梁 猛 謝雯凈

肝細胞癌（HCC）是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率。有80%～90%的原發(fā)性肝癌患者為HCC，每年可致近60萬人死亡[1-3]。研究表明，肝硬化、HBV/丙型肝炎病毒（HCV）感染、肥胖、黃曲霉毒素污染、過量飲酒和環(huán)境污染等因素可誘發(fā)HCC[4]。目前治療HCC的方法包括經(jīng)皮消融、肝移植和口服索拉非尼等，但尚不能完全治愈HCC。因此，應進一步探索新的有效治療靶點，為HCC的診療開辟新的途徑。

lncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA分子，定位于1q12.3，有11個外顯子，可參與轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞分化、染色質(zhì)修飾等生物學過程。多項研究表明，lncRNA參與了多種惡性腫瘤的發(fā)病機制和病情進展[5-6]。Wang等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG1在膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)，沉默其表達可抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖。Zhang等[8]的研究表明，lncRNA SNHG1可通過抑制miR-195表達促進HCC細胞的增殖和遷移。但目前關(guān)于lncRNA SNHG1與HCC患者預后關(guān)系的報道較少。miRNA是一類小分子RNA，長度為19～22個核苷酸，其在多種惡性腫瘤的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-339-3p可參與肺癌、膠質(zhì)母細胞瘤等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[9-10]，但其在HCC中的作用尚未明確。本研究旨在探討lncRNA SNHG1和miR-339-3p在HCC中的表達及臨床意義，以期為HCC的有效治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年9月至2018年9月在十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院）進行手術(shù)切除治療的108例HCC患者的腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣＞3 cm處）標本。108例患者中，男69例，女39例，年齡43～69歲，平均年齡為（53.78±11.68）歲。108例HCC患者的病理分級根據(jù)Edmondson分級法分為Ⅰ～Ⅱ級51例，Ⅲ～Ⅳ級57例；根據(jù)TNM分期標準將患者分為Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期61例[11]。另收集患者的腫瘤直徑、乙型肝炎病史及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床資料。術(shù)中取材的所有組織標本在采集后立刻進行速凍處理，之后置于-80 ℃的冰箱中保存、待測。納入標準：（1）術(shù)前未接受過放射治療和化學治療；（2）均為原發(fā)性肝癌，并經(jīng)病理檢查確診為HCC；（3）未合并有其他系統(tǒng)惡性腫瘤；（4）均簽署知情同意書。排除標準：（1）繼發(fā)性肝癌；（2）心、腎等其他重要器官功能不全；（3）合并自身免疫病。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 lncRNA SNHG1和miR-339-3p表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測HCC組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG1和miR-339-3p的表達水平。將組織剪碎后，使用TRIzol?試劑（購自美國Ambion公司）提取組織中的總RNA，并經(jīng)NanoDrop 2000型分光光度計（購自美國Thermo公司）測定RNA的質(zhì)量和濃度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒[購自寶生物工程（大連）有限公司]進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系為：cDNA產(chǎn)物 2 μL，2×SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ 8 μL，上下游引物各 1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase-Free H2O 7.6 μL。反應條件為：95 ℃預變性3 min ；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s， 共 40 個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算lncRNA SNHG1和miR-339-3p的相對表達量。實驗所用引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 血清甲胎蛋白水平檢測

受試者于入院次日清晨空腹采集靜脈血4 mL，置于含促凝劑的采血管中，室溫放置1 h，之后以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心8 min，將分離后的血清置于-80 ℃環(huán)境備用。采用美國雅培AXSYM免疫化學發(fā)光儀及配套試劑檢測血清甲胎蛋白水平，按照說明書進行操作。

1.4 隨訪

本研究采用電話、門診復查等方式對術(shù)后患者進行為期3年的隨訪。術(shù)后第1年每3個月隨訪1次，1年后每3～6個月隨訪1次。隨訪截止時間為2021年9月，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結(jié)束。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，采用Cox比例風險回歸模型分析影響患者預后的危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織與癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG1和miR-339-3p的表達水平比較

