胡一凡 綜述 孫曉東 審校

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院眼科 上海市眼底病重點實驗室 上海眼視覺與光醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心 200080

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是老年人群中重要的致盲眼病之一[1]，主要分為干性AMD和濕性AMD。AMD的發(fā)病過程中伴隨多種病理改變，其中視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞功能異常和變性是AMD發(fā)病早期的關(guān)鍵病理改變之一；光感受器及多種視網(wǎng)膜細胞的死亡是視力下降的直接原因；代謝產(chǎn)物及其他途徑來源的物質(zhì)異常沉積于RPE與Bruch膜之間，形成玻璃膜疣(drusen)；RPE與活化的小膠質(zhì)細胞參與調(diào)控的炎癥反應(yīng)既是AMD的病因，也是AMD進展加速的誘因[2]。目前濕性AMD可采用抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)玻璃體腔注射治療，但干性AMD發(fā)病機制復(fù)雜，其仍缺乏有效治愈手段[3]。

近年研究提示嘌呤能信號通路在干性AMD的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[4]。正常情況下，嘌呤能信號通路參與視網(wǎng)膜多種生理過程[5]，其中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)幫助傳遞光學(xué)信號，同時維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)；腺苷通過調(diào)控小膠質(zhì)細胞的活性，影響視網(wǎng)膜免疫炎癥反應(yīng)；ATP和腺苷的表達平衡，為光感受器細胞發(fā)揮正常生理功能提供基礎(chǔ)；RPE細胞產(chǎn)生的ATP還能促進視網(wǎng)膜神經(jīng)祖細胞增生。隨年齡增加，視網(wǎng)膜環(huán)境發(fā)生改變，嘌呤能信號通路異常激活導(dǎo)致視網(wǎng)膜多種細胞功能障礙，產(chǎn)生壞死、凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激等損傷反應(yīng)。近年來，嘌呤能信號通路在AMD的多重身份及功能引起了研究者的廣泛關(guān)注。深入了解嘌呤能信號通路在干性AMD中的作用機制，可以從全新角度解釋并補充AMD的發(fā)病機制，為更好地治療干性AMD提供理論依據(jù)。

1 嘌呤能信號通路

1.1 嘌呤能信號通路組成

嘌呤能信號通路由配體腺苷和ATP及其相應(yīng)受體組成。生理狀態(tài)下視網(wǎng)膜中嘌呤能分子在無光照條件下釋放，隨神經(jīng)活性的增強而增多[6]。

腺苷的產(chǎn)生途徑有2種，包括胞內(nèi)合成后通過不同細胞(如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)和Müller細胞)的平衡核苷轉(zhuǎn)運蛋白釋放，或在病理條件下通過ATP酶的去磷酸化作用直接在胞外形成。腺苷受體P1是G蛋白偶聯(lián)型受體，分為A1、A2A、A2B和A3這4種亞型；幾乎所有類型的視網(wǎng)膜細胞包括光感受器細胞、神經(jīng)元(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)，無長突細胞和雙極細胞)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、RPE細胞和周細胞都含有這4種亞型的腺苷受體，但不同種屬之間表達存在差異[7]。

ATP也存在多種來源，包括在神經(jīng)元中通過鈣離子(Ca2+)和/或泛連接蛋白途徑釋放，以及在非神經(jīng)細胞中，如RPE細胞、膠質(zhì)細胞，通過Ca2+依賴或非依賴機制釋放[8]。ATP受體主要分為離子型P2X受體和G蛋白偶聯(lián)代謝型P2Y受體，廣泛分布在視網(wǎng)膜各層細胞中[9]。

1.2 嘌呤能信號通路功能

嘌呤能信號通路在神經(jīng)-膠質(zhì)細胞間起神經(jīng)遞質(zhì)和膠質(zhì)遞質(zhì)的作用，參與視網(wǎng)膜中視覺信號和生物信號的傳遞以及生物過程的調(diào)節(jié)，包括光感受器細胞與RPE細胞間物質(zhì)交換，RPE細胞和大膠質(zhì)細胞(包括Müller細胞，星形膠質(zhì)細胞)穩(wěn)態(tài)，以及小膠質(zhì)細胞的活性等[10]。腺苷與ATP介導(dǎo)的嘌呤能信號通路在視網(wǎng)膜中扮演著不同的角色。

