張福良，馬圣明，邢月騰，曹金澤，劉 芳

（安陽工學(xué)院，河南 安陽 455000）

作為一種疫苗可預(yù)防的疾病，世衛(wèi)組織建議在乙型腦炎構(gòu)成公共衛(wèi)生問題的所有國家（地區(qū)）進(jìn)行常規(guī)免疫接種，并竭力實現(xiàn)最高的疫苗接種覆蓋率。Amicizia等，Sunwoo等和Yang等的研究表明在成功開展了針對兒童的乙型腦炎疫苗接種的國家中，發(fā)病率顯著下降[1-3]。實際上，Campbell等調(diào)查顯示在建立了高質(zhì)量疫苗接種程序的國家（例如日本和韓國）中，該疾病的發(fā)病率估計為每10萬人0.003，而在疫苗接種覆蓋率不足的地區(qū)（例如柬埔寨、印度尼西亞和馬來西亞）發(fā)病率為每10萬人中3.7[4]。目前全球范圍內(nèi)使用的乙腦疫苗主要有三種：鼠腦滅活疫苗、細(xì)胞滅活疫苗和乙腦減毒活疫苗。鼠腦滅活疫苗曾是生產(chǎn)最廣泛、國際上應(yīng)用最廣的疫苗，但是由于擔(dān)心疫苗的不良影響（包括急性擴散性腦脊髓炎）而不再使用。

1 鼠源性乙腦滅活疫苗

20世紀(jì)50年代日本成功研制了全球第一種乙型腦炎病毒鼠腦疫苗，系由JEV中山株（Nakayama strain）感染小鼠大腦而產(chǎn)生的滅活疫苗(JE-VAX; Biken Institute)，也是目前惟一獲得WHO批準(zhǔn)并且商品化的人用乙型腦炎滅活疫苗。Heffelfinger等和Ishikawa等指出在幾個亞洲國家的全國疫苗接種計劃中實施以后可以產(chǎn)生大約90%防控效果，使得日本腦炎感染率明顯減少[5-6]。1989年以來，又生產(chǎn)了另一種基于Beijing-1株的小鼠乙型腦炎病毒滅活疫苗，該疫苗可以引發(fā)更強和更廣的保護(hù)性免疫應(yīng)答。但這些疫苗也產(chǎn)生一些常見的不良反應(yīng)，如紅斑、腫脹、壓痛、發(fā)熱、頭痛和頭暈等，且被懷疑與嚴(yán)重急性彌漫性腦脊髓炎和超敏反應(yīng)有關(guān)；此外由于生產(chǎn)成本高、缺乏長期免疫效果，在急需疫苗的貧困農(nóng)村地區(qū)不實用，因而促使了更安全的疫苗的開發(fā)，例如滅活的Vero細(xì)胞培養(yǎng)衍生疫苗和減毒活疫苗。出于安全考慮，2005年日本政府暫時取消了使用滅活的小鼠腦滅活疫苗進(jìn)行常規(guī)免疫的建議，同時建議新一代疫苗逐漸取代滅活的小鼠腦源性疫苗。

2 細(xì)胞源性乙腦滅活疫苗

通過更加嚴(yán)格的生產(chǎn)過程生產(chǎn)的細(xì)胞源性乙腦滅活疫苗已經(jīng)取代組織滅活疫苗。迄今為止，已經(jīng)生產(chǎn)了不同的細(xì)胞培養(yǎng)來源的滅活疫苗。其中，基于減毒乙型腦炎疫苗株SA 14-14-2適應(yīng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)的以氫氧化鋁為佐劑、甲醛滅活的IC51疫苗（Valneva Scotland Limited生產(chǎn)，美國和歐洲命名為IXIARO?，澳大利亞和新西蘭命名為JESPECT?）于2009年首次獲得許可，并通過技術(shù)協(xié)議轉(zhuǎn)讓給Biological E Limited于2012年在印度以JEEV?的身份獲得許可，此后在其他亞洲國家也獲得許可。IXIARO?疫苗是唯一在美國和歐洲獲得許可并可以購買的日本腦炎疫苗，已被批準(zhǔn)用于2個月以上的兒童。初次接種疫苗采取間隔28天肌注兩次，對于有疾病風(fēng)險的成年人，建議在初次免疫后第二年內(nèi)增加劑量，2個月至36個月的兒童劑量減半。

