何玲敏，吳秋芳，胡高陽(yáng)，李 悅，杜煜潔，張美玲，蔡 新，李鎖平，郭瑞林

（1.安陽(yáng)工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000；2.河南省太行山林業(yè)有害生物野外科學(xué)觀測(cè)研究站，河南 林州 456550；3.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475000）

小麥赤霉病（Fusarium Head Blight，F(xiàn)HB）別名麥穗枯、爛麥頭、紅麥頭，是一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的麥類(lèi)作物上的真菌病害。禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearumSchwabe）是引起小麥赤霉病的主要病原菌[1]。河南省是我國(guó)小麥種植面積最大的省份，小麥赤霉病亦是當(dāng)?shù)匦←溕a(chǎn)的主要病害。該病害的發(fā)生對(duì)小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)均會(huì)造成影響，其分泌的真菌毒素可引起人、畜中毒。

隨著人們生活水平的提高和對(duì)高品質(zhì)生活的追求，保護(hù)環(huán)境、倡導(dǎo)生態(tài)和諧和實(shí)施可持續(xù)發(fā)展越來(lái)越受到重視，進(jìn)而提出了“公共植保、綠色植?！钡睦砟睢Ｒ虼?，生產(chǎn)上迫切需要一種可持續(xù)、環(huán)保、高效的防治措施來(lái)控制小麥赤霉病的發(fā)生和危害。生物防治技術(shù)具有對(duì)人畜及生態(tài)環(huán)境影響小、專(zhuān)一性強(qiáng)、對(duì)農(nóng)產(chǎn)品無(wú)污染、不易使病蟲(chóng)害產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，符合環(huán)境及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的理念，被認(rèn)為是最有前途的化學(xué)農(nóng)藥替代品，在許多國(guó)家已被開(kāi)發(fā)為商業(yè)化的生物肥料或生防菌劑[2]。

鑒于目前尚無(wú)理想的高抗赤霉病的小麥品種，因此生物防治技術(shù)將是一種更有效、更環(huán)保的農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)方法，是小麥可持續(xù)發(fā)展的重要保障[3]。用于生物防治的微生物主要是從不同生態(tài)系統(tǒng)中的植物、土壤中篩選得到的拮抗菌，包括細(xì)菌、真菌和放線菌等[4]。拮抗微生物對(duì)病原真菌的作用方式多樣，包括抗生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用，溶菌作用，誘導(dǎo)抗病性等。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者在有益拮抗菌的研究和應(yīng)用方面做了大量工作并取得積極成果，有效菌株主要有芽孢桿菌（Bacillusspp.）[5]、假單胞菌（Pseudomonasspp.）[6]、木霉菌（Trichodermaspp.）[7]。徐劍宏等[8]從土壤中分離到的枯草芽孢桿菌AF0907能抑制禾谷鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)，且可有效降低小麥赤霉病的發(fā)病率，防治效率可達(dá)40%以上。藺國(guó)強(qiáng)等[9]從土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌，其對(duì)小麥赤霉病的防治效果達(dá)80%以上。Khan等[6]首次報(bào)道了假單胞菌可用于防治小麥赤霉病并同時(shí)減少DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）毒素的分泌量。

拮抗菌株在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的抗生素、抗菌蛋白或細(xì)胞壁降解酶等次級(jí)代謝產(chǎn)物可直接對(duì)抗病原菌，從而使植物抵抗病原菌的入侵、潛伏和擴(kuò)散，菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物越多，其生物防治效果就越強(qiáng)[10]。關(guān)于小麥赤霉病生防菌株的生防機(jī)制的研究，大多數(shù)研究者認(rèn)為拮抗菌株在小麥穗部等組織產(chǎn)生的一些細(xì)胞壁降解酶以及次級(jí)代謝產(chǎn)物等抗菌活性物質(zhì)，在赤霉病的防治中起著關(guān)鍵作用[7,11]，然而，拮抗菌株發(fā)酵液中具體哪些物質(zhì)發(fā)揮了拮抗作用，其具體的生防機(jī)制是什么，以及能否將拮抗菌研制成生物制劑運(yùn)用到小麥赤霉病的生物防治中，這些問(wèn)題都制約了小麥赤霉病的生物防治進(jìn)程[5]。