作為神經(jīng)元活動的主要抑制劑，腺苷主要起神經(jīng)保護作用，通過抑制神經(jīng)元活動和神經(jīng)遞質(zhì)釋放，保護神經(jīng)元免于過度興奮和谷氨酸毒性，已有研究證實腺苷在神經(jīng)退行性疾病中起保護作用[11]。這種保護作用主要由腺苷受體A2A亞型介導(dǎo)，通過多種抑制性機制發(fā)揮作用，包括激活突觸前受體抑制電壓依賴性Ca2+通道，避免神經(jīng)遞質(zhì)，如谷氨酸、乙酰膽堿和ATP的過多釋放；抑制N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)激活；抑制磷脂酶C(phospholipase C，PLC)活性；促進γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)能信號傳導(dǎo)，以及激活A(yù)TP敏感性鉀離子(K+)通道等[4]。當(dāng)視網(wǎng)膜缺血缺氧時，腺苷通過激活腺苷受體，介導(dǎo)周細胞松弛，引起視網(wǎng)膜血流增加，改善缺血缺氧視網(wǎng)膜的代謝情況，對視網(wǎng)膜缺血性損傷具有保護作用[12]。

ATP作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，負責(zé)介導(dǎo)快速神經(jīng)傳導(dǎo)，參與細胞的能量供應(yīng)和代謝，調(diào)控細胞之間的信號傳遞。視網(wǎng)膜中的ATP常作為信號傳遞和下游通路的中央調(diào)控者，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)。ATP的受體P2X有7個亞型，P2Y有8個亞型，分布在視網(wǎng)膜各層細胞，參與多個突觸水平的信號傳導(dǎo)[9]。不同亞型受體發(fā)揮的作用不同。位于大多數(shù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元上的P2X受體可以促進快速興奮性神經(jīng)傳遞，如細胞凋亡，細胞分化和增生以及胚胎發(fā)育等過程；而位于神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和RPE細胞上的P2Y受體主要起神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，如小鼠視網(wǎng)膜中的視覺信息處理，視桿和錐體途徑的受體后調(diào)節(jié)等[13]。當(dāng)視網(wǎng)膜處于長期應(yīng)激狀態(tài)時，大量釋放的內(nèi)源性ATP主要產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，可能導(dǎo)致多種細胞死亡。

2 嘌呤能信號通路在干性AMD中的作用

AMD的主要病理特征為RPE細胞的病理改變和光感受器細胞的損失。在85%～90%的干性AMD患者中，首先形成大面積融合性drusen，伴隨RPE細胞變性的功能障礙以及細胞死亡，失去營養(yǎng)支持的光感受器細胞開始凋亡，小膠質(zhì)細胞及Müller細胞活化后過度聚集，加重炎癥反應(yīng)[14]。大量視網(wǎng)膜細胞死亡，脈絡(luò)膜毛細血管萎縮，視網(wǎng)膜相應(yīng)區(qū)域形成地圖樣萎縮(geographic atrophy，GA)，最終導(dǎo)致視力下降[3]。越來越多研究提示，上述病理過程均涉及嘌呤能信號通路，由嘌呤能受體、配體充當(dāng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中介，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細胞發(fā)生生理和退行性改變。

2.1 調(diào)控視網(wǎng)膜細胞死亡

嘌呤能信號通路中的ATP調(diào)控主要參與AMD發(fā)病過程中視網(wǎng)膜細胞死亡，針對性減少ATP的釋放或選擇性抑制ATP受體的活性可能對干性AMD的病理過程起到保護作用。

AMD發(fā)病過程中P2X受體，特別是P2X7受體的激活，是誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細胞死亡的關(guān)鍵步驟。研究發(fā)現(xiàn)，激活RPE上ATP受體P2X7及更多P2X亞型受體，Ca2+信號傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致細胞凋亡。使用P2X7受體的不可逆抑制劑——氧化的ATP或拮抗劑亮藍G和KN-62，能夠阻斷或顯著抑制RPE細胞凋亡，提示過度激活嘌呤信號通路可能促進RPE細胞死亡，促進干性AMD中GA的發(fā)展[15]。P2X7受體被激活后還可誘導(dǎo)形成大的質(zhì)膜孔，這些質(zhì)膜孔通過激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體，誘發(fā)炎癥小體依賴性細胞死亡途徑，即細胞焦亡，一種新型的程序性細胞死亡[16]。除RPE細胞外，P2X7受體信號通路還能夠誘導(dǎo)光感受器及神經(jīng)元等多種細胞的死亡。當(dāng)發(fā)生細胞應(yīng)激及慢性炎癥時，大量細胞外ATP通過P2X7受體誘導(dǎo)光感受器細胞凋亡。P2X7受體拮抗劑亮藍G能夠通過拮抗P2X7受體阻止光感受器細胞凋亡，可用于保護光感受器細胞、神經(jīng)元和微血管內(nèi)皮細胞免于變性死亡。亮藍G目前已獲批應(yīng)用于眼科手術(shù)，用于眼內(nèi)特定組織的染色步驟，例如在玻璃體切除術(shù)中對內(nèi)界膜染色以便于剝除內(nèi)界膜，但迄今尚未有關(guān)于該藥物長期治療效用的研究報道[17]。由于AMD存在多種細胞死亡途徑，我們?nèi)孕璐_定體內(nèi)應(yīng)用P2X7受體抑制劑是否能保護視網(wǎng)膜細胞免于死亡，或者是否必須同時聯(lián)合多種細胞死亡途徑抑制劑才能獲得最佳神經(jīng)保護作用。

