張露元 綜述 李筱榮 審校

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國(guó)家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300384

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是由糖尿病引起的微血管并發(fā)癥之一，可造成黃斑水腫、眼底出血、視網(wǎng)膜新生血管生成等眼底改變，晚期患者常出現(xiàn)牽拉性視網(wǎng)膜脫離等嚴(yán)重視網(wǎng)膜病變，甚至可致盲[1]。目前DR主要的治療方法包括降血糖藥物、激光光凝、玻璃體切割術(shù)及玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)藥物等，但手術(shù)治療僅能延緩疾病進(jìn)展，并不能從根本上治療DR，且玻璃體內(nèi)反復(fù)注射增加眼內(nèi)炎發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。因此，目前亟需進(jìn)一步探索DR的發(fā)病機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)。代謝組學(xué)分析可以提示細(xì)胞、組織或器官的生化狀態(tài)，協(xié)助闡釋新基因或功能未知基因的功能，并且可以揭示生物各代謝網(wǎng)絡(luò)間的關(guān)聯(lián)性，有助于更系統(tǒng)地了解疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，目前其已被廣泛應(yīng)用于糖耐量受損和糖尿病等代謝疾病的機(jī)制研究中。近年來，這項(xiàng)技術(shù)也逐漸應(yīng)用于DR的研究。本文就DR相關(guān)模型鼠眼組織以及DR患者玻璃體液、房水、血漿樣本代謝組學(xué)研究進(jìn)行綜述。

1 代謝組學(xué)

1.1 代謝組學(xué)的基本概念

代謝組是指生物或細(xì)胞在特定生理時(shí)期內(nèi)所有低相對(duì)分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物，而代謝組學(xué)與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路相一致，是對(duì)生物體內(nèi)所有低相對(duì)分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性、定量分析，進(jìn)而尋找與生理病理變化相關(guān)代謝物以及代謝途徑的研究方法，其研究對(duì)象是相對(duì)分子質(zhì)量1 500以內(nèi)的小分子物質(zhì)。與基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)是一個(gè)相對(duì)新的領(lǐng)域，可以揭示機(jī)體在正常和病理?xiàng)l件下對(duì)外界刺激做出反應(yīng)的代謝信息，因此代謝組學(xué)與臨床表型關(guān)系密切，其正逐漸成為醫(yī)學(xué)研究的重要工具之一。代謝物是基因轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物，可以提供機(jī)體在正常和病理?xiàng)l件下對(duì)外界刺激做出反應(yīng)的信息，因此代謝組學(xué)與臨床表型關(guān)系密切，具有極大的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用潛力[4]。

1.2 代謝組學(xué)技術(shù)

代謝組學(xué)發(fā)展依賴于代謝組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，目前國(guó)內(nèi)外主要的代謝組學(xué)研究平臺(tái)有核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrum，GC-MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS)和毛細(xì)管電泳-串聯(lián)質(zhì)譜(capillary electrophoresis-mass spectrum，CE-MS)，利用各分析技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行的代謝組學(xué)研究各有優(yōu)劣[5]。NMR技術(shù)是一種快速、高效的非靶向分析技術(shù)，樣本無需預(yù)處理，且數(shù)據(jù)庫(kù)也較為全面、成熟，但無法檢測(cè)低豐度的代謝物，靈敏度較低；GC-MS技術(shù)主要用于檢測(cè)具有揮發(fā)性的樣本，樣本需要衍生化處理，從而延長(zhǎng)了樣本的制備時(shí)間，但衍生化擴(kuò)展了代謝物檢測(cè)的覆蓋率，同時(shí)高色譜分辨率和靈敏度確保低豐度代謝物的分離檢測(cè)；LC-MS技術(shù)根據(jù)樣本的親水性進(jìn)行分離檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度較高，但樣本預(yù)處理可能導(dǎo)致其破壞，進(jìn)而導(dǎo)致樣本重現(xiàn)性差；CE-MS技術(shù)根據(jù)極化率和分子形狀對(duì)樣本進(jìn)行分離檢測(cè)，適合分析離子性代謝物，所需樣品量小，但穩(wěn)定性較差[6-7]。目前DR代謝組學(xué)主要以玻璃體液和血漿為研究對(duì)象，利用NMR、LC-MS或GC-MS等技術(shù)非靶向或靶向檢測(cè)異常代謝物和代謝途徑，挖掘可能的代謝生物標(biāo)志物，為研究DR的發(fā)生和發(fā)展提供了新的思路。