拮抗菌在田間的防治效果與室內(nèi)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，是植物病害生物防治中存在的普遍問(wèn)題。當(dāng)室內(nèi)篩選的拮抗微生物釋放到田間后，其防治效果往往不盡人意。目前，小麥赤霉病拮抗菌難以完全滿足商品化生產(chǎn)的要求，許多拮抗菌的田間防治效果及其作用機(jī)理尚不明確。因此，需要對(duì)拮抗菌的活性拮抗物質(zhì)及其生物活性進(jìn)行深入研究。

課題組前期從小麥葉片分離到一株紅球菌Y-1菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株能有效抑制小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌（F.graminearum）的分生孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)。本文將以Y-1菌株為研究對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化其發(fā)酵條件，并初步研究其抗菌活性物質(zhì)類(lèi)型，以期為利用Y-1菌株防控小麥赤霉病提供科學(xué)依據(jù)，并為高效生防菌劑的研制提供材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

拮抗菌：紅球菌Y-1，分離自小麥葉片。

病原菌：禾谷鐮刀菌，由江蘇省林科院提供。

主要試劑和儀器：苯、二甲苯、乙酸乙酯、石油醚30-60、丙酮、培養(yǎng)箱、搖床、離心機(jī)、pH計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超聲波破碎儀等。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化鈉10 g，固體培養(yǎng)基則添加15 g-20 g的瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH為7.0，蒸餾水定容至1 L；用于Y-1菌株的活化和培養(yǎng)。

PDA培養(yǎng)基：新鮮土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g-20 g，蒸餾水定容至1 L，自然pH；用于禾谷鐮刀菌的活化和培養(yǎng)。

1.3 Y-1菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化

將紅球菌Y-1菌株在LB固體培養(yǎng)基上活化2次，然后接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，放置于28℃搖床中，200 rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液備用。禾谷鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上活化2次，25℃培養(yǎng)，備用。

從培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量和裝液量5個(gè)因素對(duì)Y-1菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

①發(fā)酵溫度

將Y-1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，分別在22℃、25℃、28℃、30℃和37℃五個(gè)溫度下，200 rpm振蕩培養(yǎng)36 h，檢測(cè)無(wú)菌濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性。

②初始pH

分別將LB液體培養(yǎng)基的初始pH調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以 1∶ 50的接種量將Y-1菌株接種于不同初始pH的LB液體培養(yǎng)基中，于30℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)36 h后，檢測(cè)無(wú)菌濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性。

③裝液量

于500 mL錐形瓶中分別加入50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL的LB液體培養(yǎng)基，接種Y-1菌株后，于30℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)36 h，檢測(cè)無(wú)菌濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性。

④發(fā)酵時(shí)間

將Y-1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃200 rpm連續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別取第24 h、36 h、48 h、72 h、96 h和120 h的發(fā)酵液，檢測(cè)無(wú)菌濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性。

⑤接種量

將Y-1菌株的種子液分別以0.5%、1%、3%、5%、7%、10%的接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中，30℃ 200 rpm振蕩培養(yǎng)36 h后，檢測(cè)無(wú)菌濾液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性。

Y-1菌株無(wú)菌濾液的制備：取各處理組Y-1菌株發(fā)酵液分別倒入50 mL無(wú)菌離心管中，4℃，10 000 rpm，離心10 min，上清液用0.22 μm的濾膜抽濾，無(wú)菌濾液于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

Y-1菌株無(wú)菌發(fā)酵濾液的抑菌活性測(cè)定：取各處理組Y-1無(wú)菌濾液5 mL分別與20 mL冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基均勻混合，制成帶毒平板。用直徑為5 mm的打孔器打取同質(zhì)同量的禾谷鐮刀菌菌餅，接種至上述PDA帶毒平板中央，以無(wú)菌水代替Y-1無(wú)菌濾液作為對(duì)照組，每組重復(fù)3次。將上述平板放至28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約5 d，當(dāng)對(duì)照組的禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)至接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，用十字交叉法測(cè)量禾谷鐮刀菌菌落直徑，計(jì)算各處理組Y-1無(wú)菌濾液的抑菌率。

