劉倩，盧恒，王曉，劉偉，劉峰，耿巖玲

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014）

金銀花（Lonicera Japonica Thunb.）為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初放的花，主要分布在我國山東、河南、湖南、湖北、廣東、廣西等地，其中山東、河南為主要栽培區(qū)[1]。金銀花始載于李時珍的《本草綱目》，并在2002年被衛(wèi)生部新增為藥食同源植物，其主要有效成分有綠原酸、黃酮和揮發(fā)油等，具有抗癌、抗菌、清熱解毒、涼血止痢、疏散風(fēng)熱之功效，其中綠原酸和異綠原酸具有廣譜抗菌、抗氧化的作用；黃酮類化合物如木犀草苷等具有消炎、改善心血管功能以及抗癌作用；揮發(fā)油具有抑菌、抗病毒的作用[2-4]。金銀花作為一種藥食同源的傳統(tǒng)中藥材，具有較高藥用價值和保健功能，多用于治療風(fēng)熱感冒、癰腫疔瘡、熱毒血痢等癥，除被大量應(yīng)用于臨床治療以外，目前在食品領(lǐng)域也被廣泛使用，如新鮮的金銀花和加工后的金銀花干品均可作為飲用茶[5-6]。

隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，茶類飲品在我國各類飲品中比例逐漸提高，同時，人們對于各種茶類飲品在口感和療效上的訴求也不斷提高，而在制茶加工過程中，不同的工藝參數(shù)會對產(chǎn)品品質(zhì)造成一定的影響[7-9]。近年來，作為一種日常保健飲品的代用茶，金銀花茶的研究與開發(fā)也逐步引起人們的重視，但目前金銀花茶的生產(chǎn)主要是將藥用金銀花通過初步篩選后，再包裝或者復(fù)配而成，而關(guān)于金銀花茶加工工藝的研究，仍處于初級階段，尤其是制茶工藝與相關(guān)化學(xué)成分變化方面的研究鮮有報道。

本試驗探究金銀花茶的加工工藝，包括加工方法、時間、加工溫度等，采用高效液相色譜法檢測金銀花的主要活性成分含量，如綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、木犀草苷、馬錢苷、蘆丁和槲皮素等，并進(jìn)一步運用氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography ion mobility spectroscopy，GC-IMS） 法分析金銀花中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，結(jié)合感官評定結(jié)果，確定金銀花茶的最優(yōu)加工工藝，以期為金銀花的開發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)（配有二極管陣列檢測器）：美國Waters公司；氣相離子遷移譜儀[配有分析軟件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和3款插件以及GC×IMS Library Search]：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；BSA電子分析天平：德國賽多利斯公司；TYP10S超純水機(jī)：濟(jì)南太平瑪環(huán)保設(shè)備有限公司；SB-5200D型高功率數(shù)控超聲波儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；D238B1型東芝電烤箱：廣東美的廚房電器制造有限公司；XUNTU-TH667935炒茶機(jī)：國匠食品機(jī)械廠；HF-881-2型熱風(fēng)循環(huán)干燥機(jī)：吳江華飛電熱設(shè)備有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

試驗所需樣品為臨沂市采摘的優(yōu)質(zhì)金銀花，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李佳教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的花；綠原酸（批號：Y24J7K16726）、異綠原酸 C（批號：MUST-14111414）、木犀草苷（批號：MUST-15012204）、馬錢苷（批號：R23D7F27552）、槲皮素（批號：C09S8Y43412）、蘆?。ㄅ枺篩22S6S3719）：上海源葉生物科技有限公司；異綠原酸A（批號：160309）：上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；異綠原酸B（批號：14534-61-3）：寶雞市辰光生物科技有限公司；乙腈、乙酸（色譜純）：美國Tedia公司。其他試劑為分析純。

1.3 金銀花預(yù)處理

采集好的金銀花樣品，仔細(xì)挑選，清理雜質(zhì)后沖洗干凈，放置于托盤中攤晾。將金銀花經(jīng)過以下3種方式加工處理。

1）烘制加工：每次稱取100 g金銀花，放置于烘盤上，放入熱風(fēng)循環(huán)干燥機(jī)中，烘制溫度分別設(shè)置為100、120℃，時間為3 h，得到樣品1號、2號。

