阿熱依·巴哈提，王均琪，祝娜，白穎璐，曹靖宜，張明爍，張嚴(yán)，李志勇，3，黃秀蘭

(1.中央民族大學(xué)藥學(xué)院，北京 100081；2.中央民族大學(xué)生命環(huán)境與科學(xué)學(xué)院，北京 100081；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

隨著新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease，COVID-19)在全球的蔓延，及其對(duì)全球健康的潛在影響，尋找有效的治療方案成為當(dāng)務(wù)之急。由于開(kāi)發(fā)一-種新的抗病毒藥物需要數(shù)年才能投入臨床應(yīng)用，許多研究人員正在探索已知抗病毒藥物對(duì)COVID-19的影響。因此，重新利用現(xiàn)有的抗病毒藥物是加快藥物審批進(jìn)程的一種實(shí)用方法。法匹拉韋(favipiravir，T-705)是一種廣譜抗病毒嘌呤核酸類(lèi)似物藥物，針對(duì)多種RNA病毒(流感病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒、黃病毒、沙粒病毒、布尼亞病毒和甲型病毒等)進(jìn)行開(kāi)發(fā)治療，通過(guò)抑制RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)發(fā)揮作用，并可能在抗嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(syndrome coronavirus type 2，SARS-CoV-2)的治療中作為一種主要藥物[1-2]。該藥在日本被批準(zhǔn)用于治療新發(fā)流感，且由于其強(qiáng)大的抗病毒作用在2020年被中國(guó)批準(zhǔn)用于治療COVID-19[3]。雖然目前有文獻(xiàn)研究表明，法匹拉韋通過(guò)抑制SARS-CoV-2-RdRp、SARS-CoV-2-3CLpro或者其他靶標(biāo)來(lái)治療COVID-19，但其作用機(jī)制仍不明確。

分子對(duì)接最早于20世紀(jì)80年代中期至20世紀(jì)90年代初被開(kāi)發(fā)用于預(yù)測(cè)已知活性化合物的結(jié)合模式，并虛擬篩選大型數(shù)字化合物庫(kù)，以降低成本并加快藥物發(fā)現(xiàn)。分子對(duì)接在當(dāng)前藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用較多，如用于配體-靶標(biāo)結(jié)合合理化、虛擬篩選、靶標(biāo)捕獲和分析、非靶標(biāo)預(yù)測(cè)、多藥藥理學(xué)、藥物重新定位等[4]。此外，分子對(duì)接是計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(computer aided drug design，CADD)的關(guān)鍵組成部分。CADD使用計(jì)算機(jī)功能、三維圖形、數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)理解和預(yù)測(cè)具有潛在靶標(biāo)的小分子抑制劑的結(jié)合模式和能量。根據(jù)其受體特征，通過(guò)受體與藥物分子之間的相互作用方式來(lái)預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親和力的一種方法，其結(jié)合分?jǐn)?shù)越低，說(shuō)明親和力越高[5-6]。筆者在本文通過(guò)結(jié)合法匹拉韋和COVID-19靶點(diǎn)分子對(duì)接分?jǐn)?shù)，系統(tǒng)回顧法匹拉韋通過(guò)與COVID-19靶點(diǎn)相互作用對(duì)抗COVID-19的作用機(jī)制，以期為治療COVID-19的臨床實(shí)踐提供有力證據(jù)。