抑菌率計(jì)算公式如下：抑菌率=[（對(duì)照平板菌落直徑-帶毒平板菌落直徑）/（對(duì)照平板菌落直徑-菌餅直徑）]×100%。

1.4 Y-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗作用

將Y-1菌株在LB固體培養(yǎng)基上活化2次后，接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，按照上述優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵液經(jīng)4℃，10 000 rpm離心20 min后，上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾即得無(wú)菌濾液。取無(wú)菌濾液5 mL與20 mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基混合均勻后倒平板，制成帶毒平板；以無(wú)菌水代替無(wú)菌濾液為對(duì)照。用直徑為5 mm的打孔器打取同質(zhì)同量的禾谷鐮刀菌菌餅，接種至上述PDA帶毒平板中央。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)約5 d，當(dāng)對(duì)照組的禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)至接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，用十字交叉法測(cè)量禾谷鐮刀菌菌落直徑，計(jì)算Y-1無(wú)菌濾液的抑菌率（計(jì)算公式同上）。

1.5 Y-1菌株抑菌物質(zhì)的粗提取及活性測(cè)定

①揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌作用

將直徑為5 mm的禾谷鐮刀菌菌餅接種于PDA平板中央，在另一個(gè)同樣大小的LB平板上涂布接種0.2 mL Y-1菌株發(fā)酵液，再將前者反扣于后者之上，兩培養(yǎng)皿接口處用封口膜密封。以LB平板上涂布接種0.2 mL LB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將上述培養(yǎng)皿置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約4 d，觀察并統(tǒng)計(jì)Y-1菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率。

②非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌作用

在PDA平板上鋪一張無(wú)菌玻璃紙，涂布接種0.2 mL Y-1菌株發(fā)酵液，28℃培養(yǎng)2 d后，用無(wú)菌鑷子小心揭去玻璃紙，再在平板中央接種一塊禾谷鐮刀菌菌餅，28℃培養(yǎng)。以PDA平板不接種Y-1菌株為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。待對(duì)照組禾谷鐮刀菌菌絲長(zhǎng)至接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，觀察并統(tǒng)計(jì)Y-1菌株的非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率。

③非蛋白提取物的抑菌作用

非蛋白提取物的獲得：Y-1菌株發(fā)酵液在4℃10 000 rpm下離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后即得無(wú)菌濾液。取4支提前滅菌的250 mL錐形瓶，每瓶裝入50 mL的Y-1無(wú)菌濾液，分別加入等體積的苯、二甲苯、乙酸乙酯、石油醚30-60封閉并劇烈振蕩，靜置15 min后取有機(jī)相，如此反復(fù)萃取4-5次。用旋轉(zhuǎn)蒸儀將有機(jī)相制備成干物質(zhì)，用5 mL相應(yīng)的有機(jī)溶劑將干物質(zhì)重新溶解，然后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得非蛋白粗提物，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

非蛋白提取物的抑菌活性：用同樣的方法制備禾谷鐮刀菌菌餅，將菌餅接種于PDA平板距中心點(diǎn)3.5 cm處的兩側(cè)，中心點(diǎn)放置牛津杯，并向牛津杯中加入200 μL的非蛋白粗提物。以牛津杯中加等量相應(yīng)的有機(jī)溶劑作為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3-4 d后觀察非蛋白粗提物對(duì)禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)抑制作用。

④蛋白提取物的抑菌作用

粗蛋白提取物的制備：Y-1菌株發(fā)酵液在4℃、10 000 rpm下離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后即得無(wú)菌濾液。取100 mL無(wú)菌濾液，加入硫酸銨使其飽和度為100%，4℃、10 000 rpm下離心30 min，將沉淀溶解于0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液（PBS）中，并置于透析袋（截留分子量3 500 Ku）中，兩端用透析袋夾夾緊，用去離子水透析24 h，在透析液中加入2倍體積的冷丙酮（-20℃），-20℃靜止2 h后，10 000 rpm，離心30 min，將沉淀冷凍干燥后即得粗蛋白粉。用PBS將粗蛋白粉重新溶解，使其終濃度為原液的20倍，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得Y-1菌株的蛋白粗提液。

蛋白提取物的抑菌活性試驗(yàn)方法同非蛋白提取物的抑菌活性測(cè)定。

⑤細(xì)胞破碎物的抑菌作用

Y-1菌株發(fā)酵液在4℃、10 000 rpm下離心20 min，棄上清，沉淀用適量PBS溶解，離心，棄上清，此過(guò)程重復(fù)3次。沉淀用適量PBS溶解，超聲破碎（破碎5 s，間隔5 s）15 min，將細(xì)胞破碎液在4℃、10 000 rpm下離心20 min，取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。