ATP受體的另一亞型P2Y受體信號通路在受損的視網(wǎng)膜中同時具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護性的雙重作用。大膠質(zhì)細胞和RPE細胞中的P2Y受體被激活后通過參與視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞中Ca2+水平升高，P2Y受體的過度激活導(dǎo)致細胞毒性的鈣超載，促進細胞死亡[18]。同時，P2Y1激活不僅能促進視網(wǎng)膜祖細胞增生[19]；在敲除P2Y1受體基因的小鼠中還會發(fā)生缺血性視網(wǎng)膜病變，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜全層細胞凋亡，其中光感受器的損傷更為明顯，表明P2Y1信號傳導(dǎo)對細胞存活的必要性[20]。P2Y受體對視網(wǎng)膜細胞的雙向調(diào)節(jié)作用值得進一步探索。

2.2 調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞活性和功能

小膠質(zhì)細胞作為視網(wǎng)膜免疫系統(tǒng)中的常駐巨噬細胞，其活化募集程度與AMD的發(fā)展和嚴重程度相關(guān)。AMD的病理標(biāo)志物drusen的成分，如補體蛋白、脂褐素、β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)等長期刺激小膠質(zhì)細胞會激活補體系統(tǒng)和炎癥小體通路，導(dǎo)致慢性炎癥和細胞變性[21]。因此，補體系統(tǒng)和炎癥小體通路是防御AMD中炎癥反應(yīng)與組織變性的關(guān)鍵內(nèi)在免疫，中心環(huán)節(jié)是小膠質(zhì)細胞。小膠質(zhì)細胞的活化過程由嘌呤能神經(jīng)信號和膠質(zhì)信號共同傳導(dǎo)調(diào)控。嘌呤能信號通路中腺苷和ATP均參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的活性。

腺苷主要通過激活腺苷A2A受體(A2AR)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞反應(yīng)性。在不同病理條件下，A2AR會產(chǎn)生促炎或抗炎的作用。糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠模型中，激活小膠質(zhì)細胞A2AR觸發(fā)的信號可以阻斷腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)釋放，并防止小膠質(zhì)細胞形態(tài)活化[22]。而在一些缺血小鼠模型中，阻斷A2AR可能減弱小膠質(zhì)細胞活化，并抑制缺氧和脂多糖誘導(dǎo)下小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α，對ARPE-19細胞中NLRP3炎癥小體和補體的激活作用也減弱，推測其具有抗炎作用[23]。許多抗炎因子通過抑制嘌呤能通路發(fā)揮抗炎功效，如大麻二酚能夠通過抑制腺苷攝取和A2AR激活，抑制視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的活化[24]。A2AR拮抗劑SCH58261不僅抑制小膠質(zhì)細胞活性，還能阻止下游補體的激活和促炎介質(zhì)的上調(diào)，提高凋亡光感受器細胞的清除率，促進祖細胞增生，從多種途徑保護視網(wǎng)膜[25]。繼續(xù)深入研究A2AR的作用，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞，RPE細胞和視網(wǎng)膜其他細胞之間的相互作用，有助于開啟未來多途徑治療AMD的可能。