2 代謝組學(xué)在DR中的應(yīng)用

2.1 DR相關(guān)動(dòng)物模型眼組織的代謝組學(xué)研究

DR代謝組學(xué)研究采用的動(dòng)物模型主要有氧誘導(dǎo)性視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠模型、糖尿病小鼠模型和糖尿病大鼠模型。由于OIR小鼠模型具有與增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)患者類似的病理表現(xiàn)，如視網(wǎng)膜缺血、視網(wǎng)膜新生血管以及神經(jīng)退行性病變等，以這些動(dòng)物模型作為研究對(duì)象進(jìn)行代謝組學(xué)研究具有一定的參考價(jià)值。Paris等[8]收集OIR模型小鼠造模第12、14和17天全眼球組織勻漿作為樣本，采用高效液相色譜系統(tǒng)和MetaboAnalyst程序?qū)颖局惺д{(diào)代謝物進(jìn)行途徑富集分析，發(fā)現(xiàn)樣本中脯氨酸、精氨酸和賴氨酸水平從第14天開始升高；同時(shí)在PDR患者玻璃體液中也觀察到精氨酸等氨基酸水平升高，推測(cè)精氨酸代謝在OIR模型小鼠眼球組織和PDR患者玻璃體液中均發(fā)生失調(diào)，精氨酸代謝途徑異常與DR進(jìn)展相關(guān)。Atawia等[9]研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸酶基因敲除對(duì)高脂飲食導(dǎo)致的視網(wǎng)膜炎癥具有抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證精氨酸代謝途徑異?？赡芘cDR進(jìn)展過程中異常的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。此外，研究者通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)非肥胖糖尿病小鼠模型血漿和PDR患者玻璃體液中支鏈氨基酸(branched-chain amino acid，BCAA)水平升高[10-11]。BCAA在DR中具體作用機(jī)制尚未闡明，但已有研究表明其合成抑制劑加巴噴丁可以顯著降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜BCAA及其下游谷氨酸水平，進(jìn)而改善大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷[12]。目前仍沒有可以完美模擬DR患者全部病理改變的動(dòng)物模型，因此其代謝組學(xué)研究具有很大的局限性，其結(jié)果僅能對(duì)高血糖對(duì)眼部造成的影響或病理性新生血管潛在治療靶點(diǎn)起到提示作用。