細(xì)胞破碎液的抑菌活性試驗(yàn)方法同非蛋白提取物的抑菌活性測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和Microsoft Office Excel 2007軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，取平均值繪制柱形圖或條形圖；對(duì)各組數(shù)據(jù)在0.05水平進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析（Tukey檢驗(yàn)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)Y-1無(wú)菌發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.1.1 發(fā)酵溫度

如圖1A所示，發(fā)酵溫度會(huì)顯著影響Y-1無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性。隨著溫度的升高，Y-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在22℃時(shí)，抑菌率最低，僅為24.8%；當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃時(shí)，Y-1菌株的抑菌率最高，達(dá)56.5%，且顯著高于其他處理組；28℃和30℃時(shí)的抑菌率至40%左右，二者之間不存在顯著差異；而溫度升至37℃時(shí)，Y-1菌株的抑菌率繼續(xù)降至27%。因此，Y-1菌株的最佳發(fā)酵溫度定為25℃。

2.1.2 初始 pH

培養(yǎng)基的初始pH對(duì)Y-1菌株抑菌能力的影響見(jiàn)圖1B，Y-1菌株的抑菌率隨著pH的增大先升高后降低。當(dāng)pH為6.0和7.0時(shí)，Y-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率較高，且二者差異不限制，其中pH為6.0時(shí)的抑菌率最高，為53.1%；隨著pH的升高或降低，抑菌率均急劇下降。因此，Y-1菌株的最適發(fā)酵pH定為6.0。

2.1.3 裝液量

裝液量對(duì)Y-1菌株抑菌能力的影響見(jiàn)圖1C，隨著裝液量的增加，Y-1菌株的抑菌率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)500 mL錐形瓶中的裝液量為100 mL時(shí)，Y-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率達(dá)到最高51.8%；隨著裝液量的增加，抑菌率急劇下降，當(dāng)裝液量為250 mL時(shí)抑菌率降至最低9.6%。由此可見(jiàn)，相對(duì)空氣量高、氧氣傳質(zhì)阻力小更有利于Y-1菌株的生長(zhǎng)。因此，Y-1菌株的發(fā)酵最適裝液量為100 mL/500 mL錐形瓶（即1/5）。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間對(duì)Y-1菌株抑菌能力的影響見(jiàn)圖1D，Y-1菌株的抑菌率隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先升高后降低。當(dāng)發(fā)酵72 h時(shí)，Y-1菌株的抑菌率達(dá)到最高，為55.6%，且現(xiàn)在高于其它處理組；發(fā)酵時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)，其抑菌率均會(huì)顯著降低。發(fā)酵初期，Y-1菌株分泌的抑菌物質(zhì)的量少，導(dǎo)致其抑菌率較低；而到發(fā)酵后期，其抑菌率顯著下降，可能是由于此時(shí)發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本耗盡，導(dǎo)致Y-1菌株分泌的抑菌物質(zhì)被分解利用[12]。因此，Y-1菌株的最適發(fā)酵時(shí)間為72 h。

2.1.5 接種量

如圖1E所示，接種量會(huì)顯著影響Y-1無(wú)菌發(fā)酵液的抑菌活性。隨著接種量的增加，Y-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為1%時(shí)，Y-1菌株的抑菌達(dá)到最高，為55.8%，且現(xiàn)在高于其它處理組；接種量過(guò)小或過(guò)大，其抑菌率均會(huì)顯著降低。當(dāng)接種量為0.5%時(shí)，發(fā)酵液中的Y-1菌株數(shù)量較少，因而分泌的抑菌物質(zhì)也較少，此時(shí)的抑菌率也較低。當(dāng)接種量為3%、5%、7%、10%時(shí)，過(guò)高的接種量可能導(dǎo)致發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被迅速消耗或次級(jí)代謝產(chǎn)物含量較高，影響菌體的生長(zhǎng)和繁殖，抑菌率大大降低。

圖1 各單因素試驗(yàn)中Y-1無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率

通過(guò)單因素試驗(yàn)得到Y(jié)-1菌株的最佳發(fā)酵條件為：pH 6.0、發(fā)酵溫度25℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、接種量1%、裝液量1/5。初步研究結(jié)果表明，中性偏酸性環(huán)境有利于紅球菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，且該菌株為好氧型菌株。