ATP既能調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的活性，又能夠影響小膠質(zhì)細胞的功能。通過結(jié)合細胞上P2Y受體，ATP介導(dǎo)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞形態(tài)、運動和吞噬能力，甚至能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞增生[26]。同時，ATP結(jié)合P2X7受體能夠通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)/絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein，MAP)途徑活化小膠質(zhì)細胞，促進TNF-α和白介素(interleukin，IL)-1β的釋放，激活下游炎癥通路，加重炎癥反應(yīng)[27]。體外細胞實驗也證實，ATP刺激原代小膠質(zhì)細胞釋放IL-6、TNF-α和單核細胞趨化蛋白-1等促炎因子；當(dāng)敲除P2X7受體基因后，小膠質(zhì)細胞不再釋放促炎因子[28]。說明抑制P2X7受體可能是抑制炎癥及控制AMD的有效靶點。ATP還參與小膠質(zhì)細胞的其他功能調(diào)控。ATP長時間激活P2X7受體會形成大的P2X7孔，抑制小膠質(zhì)細胞增生并誘導(dǎo)細胞凋亡[29]。病理條件下小膠質(zhì)細胞大量釋放ATP，可能導(dǎo)致光感受器和神經(jīng)元的退化，并促進視網(wǎng)膜組織的局部損傷區(qū)域擴大。因此，選擇性抑制P2Y和P2X7受體，可以抑制小膠質(zhì)細胞的遷移、增生和活化能力，阻止變性區(qū)域擴散；而促進ATP表達，激活P2Y和P2X7受體可能通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞凋亡，進而抑制炎癥反應(yīng)。ATP及受體的雙向功能研究還有待深入。

此外，嘌呤能信號通路還可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的核苷酸代謝，對視網(wǎng)膜產(chǎn)生保護作用。小膠質(zhì)細胞的年齡相關(guān)性功能改變也可能參與視網(wǎng)膜細胞的死亡和炎癥機制。目前關(guān)于嘌呤能信號通路在干性AMD的發(fā)生和發(fā)展過程中作用的研究仍存在一定局限性，有待于更多的細胞實驗和動物模型進一步探討。

2.3 調(diào)節(jié)炎癥及病理標(biāo)志物生成等損傷反應(yīng)

AMD發(fā)病過程中還涉及許多其他病理改變，包括氧化應(yīng)激和炎癥、脂褐素和drusen的形成、視網(wǎng)膜水腫等。這些病理改變的發(fā)生與嘌呤能信號通路有關(guān)。若能在疾病發(fā)展初期選擇性抑制嘌呤能信號通路，可能會從多個角度阻止AMD進一步發(fā)展。

氧化應(yīng)激是脂褐素和drusen生成的重要過程，而NLRP3炎癥小體是氧化應(yīng)激和炎癥的關(guān)鍵參與者?；罨∧z質(zhì)細胞釋放的因子可以直接誘導(dǎo)ARPE-19細胞中NLRP3炎癥小體的激活。NLRP3炎癥小體又可以反向誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞釋放神經(jīng)毒性因子如TNF-α、IL-1β、氧和氮自由基，F(xiàn)as配體等參與補體系統(tǒng)以及炎癥小體通路的激活與募集，誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)，促進光感受器細胞、RPE細胞以及視網(wǎng)膜神經(jīng)元的變性[15]。同樣作為NLRP3的激活劑，P2X7受體在mRNA和蛋白質(zhì)水平上調(diào)節(jié)NLRP3的表達[30]。在P2X7受體被激活期間，會出現(xiàn)沿濃度梯度的K+外流和Ca2+內(nèi)流。K+外流可有效刺激半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-aspartic proteases-1，caspase-1)活化和IL-1β前體釋放，進而促進NLRP3炎癥小體的活化。單獨對RPE細胞進行缺氧處理或誘導(dǎo)視網(wǎng)膜缺氧時，RPE細胞和視網(wǎng)膜其他細胞均可釋放ATP，通過自分泌或旁分泌方式結(jié)合RPE的P2X7受體，啟動NLRP3炎癥小體轉(zhuǎn)錄使之活化并聚集到特定區(qū)域，加重炎癥反應(yīng)[31]；反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子編碼的Alu RNA通過激活P2X7受體刺激NLRP3炎癥小體、caspase-1和IL-18的表達，誘導(dǎo)干性AMD中RPE的變性[32]。P2受體其他亞型也參與了炎癥反應(yīng)：P2Y受體活化誘導(dǎo)RPE細胞中的Ca2+信號通路[33]；P2Y1受體參與炎癥小體的啟動和活化，通過激活caspase-1，促進IL-1β和IL-18成熟和釋放[34]；ATP還可以直接作用于P2Y2和P2Y6，誘導(dǎo)IL-8的合成分泌，或間接通過誘導(dǎo)RPE細胞表達TNF-α增加來誘導(dǎo)IL-8的分泌[35]。氧化的ATP能夠消除ATP誘導(dǎo)的免疫細胞釋放IL-1β，是對抗炎癥的有效方法[36]。廣泛用于治療艾滋病的核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑還可以抑制P2X7受體介導(dǎo)的RPE變性和脈絡(luò)膜新生血管形成，有望成為治療P2X7受體驅(qū)動疾病的藥物[32]。新近研究發(fā)現(xiàn)，dursen的主要成分之一Aβ寡聚體(AβO)能夠通過激活小鼠RPE的P2X7受體誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活，這是AβO誘導(dǎo)RPE變性的必要條件[37]。以上研究體現(xiàn)了嘌呤能信號通路與NLRP3炎癥小體激活的關(guān)系，揭示嘌呤能信號通路在AMD病理進程中一系列損傷反應(yīng)的作用。