1 SARS-CoV-2形態(tài)結(jié)構(gòu)及關(guān)鍵酶

針對(duì)SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行的各種研究有助于確定藥物治療的主要靶標(biāo)。SARS-CoV-2是一種正向RNA病毒，基因組大小為29.9 kb，除了5'UTR之外，基因組的三分之二由部分重疊的11個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)組成(圖1)。ORF(Orf1a和Orf1b)編碼兩個(gè)多聚蛋白pp1a和pp1ab。pp1a和pp1ab在3個(gè)不同的N端位點(diǎn)被PLpro裂解，在11個(gè)不同位點(diǎn)被PLpro裂解，釋放出非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein，NSPs)。其中幾個(gè)NSPs是自然界中的酶，有SARS-CoV-2關(guān)鍵酶，即3CLpro(NSP5)、RdRp(NSP12)和PLpro(NSP3)[8](圖2)。其余三分之一基因組3′端編碼輔助蛋白[尖峰(S)、包膜(M)、包膜(E)和結(jié)構(gòu)蛋白[核衣殼蛋白(N))]。SARS-CoV-2病毒是一個(gè)巨大的多形性球形顆粒，其主要由S、E、M、N蛋白和基因組(+SS RNA)組成。N蛋白呈螺旋狀彎曲與+SS RNA結(jié)合，而S蛋白、E蛋白和M蛋白與病毒包膜結(jié)合，S蛋白在病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)發(fā)揮識(shí)別作用[9]。

圖1 ORF編碼的NSPs(NSP1-NSP16)[7]

圖2 SARS-CoV-2形態(tài)及關(guān)鍵酶機(jī)制圖[7]

1.1SARS-CoV-2-RdRp SARS-CoV-2復(fù)制復(fù)合物主要由病毒NSPs的多亞基轉(zhuǎn)錄復(fù)合物組成，核心成分主要是RdRp(NSP12)，而NSP12的功能發(fā)揮也需要NSP7和NSP8兩個(gè)輔因子參與，它們的加入將促進(jìn)NSP12與RNA模板結(jié)合。在SARS-CoV，NSP12充當(dāng)與NSP7和NSP8的三重聚合酶復(fù)合物。NSP7和NSP8激活NSP12的RNA合成活性并賦予其合成能力。該三重聚合酶復(fù)合物進(jìn)一步與NSP14結(jié)合，賦予校對(duì)核酸外切酶功能。值得注意的是，SARS-CoV和SARS-CoV-2的RdRp具有96%序列相似性[10]。故鑒于RdRp在病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中的關(guān)鍵作用，它成為抗病毒藥物如法匹拉韋治療COVID-19的作用靶標(biāo)[11-12]。

1.2SARS-CoV-2-3CLpro此外，在SARS-CoV-2中已經(jīng)鑒定出兩種主要蛋白酶，即3CLpro(NSP5)和PLpro(NSP3)。3CLpro也稱(chēng)為主要蛋白酶(Mpro)，是幫助在SARS-CoV-2中切割復(fù)制酶多蛋白1ab的兩種關(guān)鍵蛋白水解酶之一，在病毒成熟步驟中起著至關(guān)重要的作用。其長(zhǎng)306個(gè)氨基酸，從病毒RNA基因組的Orf1ab翻譯而來(lái)。已知3CLpro可在11個(gè)特定位點(diǎn)切割復(fù)制酶多蛋白，識(shí)別位點(diǎn)為L(zhǎng)eu-Gln↓(Ser，Ala，Gly)。3CLpro會(huì)自動(dòng)從多聚蛋白裂解，首先產(chǎn)生成熟蛋白。然后3CLpro裂解pp1a和pp1ab下游NSP，導(dǎo)致釋放12個(gè)NSPs(NSP4，NSP6-16)，它們對(duì)病毒復(fù)制和病毒組裝至關(guān)重要。3CLpro促進(jìn)病毒生物合成，故推測(cè)抑制3CLpro會(huì)阻斷病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增[13-14]。因此3CLpro是COVID-19重要藥物靶標(biāo)。

1.3SARS-CoV-2-PLpro木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLpro)是另一種蛋白水解酶，有助于加工復(fù)制酶多蛋白。已知PLpro會(huì)在3個(gè)位點(diǎn)切割復(fù)制酶多蛋白，釋放出NSP1、NSP2和NSP3，這對(duì)于病毒復(fù)制必不可少。PLpro裂解NSP1、NSP2和NSP3，3CLpro處理剩余的13種NSPs。NSPs產(chǎn)生后，在宿主膜上組裝病毒復(fù)制酶復(fù)合體，啟動(dòng)病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。除了其蛋白水解功能外，據(jù)報(bào)道PLpro還具有去泛素化性質(zhì)[10，15]。它通過(guò)關(guān)閉關(guān)鍵途徑在抵抗宿主對(duì)病毒感染的免疫反應(yīng)強(qiáng)度中也起著中心作用。