2.2 Y-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗作用

按照上述優(yōu)化后的發(fā)酵條件制備Y-1菌株發(fā)酵液。通過(guò)觀察禾谷鐮刀菌在由Y-1菌株發(fā)酵濾液制備的帶毒平板上的生長(zhǎng)情況（圖2A），并計(jì)算Y-1無(wú)菌濾液的抑菌率，發(fā)現(xiàn)Y-1發(fā)酵濾液可以明顯抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，抑菌率為58.6%。由此可知，在上述優(yōu)化后的發(fā)酵條件下所得的Y-1發(fā)酵濾液的抑菌率顯著高于各單因素試驗(yàn)的抑菌率（圖2B）。

圖2 優(yōu)化后Y-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)的影響（A）及各發(fā)酵條件下Y-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌抑菌率的比較分析（B）

2.3 Y-1菌株的主要抑菌物質(zhì)類(lèi)型

Y-1菌株發(fā)酵液中的各類(lèi)粗提物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性如圖3所示，結(jié)果顯示其發(fā)酵液中的非蛋白類(lèi)物質(zhì)（提取劑：二甲苯）對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌作用最強(qiáng)（圖4B），抑菌率為77.4%；其次是揮發(fā)性物質(zhì)（圖4D），抑菌率為57.5%；而非揮發(fā)性物質(zhì)、蛋白提取物和細(xì)胞破碎物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率相當(dāng)，且均表現(xiàn)出較弱的抑菌作用。

圖3 Y-1菌株發(fā)酵液中各類(lèi)粗提物對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率

圖4 Y-1菌株的非蛋白提取物（A、B）和揮發(fā)性物質(zhì)（C、D）對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

初步得知，Y-1菌株發(fā)酵液中的揮發(fā)性物質(zhì)和非蛋白類(lèi)物質(zhì)在對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用中貢獻(xiàn)較大，是其主要的抑菌活性物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

小麥赤霉病在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生，是禾谷類(lèi)作物上的一類(lèi)十分嚴(yán)重的病害，對(duì)麥類(lèi)作物的種植和生產(chǎn)帶來(lái)巨大影響。其病原菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)DON等不僅危害人畜健康，而且嚴(yán)重降低小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量，進(jìn)而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。關(guān)于小麥赤霉病的生物防治，國(guó)內(nèi)外一些研究者在有益拮抗菌的研究和應(yīng)用方面做了大量工作并取得積極成果，已經(jīng)篩選出小麥赤霉病生防菌有芽孢桿菌、假單胞菌、放線菌以及真菌等[13-15]。生防菌的生防機(jī)制主要包括溶菌作用、營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)抗生素或其它活性代謝物質(zhì)、誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性等[16]。近幾年，關(guān)于小麥赤霉病拮抗菌的篩選及其生物防治機(jī)制的研究備受關(guān)注。盡管篩選到一些拮抗作用較強(qiáng)的菌株，但目前僅有少數(shù)芽孢桿菌被開(kāi)發(fā)為生物農(nóng)藥并申請(qǐng)專(zhuān)利投入市場(chǎng)[16]。小麥赤霉病的生物防治依然在探索前進(jìn)中，并處于試驗(yàn)階段，距離大規(guī)模田間應(yīng)用仍有一段距離[17]。

微生物的生長(zhǎng)及其代謝受眾多外界因素的影響，如溫度、pH、接種量等。因此，探究微生物的最佳發(fā)酵條件對(duì)其高效產(chǎn)生抗菌物質(zhì)十分必要。拮抗菌株在不同發(fā)酵條件下抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量具有顯著性差異。江丹霞等[12]以康氏木霉為指示菌，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)芽孢桿菌Z21產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后其發(fā)酵液對(duì)康氏木霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率明顯提高，高達(dá)72%。趙月等[18]以蠟樣芽孢桿菌BCCY-22的OD600為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后發(fā)酵時(shí)間縮短了6 h，生物量增加了36%。何明川等[19]結(jié)合單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)特基拉芽胞桿菌D5-8的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后其對(duì)煙草黑脛病的預(yù)防效果和防治效果可達(dá)66.89%和53.72%，且均高于優(yōu)化前。王明環(huán)等[20]通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)明確了直絲紫鏈霉菌A8的最佳發(fā)酵條件，并通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)得到26種化合物，其中3-甲基-1,2-環(huán)戊二酮、1,2,4,5-四甲基苯和二氫-3-亞甲基-2,5-呋喃二酮對(duì)立枯絲核菌的抑菌率達(dá)到70%以上。