AMD的病理標(biāo)志物drusen由多種成分組成。研究發(fā)現(xiàn)，細胞外ATP和腺苷的平衡改變能夠調(diào)節(jié)RPE細胞中溶酶體pH，從而改變?nèi)苊阁w活性，影響脂褐質(zhì)的產(chǎn)生[38]。P2X7受體被激活可導(dǎo)致RPE細胞中的溶酶體pH升高，細胞向自噬的轉(zhuǎn)換減少；向RPE細胞中加入光感受器細胞外節(jié)(photoreceptor outer segment，POS)堿化溶酶體，脂褐素表達增加；阻斷P2X7受體后，細胞中脂褐素形成減少，提示P2X7受體激活導(dǎo)致溶酶體堿化，溶酶體發(fā)生功能障礙，脂質(zhì)氧化水平增加，RPE吞噬功能減弱。同時，RPE細胞中P2X7受體的激活還導(dǎo)致被吞噬的POS脂質(zhì)氧化增加，吞噬體清除率降低，造成細胞內(nèi)脂褐素和細胞下含脂蛋白的drusen積聚。另外，通過敲除超氧化物歧化酶-1(superoxide dismutase-1，SOD-1)基因，小鼠表現(xiàn)出慢性氧化應(yīng)激及類似AMD的特征[39]。同時SOD-1基因敲除小鼠的RPE細胞釋放的內(nèi)源性ATP增多；而敲除P2X7受體基因后，SOD-1基因敲除小鼠的類AMD缺陷和單核/吞噬細胞聚集現(xiàn)象均減輕。結(jié)合以上文獻，推測P2X7受體過度激活可能是drusen的產(chǎn)生機制之一。除上述病理表現(xiàn)，視網(wǎng)膜水腫也是AMD重要的病理改變。長期大量細胞外液體潴留將影響神經(jīng)細胞的營養(yǎng)狀況、功能與存活。研究顯示，敲除P2X7受體基因小鼠的免疫細胞吞噬能力顯著低于野生型小鼠；在12月齡時，P2X7受體基因敲除小鼠出現(xiàn)Bruch膜增厚和視網(wǎng)膜色素上皮功能障礙；到18月齡時，P2X7受體基因敲除小鼠表現(xiàn)出與早期AMD一致的表型特征，包括Bruch膜增厚，RPE細胞缺失，視網(wǎng)膜功能缺陷和視網(wǎng)膜下炎癥等癥狀[40]。因此P2X7受體在調(diào)控細胞吞噬功能的作用不容忽視。還有研究者發(fā)現(xiàn)，使用藥物激活P2Y2受體可以刺激RPE細胞產(chǎn)生液體清除作用，促進RPE細胞吸收視網(wǎng)膜下液，從而幫助重建視網(wǎng)膜和RPE之間的正常解剖結(jié)構(gòu)?；罨腜2Y2受體可誘導(dǎo)RPE細胞中Ca2+途徑激活，導(dǎo)致跨膜離子傳遞速率升高，從而提高視網(wǎng)膜下液的清除率[41]。這些研究提示，嘌呤受體激活導(dǎo)致離子通道打開，是提高視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞和RPE細胞水腫消除能力的關(guān)鍵步驟，可以防止視網(wǎng)膜水腫的發(fā)生。

綜上所述，嘌呤能信號通路在干性AMD的病理過程中發(fā)揮著許多作用，參與RPE、光感受器等多種視網(wǎng)膜細胞的死亡誘導(dǎo)、小膠質(zhì)細胞的活化調(diào)節(jié)、病理沉積物的生成以及炎癥和氧化應(yīng)激等多個損傷機制的調(diào)控。然而目前對于嘌呤能信號通路的研究尚不完善，缺乏良好的動物模型以及多通路的共同調(diào)控研究。明確嘌呤能信號通路在干性AMD中的參與機制，能夠為研究和完善干性AMD治療靶點提供新思路，從而更好地保護視網(wǎng)膜細胞，對維持視功能具有重要的臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突