2）炒制加工：每次稱取100 g金銀花，放入炒鍋內(nèi)，調(diào)制功率分別為 110、220、330、440 W，炒至金銀花變色為止，得到樣品3號～6號。

3）烤制加工：每次稱取100 g金銀花，放入烤盤中，烤制溫度分別設(shè)置為120、150、180℃，時間為20 min，得到樣品7號～9號。

1.4 有效成分含量測定

1.4.1 供試品溶液的制備

將金銀花樣品1號～9號及金銀花鮮樣（10號樣品）經(jīng)自然放置干燥后，分別粉碎，過4號篩（60目）。精密稱取金銀花藥材粉末0.2 g，加入甲醇溶液10 mL，水浴（40℃）提取10 min后加入純水5 mL，超聲（功率250 W，頻率20 kHz）30 min復(fù)提，用70%甲醇水溶液補足減失的質(zhì)量，提取液過0.22 μm有機(jī)濾膜，即得供試品溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取綠原酸、馬錢苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮素對照品適量，加甲醇配制成濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液，其中木犀草苷（70%甲醇）配制為0.5 mg/mL的對照品溶液，均于4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 色譜條件

Waters2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC），Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。流動相A為乙腈，流動相B為水（0.2%甲酸），梯度洗脫：0～10 min，8%～10%A；10 min～20 min，10%～15%A；20 min～30 min，15%～15%A；30 min～40 min，15%～25%A；40 min～50 min，25%～30%A，50 min～51 min，30%～100%A；51min～60min，100%～100%A；流速：1.0mL/min。

1.4.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

1.4.4.1 線性關(guān)系考察

將綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、馬錢苷、蘆丁、木犀草苷、槲皮素8種對照品溶液分別稀釋，得到不同濃度的對照品混合溶液[10-13]，通過HPLC進(jìn)行線性分析。

1.4.4.2 精密度試驗

取樣品1號，按1.4.1項下前處理方法制成供試品溶液，精密吸取供試樣品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測得其中8個特征峰的峰面積和保留時間，分別計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4.4.3 穩(wěn)定性試驗

取樣品1號，按照1.4.3項下的色譜條件，分別在0、3、6、9、15、24 h 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖中特征峰的峰面積和保留時間，分別計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4.4.4 重復(fù)性試驗

取樣品1號，按1.4.1項下處理方法制成供試品溶液6份，按照1.4.3項下的色譜條件測定，測得8個特征峰的峰面積和保留時間，并計算RSD值。

1.4.4.5 樣品的含量測定

分別取不同加工方法處理得到的10批金銀花，采用1.4.1供試品溶液制備方法制備樣品溶液，采用1.4.3色譜分析條件分別對綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、馬錢苷、蘆丁、木犀草苷、槲皮素進(jìn)行HPLC-DAD測定，記錄色譜峰面積，將面積帶入回歸方程，計算各成分含量。

1.5 離子遷移譜

1.5.1 供試樣品預(yù)處理

稱取1～10號金銀花樣品各1 g，置于20 mL頂空瓶中，80℃孵育15 min后進(jìn)樣。

1.5.2 離子遷移譜分析條件

色譜柱類型：FS-SE-54（15 m），內(nèi)徑：0.53 mm，分析時間25 min，柱溫55℃，IMS溫度50℃，載氣/漂移氣為N2。采用自動頂空進(jìn)樣，進(jìn)樣體積200 μL，孵育時間15 min，孵育溫度80℃，進(jìn)樣針溫度85℃，孵化轉(zhuǎn)速500r/min。漂移氣流速（E1）為 150 mL/min。氣相載氣流速（E2）為 0～2 min，2 mL/min；2 min～12 min，2 mL/min～50 mL/min；12 min～17 min，50 mL/min～100 mL/min；17 min～20min，100mL/min～150mL/min；20min～25 min，150 mL/min。

1.6 金銀花茶感官品質(zhì)評審方法

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》，邀請13名（6男7女）經(jīng)過相關(guān)專業(yè)訓(xùn)練的人員進(jìn)行評審。精確稱取各種加工方法的金銀花茶樣品2 g，加入沸水100 mL，沖泡5 min，分別對茶樣的外形、湯色、香氣、滋味和湯底5項因子進(jìn)行打分，按照表1的評分標(biāo)準(zhǔn)，取13人評價結(jié)果的平均值，作為測定結(jié)果[14-16]。