其他基于Vero細(xì)胞生產(chǎn)的滅活疫苗包括Beijing-1疫苗株滅活疫苗（Biken公司生產(chǎn)的JEBIK?V 和 Kaketsuken生產(chǎn)的 ENCEVAC?在日本獲得許可）、Beijing P3株滅活疫苗（JEVAC?，遼寧成大生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，在中國獲得許可）以及印度乙型腦炎病毒基因III型Kolar-821564XY株（JENVAC?，Bharat Biotech制造并在印度獲得許可）。這些疫苗目前在國際上的使用分布有限，IC51疫苗（IXIARO?）已經(jīng)獲得有關(guān)安全性和免疫原性的大量數(shù)據(jù)。Roberts等對疫苗3期試驗研究數(shù)據(jù)指出，IC51具有非常好的安全性，類似于安慰劑[7]。Erra在成人和兒童中的臨床試驗中還表明，接種兩倍劑量IC51疫苗可誘導(dǎo)針對JEV基因型I-IV的高中和抗體滴度和高血清轉(zhuǎn)化率[8]。Pato等研究表明在成年人中，初次免疫后觀察到疫苗保護(hù)作用會逐漸下降，基礎(chǔ)免疫1～2年后給予加強免疫可導(dǎo)致中和抗體滴度明顯提升，并且加強免疫后6年以內(nèi)＞ 95%的病例存在持續(xù)保護(hù)性免疫[9]。Okada等對JEBIK?V和ENCEVAC?疫苗的研究表明成人單劑注射后血清轉(zhuǎn)化率為86.8%，三劑接種后兒童血清轉(zhuǎn)化率為100%[10]。據(jù)Yun等報道，約有14%的病例發(fā)生了嚴(yán)重的不良事件，但與疫苗本身無關(guān)，只是發(fā)生了一次高熱驚厥[11]。Liu 等指出在中國，1967年開始生產(chǎn)和使用基于倉鼠原代腎細(xì)胞（Primary hamster cell，PHK）培養(yǎng)生產(chǎn)的滅活疫苗，使用的是乙型腦炎病毒北京P3毒株，副作用相對較小且容易制造，療效在76%到90%之間[12]。

3 SA 14-14-2減毒活疫苗

減毒活疫苗似乎真正給乙型腦炎病毒疫苗開發(fā)帶來了廣闊前景，因為活病毒顆粒建立疫苗免疫應(yīng)答所需的病毒劑量更少，也使得疫苗價格更便宜，這使得乙型腦炎防控更容易。20世紀(jì)80年代，一種基于SA 14-14-2毒株的減毒活疫苗開始在中國以及隨后在亞洲其他國家被開發(fā)并批準(zhǔn)用于人類，其商品名為CD.JEVAX?（成都生物制品研究所，中國）。Yu等證明 SA 14-14-2減毒株被具有遺傳穩(wěn)定性、高度免疫原性，在小鼠中無神經(jīng)毒力并且在蚊子中不能復(fù)制[13]。Gromowski等研究指出SA14-14-2毒株致弱的分子基礎(chǔ)可能是E蛋白中的6個氨基酸和NS基因中的3個氨基酸突變造成[14]。

自從獲得許可以來，已經(jīng)有數(shù)百萬人接種了減毒活SA 14-14-2疫苗，該疫苗已在中國廣泛使用，根據(jù)國家疫苗接種計劃的建議，該疫苗適用于8月齡的兒童，2歲時加強劑量接種。韓國（自1999年起）、尼泊爾（自2001年起）、印度（自2006年起）和泰國（自2007年起）也已推薦使用該疫苗。由于減毒SA 14-14-2活疫苗具有很高的免疫原性，因此一些國家在國家疫苗接種計劃中加入了單一劑量的疫苗。

Torresi等指出在中國、尼泊爾和韓國的兒童中進(jìn)行的臨床試驗表明，即使在單劑量接種后，這種減毒活疫苗也具有很高的免疫原性和功效，在中國成人和兒童中，血清轉(zhuǎn)化率在94%至100%之間，功效為85～98%[15]。此外，Ohrr等證明對以前接受過兩劑和三劑滅活的鼠腦滅活疫苗的兒童接種的SA 14-14-2減毒疫苗是安全的，可顯著提高抗體水平[16]。

4 嵌合減毒活疫苗

一 種 名 為 IMOJEV?或JE-CV（Chimer VAX?-JE, Sanofi Pasteur, France）的基因工程減毒活疫苗，已于2010年首次注冊并在多個國家獲得了用于兒童和成人預(yù)防日本腦炎的許可證。該疫苗毒株是用SA 14-14-2疫苗株的prM-E基因替換了黃熱病病毒（Yellow fever virus, YFV）疫苗株YFV-17D的相應(yīng)基因。Guirakhoo和Monath等研究證實這種嵌合疫苗在遺傳上穩(wěn)定，在小鼠和非人類靈長類動物接種后可以誘導(dǎo)免疫保護(hù)[17-18]。Chokephaibulkit等進(jìn)一步研究證明毒株致弱的分子基礎(chǔ)是JEV SA 14-14-2毒株的E蛋白包含至少四個氨基酸殘基的突變，這是病毒神經(jīng)毒力表型所必需的[19]。

