林 偉， 陳仲輝， 李金秋， 李 魁， 方建禪， 陳 宇*

( 1. 莆田學(xué)院附屬醫(yī)院 中心實驗室， 福建 莆田 351100 ；2. 莆田學(xué)院附屬醫(yī)院 乳腺外科， 福建 莆田 351100 )

乳腺癌是威脅全球女性健康的第一大惡性腫瘤， 是導(dǎo)致女性死亡的第二大原因[1]。 2019 年國家癌癥中心發(fā)布了中國地區(qū)惡性腫瘤的發(fā)病情況， 乳腺癌以17.1%的發(fā)病率高居我國女性惡性腫瘤首位， 成為威脅女性身心健康的主要疾病之一[2]。 三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是以缺乏雌激素受體(ER)、 孕激素受體(PR)的表達和人表皮生長因子受體-2(HER2)過表達為特征的乳腺惡性腫瘤， 占乳腺癌發(fā)病率的15%～20%[3]。 因缺乏有效的治療靶點， 目前主要使用細胞抑制劑進行化療， 但預(yù)后較差， 轉(zhuǎn)移性 TNBC 患者的5 年生存率低于30%， 死亡率高[4]。 因而尋找一種新型、 更加有效的治療藥物迫在眉睫。

程序性死亡配體1(Programmed death ligand 1，PD-L1)是一種40 kDa 的跨膜蛋白， 在血管內(nèi)皮細胞、 上皮細胞、 自然殺傷細胞、 巨噬細胞、髓樣樹突狀細胞和B 細胞上表達， 在腫瘤細胞免疫抑制和免疫逃逸中起著重要作用[5]。 PD-L1與程序性死亡受體1(PD-1)結(jié)合時， 可阻斷T 細胞活化、 遷移、 增殖和分泌， 介導(dǎo) T 細胞的凋亡[6]。 目前相關(guān)研究表明， PD-L1 是眾多癌癥不良預(yù)后的生物標志物， 其過表達與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移相關(guān)[7]。

PD-L1 表達與乳腺癌臨床病理及預(yù)后的相關(guān)性， 目前也受到了國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注。 但截至目前， 仍少有針對PD-L1 與TNBC 臨床病理相關(guān)性的研究報道， 而TNBC 是乳腺癌中最具免疫原性的一種亞型， 有20%～30%的 TNBC 出現(xiàn)PD-L1 表達[8]。 因此本實驗探討 PD-L1 與 TNBC臨床病理的相關(guān)性， 為TNBC 患者的遠期生存預(yù)測及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選取我院 2019 年 1 月—2021 年 7 月 88 例首次經(jīng)病理確診為TNBC 患者的病理組織。 所有患者均無全身其他部位惡性腫瘤個人史， 在確診前未接受化療、 放療、 內(nèi)分泌治療、 靶向治療等綜合治療措施的女性。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織離體保存與觀察

將上述病理組織經(jīng)10%的福爾馬林固定和石蠟包埋等處理后保存； 將保存的蠟塊進行免疫組化實驗后， 利用中性樹膠進行封片， 待切片干燥后利用顯微鏡觀察。

1.2.2 細胞染色結(jié)果判讀

前提: 以扁桃體作為質(zhì)控片， 陽性質(zhì)控片染色結(jié)果為陽性， 陰性質(zhì)控片染色結(jié)果為陰性。1)陽性: 組織切片中細胞膜部分或完全染色，呈現(xiàn)出黃褐色或棕色； 腫瘤巢內(nèi)或相鄰滋養(yǎng)基質(zhì)層內(nèi)， 直接與腫瘤反應(yīng)相關(guān)的淋巴細胞或巨噬細胞細胞膜染色； 背景無染色。 2)陰性: 組織切片中細胞無黃褐色或棕色染色； 或僅細胞質(zhì)染色。 聯(lián)合陽性分數(shù)(combined positive score，CPS)為任何強度PD-L1 膜染色的腫瘤細胞占整個腫瘤細胞中的百分比。 計數(shù)的TNBC 細胞總數(shù)≥100 個。 若 CPS≥1%， 則判定 PD-L1 陽性； 若CPS＜1%， 則判定 PD-L1 陰性。

以上所有組織切片均經(jīng)我院病理科兩名副主任及以上醫(yī)師閱片確認。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計分析軟件和GraphPad Prism 8 繪圖軟件對數(shù)據(jù)進行分析， 所有數(shù)據(jù)采用“均值±標準差” (ˉx ± s) 表示， 組間比較采用皮爾遜卡方檢驗和費希爾精確檢驗， 以P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 88 例 TNBC 的基本特征