表1 金銀花茶感官評價評分細(xì)則Table 1 Sensory evaluation and scoring rules of Lonicera japonica tea

1.7 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)LAV和GC×IMS Library Search Software軟件分析得出樣品中VOCs的差異譜圖，并建立匹配矩陣，利用NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)定性分析[17-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜方法學(xué)結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系結(jié)果

按照1.4.3項下的色譜條件進(jìn)樣分析，得到8種對照品的液相色譜圖，見圖1。以峰面積積分值（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行回歸計算，得到各化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表2。

圖1 金銀花茶及8種對照品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Lonicera japonica tea and 8 reference substances

表2 標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 2 Regression equations，correlation coefficients and linear range of samples

2.1.2 精密性結(jié)果

經(jīng)過方法學(xué)試驗結(jié)果分析表明，8個特征峰保留時間 RSD 值依次為 0.8%、0.8%、0.7%、0.6%、0.8%、0.4%、0.6%、0.9%，均小于1.0%，峰面積RSD值依次是2.8%、1.8%、3.8%、3.5%、3.9%，0.7%、1.9%、0.8%均小于5%，結(jié)果符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性結(jié)果

經(jīng)過方法學(xué)試驗結(jié)果分析表明，8個特征峰保留時間RSD依次是0.9%、1.2%、1.5%、1.1%、0.8%、1.2%、1.6%、0.8%，峰面積RSD依次是3.2%、2.9%、3.3%、3.9%、4.3%、4.1%、1.8%、1.2%，均小于5%，表明樣品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)化學(xué)穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.1.4 重復(fù)性結(jié)果

10種不同加工方法金銀花茶提取物的HPLC圖見圖2。

圖2 10種不同加工方法金銀花茶提取物的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 10 different processing methods of extracts of Lonicera japonica tea

經(jīng)過方法學(xué)試驗結(jié)果分析表明，8個特征峰保留時間的 RSD分別為 0.9%、0.8%、1.0%、1.1%、1.1%、1.2%、0.8%、0.5%，峰面積RSD值分別為3.4%、4.2%、4.5%、0.9%、3.4%、2.9%、4.1%、1.8%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好，綜上所述該方法符合對分析方法可控、可操作及可重復(fù)的基本要求。

2.2 不同加工方法下金銀花中化學(xué)成分的含量

計算出1.4.4.1中8種化合物的相應(yīng)峰面積，同時根據(jù)1.4.4.1方法中回歸方程計算出各化合物的含量，平行3次后，取平均值，結(jié)果見表3。

表3 不同加工方法金銀花茶中化學(xué)成分含量比較Table 3 Comparison of chemical components in Lonicera japonica tea with different processing methodsμg/g

由表3可知，經(jīng)過120℃烘制加工的金銀花茶中的綠原酸、異綠原酸A、蘆丁和木犀草苷的含量較高，均高于其他加工工藝，4號炒制條件下異綠原酸C的含量最高，9號烤制加工得到的金銀花茶中的馬錢苷、槲皮素和異綠原酸B的含量均高于其他加工工藝，由此可知，經(jīng)過加工處理后的金銀花中的有效成分含量明顯增高。

2.3 不同加工方法下金銀花中風(fēng)味物質(zhì)的GC-IMS譜圖對比分析

圖3是不同加工方法金銀花茶特征風(fēng)味二維GC-IMS譜圖，可以直接比較樣品組內(nèi)風(fēng)味物質(zhì)的差異性。紅色垂直線表示反應(yīng)離子峰，其中兩側(cè)的每個點代表一種揮發(fā)性物質(zhì)。點的顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示含量較低，紅色則表示含量較高，隨著顏色加深表示含量逐漸增高；同時一種揮發(fā)性化合物可能產(chǎn)生一個或多個亮點，代表單體或二聚體和三聚體，這主要取決于揮發(fā)性化合物的濃度高低，整個譜圖代表了樣品中全部頂空成分。

圖3 不同加工方法金銀花茶特征風(fēng)味二維GC-IMS譜圖Fig.3 Two-dimensional GC-IMS images of characteristic flavor of Lonicera japonica tea with different processing methods

由圖3可知，對比不同加工方法處理的金銀花茶，具有相同保留時間和遷移時間的揮發(fā)性有機(jī)物，累積含量具有明顯不同，圖上這8個點可作為區(qū)分不同加工方法金銀花茶的指紋圖譜參照點。

