫梯度（0～10 min，14%～26%B；10～24 min，26%～30%B；24～30 min，30%～34%B；30～35 min，34%～36%B；35～42 min，36%～42%B；42～45 min，42%～50%B；45～60 min，50%～45%B）；流速：1 mL·min－1，柱溫：35℃，檢測波長：254、276、376 nm，進(jìn)樣體積：20 μL。

2.5.2 對照品溶液的制備 稱定甘草酸對照品7.97 mg、甘草素對照品2.05 mg、異甘草素對照品2.03 mg、甘草苷對照品2.03 mg，精密加入50%甲醇溶液2 mL 溶解，配制成對照品儲備液。

2.5.3 供試品溶液的制備 稱定未發(fā)酵甘草藥渣及發(fā)酵甘草藥渣0.50 g，加入25 mL50%甲醇溶液，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱重，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，離心，取上清液，經(jīng) 0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.5.4 樣品成分測定分析 精密吸取對照品溶液和供試品溶液進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算各成分的含量，色譜圖見圖3，含量結(jié)果見表4，可見經(jīng)過發(fā)酵后各成分的含量發(fā)生了變化。甘草苷及甘草酸含量有所下降，分別下降了63.79%、2.361%；而甘草素和異甘草素的含量有顯著增加，分別增加了855.9%、86.21%。

表4 發(fā)酵前后4 種成分的含量變化Tab 4 Content changes of 4 components before and after the fermentation

圖3 混合對照品（A）、未發(fā)酵甘草藥渣（B）、發(fā)酵甘草藥渣（C）中4 種成分HPLC 圖Fig 3 HPLC of 4 components of mixed reference substance（A），unfermented licorice residue（B），and fermented licorice residue（C）1.甘草苷（liquiritin）；2.甘草素（liquiritingenin）；3.異甘草素（isoliquiritingenin）；4.甘草酸（glycyrrhizic acid）

2.6 抗氧化活性測定

分別稱取一定量的甘草藥渣及發(fā)酵產(chǎn)物，加入20 倍去離子水，回流提取2 h，抽濾，濾液冷凍干燥。將冷凍干燥樣品用去離子水制備成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液進(jìn)行抗氧化活性測定。

2.6.1 DPPH 自由基清除能力 參照申夢娜等[15]的方法，取DPPH 溶液2 mL，加入不同濃度的樣品溶液2 mL，搖勻，在25℃避光放置30 min，在517 nm 波長處測定其吸光度（A1）。以無水乙醇作為空白對照測定其吸光度（A0），以無水乙醇代替DPPH 測定吸光度（A2），計(jì)算DPPH 清除率。

DPPH 清除率（%）＝[1－（A1－A2）/A0]×100%。

2.6.2 羥自由基清除能力 參照沈明花等[16]的方法，依次加入9 mmol·L－1FeSO4溶液500 μL，9 mmol·L－1水楊酸-乙醇溶液500 μL，8.8 mmol·L－1H2O2溶液，37 ℃水浴15 min 后取出，測定510 nm 下吸光度。清除率計(jì)算同“2.6.1”項(xiàng)下。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由圖4可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，其對DPPH、羥自由基的清除率呈上升趨勢，且發(fā)酵后甘草藥渣的DPPH、羥自由基清除能力比同濃度的發(fā)酵前清除能力顯著提高。說明經(jīng)過益生菌發(fā)酵，甘草藥渣的DPPH 自由基清除能力顯著提升，抗氧化活性增強(qiáng)。

圖4 甘草藥渣發(fā)酵前后對 DPPH 和羥自由基清除能力Fig 4 Scavenging effect of licorice residue before and after the fermentation on DPPH and hydroxyl radicals

3 討論

黃酮類成分具有抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤等藥效作用[17]。中藥發(fā)酵具有提高藥物有效成分含量，增強(qiáng)藥效的作用。經(jīng)過復(fù)合益生菌發(fā)酵，甘草藥渣中總黃酮含量增加，通過對發(fā)酵工藝的優(yōu)化，提取液中總黃酮含量得以提升。根據(jù)微生物的生長代謝特點(diǎn)，推測造成總黃酮含量提升可能是由于發(fā)酵過程中微生物分泌的酶類破壞了植物細(xì)胞壁，從而提高了提取率。利用微生物發(fā)酵甘草藥渣，提高藥渣中活性物質(zhì)的溶出，可促進(jìn)藥渣的吸收利用，為生產(chǎn)藥渣飼料添加劑提供參考，實(shí)現(xiàn)資源再利用。

發(fā)酵應(yīng)用于中藥，能利用微生物分解轉(zhuǎn)化能力，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的功效，使得中藥更適應(yīng)于臨床用藥的需要。馬超等[18]研究用酵母發(fā)酵大黃使結(jié)合型蒽醌分解或者轉(zhuǎn)化成游離型蒽醌，從而減輕大黃的峻烈瀉下作用。杜靜[19]研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌可使中藥三七皂苷類成分發(fā)生轉(zhuǎn)化作用。甘草藥渣發(fā)酵前后物質(zhì)成分發(fā)生變化，可能是由于益生菌生物使這幾種物質(zhì)成分之間發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化。

甘草中的黃酮類物質(zhì)分為游離苷元和結(jié)合型糖苷兩大類。為進(jìn)一步研究益生菌發(fā)酵過程對甘草渣中黃酮類成分的轉(zhuǎn)化作用，本文通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)發(fā)酵后3 種黃酮類成分含量均有一定的變化。糖苷類成分甘草苷含量降低，苷元類成分甘草素和異甘草素含量增加。造成這種現(xiàn)象的原因可能是益生菌分泌的纖維素酶等酶分解了糖苷類成分，轉(zhuǎn)化為更易被吸收的游離性苷元，從而使甘草素和異甘草素含量增加。大分子的黃酮糖苷類被分解成小分子苷元更容易被機(jī)體吸收[20]，可進(jìn)一步提高飼料利用率。

研究表明，氧化應(yīng)激與疾病有直接關(guān)系，氧化與抗氧化機(jī)制失衡會造成動(dòng)物抗病能力下降，從而引起疾病的發(fā)生[21]。因此增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，可提高動(dòng)物健康水平。陳學(xué)紅等[22]發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵能提高金銀花的抗氧化活性。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合益生菌發(fā)酵后的甘草藥渣對DPPH 自由基、羥自由基有一定的清除能力，且在相同濃度下都強(qiáng)于未發(fā)酵組?？赡苁怯捎谝嫔纳镛D(zhuǎn)化作用，物質(zhì)成分發(fā)生變化并產(chǎn)生初級、次級代謝產(chǎn)物，從而發(fā)揮抗氧化作用[23]；同時(shí)益生菌產(chǎn)生SOD 酶等酶類發(fā)揮作用，從而增強(qiáng)抗氧化活性[24]。

但不同企業(yè)之間產(chǎn)生的藥渣在成分方面是否有差異尚未知。關(guān)于益生菌發(fā)酵藥渣的應(yīng)用范圍需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，復(fù)合益生菌發(fā)酵甘草藥渣具有較大的應(yīng)用價(jià)值，為甘草藥渣的再利用提供了可能。本研究也可以為企業(yè)的藥渣資源再利用提供新思路，提高中藥資源的綜合利用價(jià)值。