本實驗所用病理組織來自于我院88 例經(jīng)病理證實為TNBC 的患者。 同期確診為乳腺癌的患者共 574 例， TNBC 患者占 15.3%。 88 例 TNBC患者的平均患病年齡為49.58 ± 12.76 歲； 腫瘤大小以 1 ～4 cm 居多， 平均 2.48 ± 0.98 cm； 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面， 多數(shù)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移小于5 個，平均2.55 ± 5.40 個， 淋巴結(jié)陽性患者差異程度大； 組織學(xué)分級上均為Ⅱ級或Ⅲ級， 以Ⅲ級為多見； Ki-67 表達水平集中分布在40%～90%， 平均56.61% ± 22.41%； 身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)平均值為 23.62 ± 2.70 kg·m-2， 接近中國人群肥胖閾值 24 kg·m-2[9]。

2.2 PD-L1 表達與TNBC 臨床特征的相關(guān)性

88 例 TNBC 患者中， 共檢出 23 例 PD-L1 陽性， 陽性率為26.1%。 PD-L1 陽性患者多數(shù)年齡＞35 歲、 已絕經(jīng)、 腫瘤直徑≤2cm、 位于乳腺外上象限、 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 患者的年齡、 絕經(jīng)狀態(tài)、 腫瘤大小、 腫瘤發(fā)生部位和 BMI 與PD-L1表達未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性(P ＝0.085、0.150、0.102、0.569、0.840) ； 但 PD-L1 的表達情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著相關(guān)性(P ＝0.014)。 淋巴結(jié)N0、“≥N2” 與 N1相比， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義； N1組內(nèi)對比， PD-L1 陽性及陰性， 也存在著統(tǒng)計學(xué)上的差異； 根據(jù)兩者的標準殘差可以進一步得出， PD-L1 表達和淋巴結(jié)N1水平顯著相關(guān)， N0、“≥N2” 組內(nèi)未顯現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上的差異。 見表1。

表1 PD-L1 在TNBC 中的表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PD-L1 表達與TNBC 病理特征的相關(guān)性

88 例TNBC 患者的病理組織均呈現(xiàn)出高組織學(xué)分級及高Ki-67 表達， 組織學(xué)Ⅲ級和Ki-67＞30%的占比分別為64.8%、 78.4%。 在與PD-L1表達的相關(guān)性方面， 組織學(xué)Ⅱ級與Ⅲ級存在統(tǒng)計學(xué)上的差異(P ＝0.000)； PD-L1 表達與 CK5/6不同表達情況也有著顯著的統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性(P ＝ 0.000)； 而 EGFR、 脈管癌栓和 Ki-67 與PD-L1 表達無統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性(P ＝0.230、0.390、0.564)。 見表 1。

2.4 PD-L1 表達在TNBC 病理組織中的表達分析

TNBC 病理組織中PD-L1 表達情況的免疫組化分析結(jié)果見圖1。 圖1(a)、 (b)選取扁桃體組織作為陽性質(zhì)控對照組， 可見扁桃體隱窩上皮細胞膜染色強陽性， 生發(fā)中心的巨噬細胞染色為中等到弱陽性， 內(nèi)皮細胞、 纖維細胞和表面上皮細胞的細胞膜則沒有染色； 圖1(c)、 (d)是利用陰性對照抗體試劑進行染色， 未見乳腺癌上皮細胞膜染色；圖1(e)、 (f)在顯微鏡視野下可見細胞膜染色為黃褐色， 呈強陽性， 染色均勻、 數(shù)量多、 效果佳，而周圍纖維組織細胞未見染色； 圖1(g)、 (h)可見腫瘤細胞質(zhì)染色為棕色， 表現(xiàn)為染色假陽性。

圖1 TNBC 病理組織中PD-L1 表達情況的免疫組化分析

3 分析

TNBC 是乳腺癌中預(yù)后較差的一種亞型， 目前治療手段有限， 因而亟需探索新型、 更加有效的治療TNBC 方案[10]。 免疫治療近年來在癌癥治療方面取得令人矚目的成果， 在TNBC 治療方面也展現(xiàn)出極大的潛力[11]。 研究發(fā)現(xiàn)， TNBC 腫瘤細胞中PD-L1 表達較高， 而PD-L1 是免疫治療中重要的靶點[12]。 針對TNBC 的免疫治療藥物， 目前美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市的有兩種PD-1 抑制性抗體藥物: Pembrolizumab 和Atezolizumab。 國內(nèi)外多個中心正在開展關(guān)于這兩種藥物的大型臨床研究， 截至目前，多數(shù)研究中心的數(shù)據(jù)顯示PD-L1 免疫治療可以進一步改善TNBC 患者的遠期生存， 展現(xiàn)出令人滿意的結(jié)果[13]。 但是鮮有針對 PD-L1 與 TNBC的臨床病理相關(guān)性的研究報道。 本實驗就我院88 例TNBC 患者的臨床病理特征與PD-L1 表達情況進行研究， 探討PD-L1 表達與TNBC 臨床病理特征的相關(guān)性。