針對(duì)篩選出的具有拮抗活性的紅球菌Y-1的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)其生防菌劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。不同發(fā)酵條件下，Y-1菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量也具有顯著性差異。本研究采用單因素試驗(yàn)初步獲得Y-1菌株的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度25℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、接種量1%、初始pH 6.0、裝液量為100 mL/500 mL錐形瓶（即1/5）。在該發(fā)酵條件下，Y-1發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率高達(dá)58.6%，顯著高于各單因素實(shí)驗(yàn)的抑菌率。由此可知，環(huán)境中相對(duì)空氣量高、氧氣傳質(zhì)阻力小更有利于Y-1菌株的生長(zhǎng)；且過(guò)高的接種量使得發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被迅速消耗，影響菌體的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而影響其抑菌率[20]。

利用拮抗微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物是防治植物病害的一條有效途徑。拮抗微生物通過(guò)分泌活性抗菌物質(zhì)，作用于病原菌細(xì)胞的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，干擾病原菌的蛋白合成系統(tǒng)和能量代謝系統(tǒng)的正常功能，進(jìn)而抑制或殺死病原菌[16]。拮抗微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物越多，其生物防治效果就越強(qiáng)[10]。有研究表明，微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）在抑制植物病原菌生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性和對(duì)非生物脅迫的耐受性有著重要的影響[21-22]。目前，已有很多禾谷鐮刀菌生防菌抗抗菌物質(zhì)的研究報(bào)道，主要傾向于生防菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，但其具體的生防機(jī)制尚不明確[5,7]。楊洋[23]研究了小麥赤霉病拮抗菌解淀粉芽孢桿菌FZB42的拮抗機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其主要抗菌活性物質(zhì)為桿菌毒素D和泛革素兩種脂肽類(lèi)物質(zhì)，其中桿菌毒素D可以誘導(dǎo)禾谷鐮孢菌細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累以及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。程超等[24]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶溶桿菌OH11產(chǎn)生的一種熱穩(wěn)定抗真菌物質(zhì)HSAF對(duì)小麥赤霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用，不僅抑制禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)以及分生孢子產(chǎn)生，而且導(dǎo)致菌絲形態(tài)、幼殖體形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生畸變，同時(shí)使病原菌細(xì)胞對(duì)環(huán)境脅迫更為敏感。鄭小亮等[25]的研究也得到類(lèi)似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Z1-2產(chǎn)生的活性蛋白使禾谷鐮刀菌的菌絲形態(tài)畸形、底端膨大、抑制孢子萌發(fā)，對(duì)禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的抗菌作用。裴韜等[26]對(duì)小麥赤霉病拮抗菌枯草芽孢桿菌P72的抑菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)0.5 M NaCl溶液洗脫得到的蛋白物質(zhì)對(duì)小麥赤霉病菌的拮抗能力最強(qiáng)，該蛋白分子量約40 ku，且在酸性條件下穩(wěn)定。Dunlap等[27]通過(guò)對(duì)小麥赤霉病拮抗菌解淀粉芽孢桿菌AS43.3的全基因組進(jìn)行分析，證實(shí)了該菌能產(chǎn)生的伊枯草素、表面活性素、泛革素、鐵載體、溶桿菌素、抗生素等抗菌活性物質(zhì)，并且這些抗菌活性物質(zhì)的代謝調(diào)控與對(duì)應(yīng)的基因簇密切相關(guān)。周清等[28]分離得到1株小麥赤霉病高效拮抗菌株奇異變形桿菌DY05，其發(fā)酵液和無(wú)細(xì)胞上清均可顯著抑制禾谷鐮刀菌菌絲體生長(zhǎng)（抑制率分別為79.50%和51.25%）和分生孢子萌發(fā)（抑制率均為100%）。本文初步明確了小麥赤霉病拮抗菌紅球菌Y-1的主要抗菌活性成分為揮發(fā)性、非蛋白類(lèi)物質(zhì)，其對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌率分別為57.5%和77.4%，但具體是哪一種或哪幾種活性物質(zhì)發(fā)揮抗菌作用尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步明確了紅球菌Y-1菌株的最佳發(fā)酵條件和其主要抑菌活性物質(zhì)類(lèi)型，證明了該菌株對(duì)小麥赤霉病菌具有較好的抑菌作用，為其菌劑開(kāi)發(fā)及對(duì)小麥赤霉病的生物防治提供了科學(xué)依據(jù)。在下一步研究中，應(yīng)加強(qiáng)Y-1菌株生防機(jī)理等方面的探究。