2.4 不同加工方法金銀花中風(fēng)味物質(zhì)的GC-IMS定性分析

揮發(fā)性化合物的定性分析見表4。

表4 揮發(fā)性化合物的定性分析Table 4 Qualitative analysis of volatile compounds

在GC-IMS中，根據(jù)氣相色譜的保留時間和離子遷移時間，通過數(shù)據(jù)庫在金銀花中共定性出39種揮發(fā)性成分，包括12種酮類、10種醇類、7種醛類、3種烯烴類、2種烷烴類、2種吡嗪類、2種酯類和1種吡喃類。

2.5 不同加工方法金銀花茶GC-IMS指紋圖譜分析

為了更加全面地對比不同加工方法下的金銀花中揮發(fā)性化合物組分的差異性，使用LAV軟件的Galleryplot插件，選取10組樣品，所得GC-IMS二維圖譜中所有的待分析峰自動生成指紋圖譜，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同加工方法下金銀花茶中揮發(fā)性有機(jī)物的指紋圖譜Fig.4 Fingerprint of volatile organic compounds in Lonicera japonica tea with different processing methods

圖4中每一行代表一個樣品中選取的全部樣品的信號峰。通過不同區(qū)域ABC對比可以看出，加工過的金銀花和生金銀花樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)有明顯的區(qū)別，而不同加工方法的金銀花樣品的揮發(fā)性物質(zhì)之間則有各自的特征峰區(qū)域，同時也有共同的區(qū)域。其中，A中的揮發(fā)性物質(zhì)種類與B、C相差較大，是金銀花鮮品中特有的揮發(fā)性成分，C中的揮發(fā)性物質(zhì)為烘制工藝中產(chǎn)生含量較高的組分，而B中的揮發(fā)性物質(zhì)則在炒制和烤制過程中產(chǎn)生濃度較高的組分，可以看出通過GC-IMS能夠快速準(zhǔn)確地區(qū)分出金銀花鮮品，并初步區(qū)分出烘制、炒制和烤制的金銀花茶。

2.6 不同加工方法的金銀花茶的感官評價結(jié)果

感官評價包括差別性分析、偏好性分析和描述性分析，其中描述性分析是通過描述術(shù)語對樣品的感官特征進(jìn)行客觀的評價，目前在食品感官品評中應(yīng)用最為廣泛，能夠精確分析一系列不同產(chǎn)品感官之間的具體差異，從而最大程度上獲得食品的風(fēng)味信息，因此，可以應(yīng)用于食品新產(chǎn)品開發(fā)、產(chǎn)品改進(jìn)以及質(zhì)量控制等多個方面。不同加工方法金銀花茶的感官評價結(jié)果見表5。

表5 不同加工方法金銀花茶的感官評價結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of Lonicera japonica tea with different processing methods

由表5可知，金銀花茶綜合評價總體情況較好，經(jīng)過不同加工方法得到的金銀花茶的滋味、湯色和香氣均在80分以上，但是，其中低溫炒制由于炒制時間過長，導(dǎo)致外形破碎；高溫炒制由于溫度過高不易控制顏色變化，從而導(dǎo)致外形較差，容易焦糊，而影響了最終得分。而合適的溫度得到的金銀花茶的綜合評價都較好，同時金銀花生茶在湯色和滋味上比加工過的金銀花茶略差。

3 結(jié)論

本研究以3種制茶工藝得到的9種金銀花樣品和1種金銀花生品為原料，建立了金銀花茶的HPLC指紋圖譜，比較了樣品組之間8種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量的高低，發(fā)現(xiàn)在烘制120℃和烤制180℃條件下的金銀花茶中綠原酸、黃酮以及環(huán)烯醚萜苷的含量較高；基于GCIMS的結(jié)果，分析了金銀花鮮樣和加工過的金銀花茶中揮發(fā)性成分的差異性，通過結(jié)合指紋圖譜中的特征成分，可以初步區(qū)分不同加工工藝得到的金銀花茶；同時感官評價測定的結(jié)果顯示金銀花加工制茶受加工方法影響不大，而受加工溫度影響較為明顯，在120℃條件下烘制和烤制的金銀花茶的感官評價的分值均較高。結(jié)合試驗數(shù)據(jù)分析，最終確定在120℃條件下烘制得到的金銀花茶具有較多的活性成分，同時兼顧較好的口感和外觀。