HCC組織中l(wèi)ncRNA SNHG1的相對表達量為3.27±0.33，顯著高于癌旁組織（1.08±0.15），2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。HCC組織中miR-339-3p的相對表達量為0.45±0.03，顯著低于癌旁組織（1.12±0.09），2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 lncRNA SNHG1和miR-339-3p的表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)HCC組織中l(wèi)ncRNA SNHG1相對表達量的中位數(shù)（3.54），將患者分為lncRNA SNHG1高表達組（≥3.54）和lncRNA SNHG1低表達組（＜3.54）；另根據(jù)miR-339-3p相對表達量的中位數(shù)（0.51），將患者分為miR-339-3p高表達組（≥0.51）和miR-339-3p低表達組（＜0.51）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同lncRNA SNHG1和miR-339-3p表達水平的患者在性別、年齡、腫瘤直徑及血清甲胎蛋白水平方面的差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。lncRNA SNHG1高表達組中Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有乙型肝炎病史、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者占比顯著高于lncRNA SNHG1低表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。miR-339-3p高表達組中Edmondson分級為Ⅲ～Ⅳ級、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有乙型肝炎病史、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者占比顯著低于miR-339-3p低表達組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 lncRNA SNHG1和miR-339-3p的表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

續(xù)表2 lncRNA SNHG1和miR-339-3p的表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.3 lncRNA SNHG1與miR-339-3p的結(jié)合位點

本研究通過生物學軟件miRDB（http://mirdb.org/）預測發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG1與miR-339-3p之間存在結(jié)合位點，詳見圖1。

圖1 lncRNA SNHG1與miR-339-3p的結(jié)合位點預測圖

2.4 lncRNA SNHG1和miR-339-3p的表達水平與患者的預后生存分析

lncRNA SNHG1高表達組的3年總生存率為33.90%（20/59），顯著低于lncRNA SNHG1低表達組（71.43%，35/49）；miR-339-3p低表達組的3年總生存率為34.43%（21/61），顯著低于miR-339-3p高表達組（65.96%，31/47），組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 lncRNA SNHG1和miR-339-3p的表達水平與患者的預后生存分析 A lncRNA SNHG1 B miR-339-3p

2.5 影響HCC患者預后的多因素Cox回歸分析

以生存結(jié)局和生存時間作為因變量，以Edmondson分級（Ⅰ～Ⅱ級＝1，Ⅲ～Ⅳ級＝2）、TNM分期（Ⅰ～Ⅱ期＝1，Ⅲ～Ⅳ期＝2）、乙型肝炎病史（有＝1，無＝2）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有＝1，無＝2）、lncRNA SNHG1 水平（≥3.54＝1，＜3.54＝2）和miR-339-3p水 平（＜0.51＝1，≥0.51＝2）作為自變量，納入多因素Cox回歸分析模型，結(jié)果顯示高Edmondson分級、高TNM分期、乙型肝炎病史、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA SNHG1高表達及miR-339-3p低表達均是影響患者預后生存的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表3。

表3 影響HCC患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討論

HCC是常見的惡性腫瘤，具有較高的復發(fā)率，導致患者預后不良。lncRNA在多種惡性腫瘤中表達失調(diào)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和各種生物學過程中起著關(guān)鍵作用，已受到越來越多的關(guān)注[12-13]。lncRNA SNHG1是一種新發(fā)現(xiàn)的致癌因子，可在非小細胞肺癌、胰腺癌、宮頸癌和胃癌等的病程中發(fā)揮作用。Zhang等[14]通過GEO數(shù)據(jù)庫中l(wèi)ncRNA微陣列數(shù)據(jù)集搜索差異表達的lncRNA，發(fā)現(xiàn)與配對正常肝組織相比，lncRNA SNHG1在HCC組織中表達上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，lncRNA SNHG1在HCC組織中的表達水平顯著升高；并且其表達水平與Edmondson分級、TNM分期、乙型肝炎病史及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。此外，本研究評估了lncRNA SNHG1的表達水平與臨床結(jié)局之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG1高表達預示著HCC患者術(shù)后總生存率較低。上述結(jié)果表明，lncRNA SNHG1在HCC中表達上調(diào)，可作為HCC患者的一種新的預后生物標志物。

研究表明，lncRNA可以通過競爭性結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。Pei等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，干擾lncRNA SNHG1可通過促進miR-448的表達抑制Treg細胞分化，從而阻止乳腺癌細胞的免疫逃逸。李銳等[17]的研究表明，lncRNA SNHG1可通過靶向miR-330增強胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥作用。本研究結(jié)果顯示，lncRNA SNHG1與miR-339-3p之間存在結(jié)合位點；miR-339-3p在HCC組織中表達下調(diào)，且其與Edmondson分級、TNM分期、乙型肝炎病史及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)；miR-339-3p低表達預示著HCC患者術(shù)后總生存率較低。上述結(jié)果提示，miR-339-3p可能是HCC的潛在預后預測因子。

綜上所述，lncRNA SNHG1和miR-339-3p在HCC患者中表達上調(diào)，且兩者可作為HCC患者潛在的預后生物標志物。本研究的樣本量較小，且并未對HCC的病因如病毒性肝炎（HBV/HCV感染）、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病等進行統(tǒng)計，今后需進一步探究。