Feroldi等在對成人和兒童進(jìn)行的幾項II期和III期研究中證明了嵌合毒株的免疫原性和安全性，特別是疫苗免疫原性的隨機對照III期研究表明，在接種后28天，成人和兒童單劑量接種這種嵌合疫苗誘導(dǎo)的血清轉(zhuǎn)化率分別大于99%和95%。此外，當(dāng)將嵌合疫苗作為一種強化疫苗接種之前已經(jīng)接種過一次滅活疫苗或減毒疫苗的兒童時，乙腦嵌合疫苗是有效的。加強疫苗接種誘導(dǎo)的中和和交叉中和抗體對不同野生型的JEV基因型I-IV株具有保護(hù)作用，95.7%和97.9%的病例免疫后持續(xù)5年以上[20]。

5 其他疫苗

目前，幾種候選疫苗仍處于研發(fā)的各個階段，主要包括：重組蛋白疫苗、重組/嵌合病毒疫苗和DNA疫苗等?；旧希羞@些疫苗都含有JEV E糖蛋白，該蛋白具有大多數(shù)病毒中和表位，是較好的免疫原。

5.1 基于重組蛋白的乙型腦炎病毒疫苗

已知乙型腦炎病毒的E蛋白對于諸如受體結(jié)合和融合的各種功能很重要，并且能夠誘導(dǎo)免疫保護(hù)。該蛋白質(zhì)在不同的表達(dá)系統(tǒng)中以多種形式表達(dá)，在以小鼠為動物模型試驗中中測試了E蛋白的免疫原性，其中，大腸桿菌和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是常用于此目的的兩種表達(dá)載體。

5.2 基于重組病毒的乙型腦炎病毒疫苗

重組病毒在疫苗開發(fā)中很重要，已經(jīng)使用了許多重組病毒，每個重組病毒都有自己獨特的功能。能夠同時誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答是所有重組/嵌合疫苗的共同特征。在重組病毒策略中，外源性抗原以類似于自然感染的方式被宿主免疫系統(tǒng)呈遞并加工，許多病毒已用于生產(chǎn)乙型腦炎病毒疫苗，包括痘病毒、麻疹病毒、腺病毒、黃熱病毒。

5.3 DNA疫苗

近年來，質(zhì)粒DNA疫苗由于能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的免疫應(yīng)答而受到了廣泛關(guān)注，包括誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生、產(chǎn)生CD4+輔佐細(xì)胞和CD8+CTL以及對一系列病毒感染提供保護(hù)。此外，質(zhì)粒DNA疫苗也是有效的、安全的、且易于生產(chǎn)，并且不會干擾其他黃病毒或疫苗載體已經(jīng)存在的抗體。在質(zhì)粒DNA疫苗免疫中，將編碼有效抗原或其部分的DNA置于細(xì)菌質(zhì)粒之中，該質(zhì)粒在強真核啟動子的控制下通過不同的途徑（如肌肉或皮下）給藥，然后將質(zhì)粒內(nèi)吞，由MHC-I類分子進(jìn)行內(nèi)源性抗原呈遞產(chǎn)生CD8+ CTL反應(yīng)；除此之外，APC對可溶性抗原的攝取還導(dǎo)致通過MHC-II類分子呈遞產(chǎn)生CD4+Th反應(yīng)。在過去的幾年中，已經(jīng)開發(fā)出使用結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)基因的針對乙型腦炎病毒的DNA疫苗，并已在具有不同功效的動物模型中對其進(jìn)行了評估。

1998年首個乙型腦炎病毒質(zhì)粒DNA疫苗產(chǎn)生，命名為pcDNA3JEME，其中整合了病毒的E基因和PrM基因，Konishi等證明免疫小鼠后產(chǎn)生了中和抗體，其中70%的小鼠在致死性挑戰(zhàn)后存活下來，CTL和B細(xì)胞反應(yīng)均被激活，并在免疫小鼠的脾細(xì)胞中持續(xù)長達(dá)6周[21]。后來，Chai等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)單次肌肉注射可提供保護(hù)作用，從而保護(hù)小鼠免受致命性攻擊[22]。Ashok等評估缺少信號肽的編碼E蛋白的DNA疫苗的免疫原性實驗表明，在不產(chǎn)生抗病毒抗體的情況下，可以保護(hù)免疫復(fù)合物免受攻擊[23]。Kaur等進(jìn)一步試驗表明顆粒形式的質(zhì)粒DNA可以增強的小鼠免疫原性[24]。

盡管各種針對乙型腦炎病毒的疫苗開發(fā)方法已經(jīng)進(jìn)行了嘗試，這些針對乙型腦炎病毒的新型疫苗雖然在實驗室中顯示出了良好前景，但遺憾的是，它們在臨床中均尚未成功，因此，還需要對此進(jìn)行進(jìn)一步深入、詳盡的評價。

目前，乙型腦炎病毒疫苗接種策略和深入的研究是未來開發(fā)成功的乙型腦炎病毒疫苗所需要的，Kumar等提出了乙型腦炎病毒疫苗開發(fā)戰(zhàn)略流程（圖1）[25]。此外，還需要廣泛的關(guān)注和探索一些新的候選疫苗，迫切需要開發(fā)新一代疫苗，以有效地防控乙型腦炎。

圖1 JEV疫苗開發(fā)戰(zhàn)略流程[25]