2 法匹拉韋

2.1法匹拉韋的應(yīng)用及發(fā)展 法匹拉韋又名T-705，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行核糖基化和磷酸化形成活性代謝物，即法匹拉韋-呋喃核糖基-5-三磷酸(法匹拉韋-RTP)，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，并可能作為核苷酸類(lèi)似物起作用，選擇性抑制病毒依賴(lài)性RNA聚合酶，或在摻入病毒RNA時(shí)引起致死性誘變。而對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性[17]。除了流感病毒以外，法匹拉韋在體外和體內(nèi)對(duì)其他分段的RNA病毒也顯示出有效的抗病毒活性。因此，法匹拉韋可能對(duì)SARS-CoV-2具有潛在抗病毒作用[16，18]。

圖3 法匹拉韋的化學(xué)結(jié)構(gòu)[16]

法匹拉韋于2002年被開(kāi)發(fā)作為流感病毒復(fù)制的抑制劑，并于2014年被日本批準(zhǔn)作為新出現(xiàn)或再次出現(xiàn)的流感病毒的治療方案[19]。然而，僅當(dāng)政府判定法匹拉韋將用作對(duì)抗新型或重新出現(xiàn)的流感病毒的對(duì)策時(shí)，才考慮將其用于患者給藥。此外，法匹拉韋在2014年被成功用于埃博拉病毒感染患者的暴露后預(yù)防和治療。中國(guó)臺(tái)灣疾病預(yù)防控制中心決定在2015年為感染包括禽流感和豬流感在內(nèi)的新流感病毒株的人儲(chǔ)備法匹拉韋。日本政府決定在2017年儲(chǔ)存法匹拉韋，作為200萬(wàn)人的新型流感對(duì)策[16]。2020年發(fā)現(xiàn)，法匹拉韋作為一種前藥，可以有效抑制Vero E6細(xì)胞(ATCC-1586)中的SARS-CoV-2感染[20]。2020年3月，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局宣布立即批準(zhǔn)法匹拉韋片(規(guī)格：0.2 g)用于成人COVID-19患者的臨床試驗(yàn)，因?yàn)閾?jù)觀察，法匹拉韋總體療效和安全性良好，不良反應(yīng)最小[16，21]。

2.2法匹拉韋抑制SARS-CoV-2的作用機(jī)制 SARS-CoV-2以S蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)等受體結(jié)合開(kāi)始其生命周期(圖4)。結(jié)合后S蛋白構(gòu)象變化支持病毒膜與細(xì)胞膜融合(受體介導(dǎo)的內(nèi)吞)進(jìn)入宿主細(xì)胞。它觸發(fā)了SARS-CoV-2向細(xì)胞質(zhì)釋放RNA。病毒基因組RNA在細(xì)胞質(zhì)顯露出來(lái)，正單鏈基因組被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生病毒蛋白酶PLpro和3CLpro，它們將RNA的1a和1b之間的框移(-1)導(dǎo)致產(chǎn)生的兩個(gè)多聚蛋白(pp1a和pp1ab)切割成16種成熟的NSPs，包括兩種復(fù)制酶多蛋白[RdRp和解旋酶(Hel)]。成熟的NSPs和RdRp及Hel蛋白聚集成復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，用于病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。RTCs合成負(fù)鏈導(dǎo)向RNA (gRNA)和一組用于病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的亞基因組RNA。新產(chǎn)生的亞基因組RNA被翻譯成病毒結(jié)構(gòu)蛋白，如S、M和E蛋白。這些蛋白被插入粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，然后被轉(zhuǎn)運(yùn)到ER-高爾基中間室(ener)，與N蛋白包被的RNA組裝形成病毒顆粒。然后病毒粒通過(guò)胞吐作用從細(xì)胞釋放出來(lái)[22-24]。法匹拉韋可以選擇性抑制SARS-CoV-2的RdRp基因并阻斷基因組RNA復(fù)制。SARS-CoV-2RdRps之間顯著的高度結(jié)構(gòu)保守性強(qiáng)烈表明，當(dāng)需要快速反應(yīng)時(shí)，通過(guò)對(duì)關(guān)鍵病毒酶的可用抑制劑進(jìn)行改進(jìn)，從而使得它們作為治療藥物。此外，法匹拉韋還可以通過(guò)結(jié)合如SARS-CoV-3CLpro和SARS-CoV-PLpro等COVID-19靶標(biāo)來(lái)治療COVID-19，筆者在本文綜述法匹拉韋通過(guò)不同靶點(diǎn)抑制COVID-19分子對(duì)接的文章(表1)。