本實驗， PD-L1 在 TNBC 中的陽性率為26.1%， 與相關(guān)研究相符。 年齡小、 腫瘤大通常提示TNBC 患者有不良預(yù)后[14]。 超重(甚至肥胖)與多種調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的途徑相關(guān)， 能增加TNBC 發(fā)病率和死亡率， 被認為是影響預(yù)后的重要危險因素[15]。 但本實驗中患者的發(fā)病年齡相較于乳腺癌的總體水平(45 ～54 歲)， 未表現(xiàn)出年輕化的趨勢。 而與PD-L1 表達的關(guān)系方面， TNBC 發(fā)病年齡、 腫瘤大小和BMI 均未表現(xiàn)出相關(guān)性。 國內(nèi)一項涉及14 367 名乳腺癌患者的meta 分析中， 也未發(fā)現(xiàn)PD-L1 表達與乳腺癌患者年齡具有相關(guān)性[16]； ZHU 等的研究同樣指出年齡與TNBC 中PD-L1 的表達無明顯相關(guān)[17]。GUO 等的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤大小與PD-L1 表達無明顯相關(guān)[18]。 但 BMI 與 PD-L1 表達的關(guān)系， 目前研究甚少， 因而兩者的關(guān)系需待更多的報道去驗證。 從以上的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)， 雖然年齡小、 腫瘤大、 高BMI 與TNBC 的不良預(yù)后相關(guān)， 但與PDL1 表達并未顯現(xiàn)出相關(guān)性， 說明TNBC 的不良預(yù)后因素， 并非與影響PD-L1 表達的因素呈正性相關(guān)。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往預(yù)示著TNBC 患者已處于疾病中晚期， 遠期生存率低， 疾病復(fù)發(fā)率高。 研究發(fā)現(xiàn)， N0、 “≥N2” 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移， 較 N1更易表達 PD-L1， 但 N0與 “≥N2” 兩者并未表現(xiàn)出差異， 表明雖然淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PD-L1 陽性相關(guān)，但轉(zhuǎn)移數(shù)量并非與PD-L1 陽性呈正比， 進一步說明PD-L1 并不是和TNBC 的不良預(yù)后呈正相關(guān)。 在 N1組中， 只有少部分 PD-L1 陽性， 也提示PD-L1 陽性與不良預(yù)后并無一致性。

病理檢查是診斷乳腺癌的金標準， 不僅能夠明確腫瘤的性質(zhì)， 其中的生物分子信號還能預(yù)測患者的預(yù)后， 為癌癥患者的診斷及治療提供巨大幫助。 組織學(xué)分級程度越高， 一定程度上說明TNBC 惡性程度越高， 高組織學(xué)分級也是乳腺癌化療的重要參考指標之一。 實驗中， 88 例TNBC患者共有57 例組織學(xué)分級為Ⅲ級， 占64.8%，說明TNBC 患者的不良預(yù)后風(fēng)險相對較高。 組織學(xué)Ⅲ級相對于Ⅱ級患者更易表達PD-L1， 說明在組織學(xué)上， PD-L1 陽性能對患者的預(yù)后提供一定的參考。 C-kit 是一種跨膜酪激酶受體， 存在于造血干細胞和其他細胞表面， 具有誘導(dǎo)細胞凋亡和增加癌細胞侵襲性的能力[9]。 本實驗中，CK5/6 陽性患者與陰性患者的PD-L1 表達存在著統(tǒng)計學(xué)上的差異， CK5/6 陽性患者 PD-L1 陽性率更高， 在某種程度上PD-L1 可能與腫瘤的侵襲能力有關(guān)。 脈管癌栓、 Ki-67 水平雖然也與TNBC 患者的不良預(yù)后相關(guān)， 但實驗中未表現(xiàn)出與PD-L1 的表達存在著相關(guān)性， 而國內(nèi)外目前的研究也較少涉及這個層面， 因而仍需更多的數(shù)據(jù)進行探討。

綜上所述， PD-L1 表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、 高組織學(xué)分級、 CK5/6 表達有著一定的相關(guān)性， 但在預(yù)測TNBC 預(yù)后方面仍存在缺陷。 目前有相關(guān)報道指出， 腫瘤浸潤淋巴細胞與PD-L1 聯(lián)合研究時， 能更好地預(yù)測患者的預(yù)后[19]， 待今后進一步探究。