圖4 法匹拉韋抑制SARS-CoV-2的作用機(jī)制[16]

表1 法匹拉韋與SARS-CoV-2各靶點(diǎn)的分子對(duì)接

續(xù)表1 法匹拉韋與SARS-CoV-2各靶點(diǎn)的分子對(duì)接

2.2.1法匹拉韋通過(guò)抑制SARS-CoV-2-RdRp抗COVID-19 法匹拉韋(原藥)是嘌呤堿基類(lèi)似物，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)磷酸核糖化作用轉(zhuǎn)化為活性代謝物法匹拉韋-RTP(圖5)。后者是RdRp選擇性和有效抑制劑。法匹拉韋通過(guò)容易出錯(cuò)的病毒RdRp結(jié)合到新生病毒RNA，導(dǎo)致對(duì)SARS-CoV-2復(fù)制和轉(zhuǎn)錄抑制[35]。存在于各種類(lèi)型核糖核酸病毒中的RdRp使法匹拉韋具有更廣泛的抗病毒活性。在RNA病毒摻入后，法匹拉韋-RTP作為誘變劑，能夠逃離SARS-CoV-2修復(fù)機(jī)制。法匹拉韋-RTP處理減少了SARS-CoV-2基因組中已經(jīng)具有低胞嘧啶(約17.6%)的CoV核苷酸含量?？傊S著突變頻率增加，法匹拉韋-RTP通過(guò)病毒所致細(xì)胞病變效應(yīng)，減少了病毒RNA和感染性顆粒數(shù)量，對(duì)SARS-CoV-2產(chǎn)生了積極作用[36]。此外，法匹拉韋與RdRp有較強(qiáng)結(jié)合親和力，如表1所示，對(duì)接得到結(jié)合能為-5.0～-4.8 kcal·mol-1[25-26]。然而，HAGAR等[27]認(rèn)為，PDB結(jié)構(gòu)不適合分子對(duì)接研究，因此通過(guò)從PDB結(jié)構(gòu)中去除水分子和配體修飾了法匹拉韋結(jié)構(gòu)，制備了法匹拉韋類(lèi)似物(PubChem CID：89869520)，法匹拉韋結(jié)構(gòu)修飾類(lèi)似物的對(duì)接結(jié)果顯示出與RdRp靶標(biāo)的良好相互作用。法匹拉韋類(lèi)似物與SARS-CoV-2的RdRp(6M71-A)結(jié)合親和力為-21.3 kJ·mol-1，該值較法匹拉韋結(jié)合親和力更小。因此，該藥物結(jié)構(gòu)修飾物更適于用作針對(duì)選定靶標(biāo)的抑制劑。GE等[21]進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，法匹拉韋-22.3 kJ·mol-1，法匹拉韋三磷酸-37.4 kJ·mol-1，根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，法匹拉韋三磷酸鹽活性代謝物形式較法匹拉韋前藥和其他中間代謝物表現(xiàn)出更高的相互作用。

圖5 法匹拉韋的活化過(guò)程

2.2.2法匹拉韋通過(guò)抑制SARS-CoV-2-3CLpro抗COVID-19 SARS-CoV-2-3CL是最有吸引力的抗病毒藥物靶點(diǎn)之一，因?yàn)椴《境墒鞄缀跬耆蕾?lài)于3CLpro活動(dòng)。例如，12種Nsps的成熟，包括RdRp和Nsp13等關(guān)鍵蛋白，需要通過(guò)3CLpro進(jìn)行解理。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，抑制3CLpro可以防止病毒復(fù)制[34，37]。因此，3CLpro被認(rèn)為是SARS-CoV-2的致命弱點(diǎn)，可作為有效的抗病毒藥物靶點(diǎn)。此外，3CLpro抑制劑可能在不同器官不同細(xì)胞類(lèi)型中滅活病毒，而獨(dú)立于病毒進(jìn)入所需的各種受體/宿主蛋白酶(在細(xì)胞膜上)。

法匹拉韋可以作為RdRp和3CLpro的潛在抑制劑，且調(diào)研結(jié)果顯示，法匹拉韋與3CLpro的結(jié)合能力較法匹拉韋與RdRp結(jié)合更好，其原因可能是使用的分子對(duì)接軟件不一致或者使用的配體不一致。研究人員對(duì)法匹拉韋和SARS-CoV-2-3CLpro進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表1。法匹拉韋和3CLpro的結(jié)合能范圍為(-38.6～-17.6)kJ·mol-1[26，28-32]。此外，KUMAR等[29]采用SARS-CoV-2-3CLpro作為靶標(biāo)，得到的結(jié)合能為-153.91 kJ·mol-1。其中HAGAR等[27]進(jìn)行了3CLpro(PDB ID：6LU7)和法匹拉韋對(duì)接模擬研究，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合能僅為-17.0 kJ·mol-1，其原因有可能為法匹拉韋不位于受體的催化二分體中，故可知法匹拉韋與3CLpro無(wú)顯著結(jié)合。對(duì)此，SHIN等[33]研究了7種他汀類(lèi)藥物、標(biāo)準(zhǔn)配體和蛋白酶抑制劑與COVID-193CLpro的親和力。當(dāng)他汀類(lèi)藥物與已知抗3CLpro抑制劑一起停靠時(shí)，具有很強(qiáng)藥物樣性質(zhì)。6LU7對(duì)接位點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)配體法匹拉韋相互作用的結(jié)合能為-24.2 kJ·mol-1。因此，法匹拉韋可以聯(lián)合他汀類(lèi)藥物共同充當(dāng)SARS-CoV-2-3CLpro和SARS-CoV-2的潛在抑制劑。

2.2.3法匹拉韋通過(guò)抑制SARS-CoV-2-PLpro抗COVID-19 PLpro是一種基本的冠狀病毒酶，為處理病毒多蛋白必需，以產(chǎn)生功能性復(fù)制酶復(fù)合物并促成病毒傳播。PLpro還涉及切割宿主蛋白質(zhì)的翻譯后修飾蛋白，作為對(duì)抗宿主抗病毒免疫反應(yīng)的規(guī)避機(jī)制。SARS-CoV-2-PLpro優(yōu)先切割泛素樣干擾素刺激的基因15蛋白(ISG15)，而SARS-CoV-PLpro主要針對(duì)泛素鏈。SARS-CoV-2-PLpro易于從干擾素反應(yīng)因子3中解出基因15蛋白，并減弱I型干擾素反應(yīng)，故其抑制劑可有效去除ISG15和泛素修飾，此外，相關(guān)抑制劑GRL-0617可以抑制SARS-CoV-2-PLpro會(huì)損害病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞致病效應(yīng)，保持抗病毒干擾素通路，并減少病毒在受感染細(xì)胞中的復(fù)制，從而減輕炎癥和抗病毒信號(hào)傳遞[14，37-39]。研究人員對(duì)法匹拉韋與PLpro進(jìn)行分子對(duì)接，如表1所示，二者結(jié)合能估計(jì)為-19.6～-23.8 kJ·mol-1[27，30]。這些結(jié)果凸顯了一種潛在的雙重治療策略，其中靶向SARS-CoV-2-PLpro可以抑制SARS-CoV-2感染并促進(jìn)抗病毒免疫。

3 結(jié)束語(yǔ)

SARS-CoV-2的3種病毒NSPs，即蛋白酶3CLpro、PLpro和RdRp在SARS-CoV-2復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此法匹拉韋可結(jié)合上述病毒靶標(biāo)從而抑制SARS-CoV-2感染。根據(jù)其上述相關(guān)分子對(duì)接分?jǐn)?shù)可知，法匹拉韋和上述SARS-CoV-2靶標(biāo)結(jié)合的親和力較高，法匹拉韋可以通過(guò)以上靶標(biāo)抑制COVID-19。此外，法匹拉韋作為一個(gè)原藥，和靶標(biāo)的分子結(jié)合能力較弱，故可以對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或者和其他藥物聯(lián)用，以實(shí)現(xiàn)雙重治療策略，抑制SARS-CoV-2感染的同時(shí)促進(jìn)抗病毒免疫。

法匹拉韋的主要優(yōu)勢(shì)為口服給藥，并且可以用于有癥狀但無(wú)需住院的患者。由于大多數(shù)(85%)COVID-19患者患有輕中度疾病，可以在家接受治療，因此該藥可能會(huì)用于大量患者。其在縮短病毒脫落持續(xù)時(shí)間方面的作用也可能產(chǎn)生流行病學(xué)影響，因?yàn)槠淇蓽p少病毒在家庭和社區(qū)中的傳播[40]。

法匹拉韋具有較好的臨床結(jié)果。DOI等[41]在中國(guó)進(jìn)行的前瞻性開(kāi)放標(biāo)簽多中心試驗(yàn)，以比較臨床確診的SARS-CoV-2管理中的兩種治療手段，對(duì)于中度COVID-19患者和高血壓和(或)糖尿病的COVID-19患者，法匹拉韋組退熱和止咳潛伏期明顯短于阿比多爾組(均P<0.01)。MISHIMA等[42]進(jìn)行的一項(xiàng)開(kāi)放標(biāo)簽對(duì)照研究，以評(píng)估法匹拉韋對(duì)COVID-19的臨床療效。法匹拉韋與更快的病毒清除率和更高的胸部成像改善率有關(guān)，且與洛匹那韋/利托那韋相比，法匹拉韋在疾病進(jìn)展和病毒清除方面對(duì)SARS-CoV-2的治療效果明顯更好。此外，法匹拉韋與其他藥物聯(lián)合治療中，法匹拉韋起到了積極影響，甲磺酸納法莫司他聯(lián)合法匹拉韋治療可能允許阻止病毒的進(jìn)入和復(fù)制，并抑制致病宿主反應(yīng)，即高凝血病[43]。

目前，法匹拉韋可能是治療COVID-19相對(duì)有效的藥物，然而，上述研究數(shù)據(jù)表明法匹拉韋的療效需要等待更多臨床有效證據(jù)來(lái)確認(rèn)其對(duì)SARS-CoV-2治療的價(jià)值。此外，應(yīng)注意該藥的不良反應(yīng)。口服法匹拉韋后值得注意的不良反應(yīng)包括高尿酸血癥、致畸、可能性肝損傷和發(fā)熱。因此，如果女性確認(rèn)或懷疑懷孕，應(yīng)避免服用法匹拉韋[44]。

總之，法匹拉韋可能成為治療輕度至中度癥狀SARS-CoV-2感染的一種有效藥物，但需要更多臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。