2.2 DR患者玻璃體液的代謝組學(xué)研究

玻璃體-視網(wǎng)膜界面在視網(wǎng)膜疾病中起重要作用，玻璃體新陳代謝與DR病理過程密切相關(guān)。利用代謝組學(xué)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)DR患者玻璃體液中異常富集的代謝途徑，通過挖掘異常代謝物來推測(cè)過度激活的酶，為探索治療靶點(diǎn)提供新的思路。Haines等[13]利用超高效LC-MS技術(shù)對(duì)25例孔源性視網(wǎng)膜脫離患者、9例PDR患者和8例視網(wǎng)膜前膜患者玻璃體樣本進(jìn)行對(duì)比分析，在PDR患者玻璃體液樣本中觀察到戊糖磷酸途徑過度激活，該途徑是維持谷胱甘肽穩(wěn)定和補(bǔ)充抗氧化酶的還原性輔酶Ⅱ主要來源。Curovic等[14]利用LC-MS技術(shù)在DR患者血漿樣本中也觀察到了這種變化。以上DR代謝組學(xué)研究結(jié)果均表明在氧化應(yīng)激條件下戊糖磷酸途徑發(fā)生改變。另外，Haines等[13]研究還發(fā)現(xiàn)DR患者玻璃體液中嘌呤代謝加快，黃嘌呤水平降低，而黃嘌呤上游代謝物鳥嘌呤、次黃嘌呤和肌苷水平升高，推測(cè)黃嘌呤氧化酶表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而與下游產(chǎn)物尿酸共同作用，產(chǎn)生過量的過氧化氫，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。相反，一項(xiàng)OIR小鼠模型全眼勻漿標(biāo)本代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示，黃嘌呤、次黃嘌呤和肌苷水平均降低[8]。分析出現(xiàn)這種結(jié)果的原因：一方面，可能因?yàn)?個(gè)研究中標(biāo)本代謝物提取方法不同，導(dǎo)致從不同溶劑中回收代謝物含量出現(xiàn)差異；另一方面，OIR小鼠模型并不能完全模擬PDR患者眼部代謝失調(diào)，但其結(jié)果可以一定程度上提示DR患者視網(wǎng)膜缺氧導(dǎo)致的代謝改變。Wang等[11]利用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOFMS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)DR患者和非糖尿病患者玻璃體樣品進(jìn)行對(duì)比分析，檢測(cè)到DR患者玻璃體液中精氨酸-脯氨酸代謝途徑中間環(huán)節(jié)產(chǎn)物鳥氨酸的水平顯著增加。精氨酸在視網(wǎng)膜中可經(jīng)一氧化氮合酶(nitric oxide synthases，NOS)催化生成一氧化氮(nitric oxide，NO)和瓜氨酸，或在精氨酸酶Ⅱ(arginase-Ⅱ，Arg-Ⅱ)作用下生成鳥氨酸和尿素[15]。糖尿病患者玻璃體液鳥氨酸水平升高表明視網(wǎng)膜組織中Arg-Ⅱ酶過度激活，進(jìn)而導(dǎo)致NOS途徑被競(jìng)爭(zhēng)性抑制，NO生成減少，這可能是血管舒張功能受損的原因[8,11]，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血、缺氧。因此，阻斷Arg-Ⅱ酶可能是延緩DR進(jìn)展的潛在治療策略。Wang等[11]還檢測(cè)到DR患者玻璃體液中L-亮氨酸和L-纈氨酸增加，提示BCAA合成途徑上調(diào)。高BCAA水平被認(rèn)為與視網(wǎng)膜中谷氨酸神經(jīng)毒性增加有關(guān)，阻斷突觸后神經(jīng)元的谷氨酸受體可以保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元功能和活性[12]。已有研究顯示，鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2抑制劑埃帕利氟嗪可以有效上調(diào)2型糖尿病患者BCAA分解代謝[16]。由此推測(cè)，埃帕利氟嗪可能對(duì)DR也有效。玻璃體液作為最靠近視網(wǎng)膜的眼內(nèi)液，較易采集且可以很好地代表視網(wǎng)膜代謝情況，但其取材過程中感染風(fēng)險(xiǎn)較高，因此玻璃體液來源的DR生物標(biāo)志物很難大范圍應(yīng)用于臨床診斷；此外，部分PDR患者玻璃體腔中殘留的血細(xì)胞成分也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾，造成組學(xué)結(jié)果出現(xiàn)偏差。

2.3 DR患者房水的代謝組學(xué)研究

房水由睫狀突上皮細(xì)胞產(chǎn)生，其主要循環(huán)途徑是經(jīng)后房、瞳孔、前房小梁網(wǎng)，最終匯入鞏膜上腔靜脈，其組成不僅取決于其產(chǎn)生過程，還取決于整個(gè)眼內(nèi)不同組織的代謝狀態(tài)。房水是眼內(nèi)組織細(xì)胞代謝的直接場(chǎng)所，代謝產(chǎn)物更新較快，可以更好地反映糖尿病狀態(tài)下眼內(nèi)組織的代謝狀態(tài)。Jin等[17]對(duì)糖尿病合并白內(nèi)障患者、DR合并白內(nèi)障患者和年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水進(jìn)行基于NMR方法的代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明DR患者房水中天冬氨酸、谷氨酰胺、組氨酸和蘇氨酸水平高于糖尿病合并白內(nèi)障患者。這些代謝產(chǎn)物參與的三羧酸循環(huán)受異檸檬酸脫氫酶和β-酮戊二酸脫氫酶調(diào)控，而這2種酶受高濃度腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)和還原型輔酶Ⅰ(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)抑制[18]。有研究表明，DR患者視網(wǎng)膜中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)/NADH比值顯著降低[19]，猜測(cè)這些氨基酸增加可能與DR患者體內(nèi)高水平NADH抑制三羧酸循環(huán)有關(guān)[17]。此外，Jin等[17]研究還顯示，DR合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者房水中二甲基精氨酸(dimethylarginine，DMA)水平高于糖尿病合并年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者。DMA是不對(duì)稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)主要代謝產(chǎn)物之一，ADMA通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制內(nèi)源性NOS引起NO生成減少，進(jìn)而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[20]。曾有研究者發(fā)現(xiàn)DR患者血漿中ADMA水平升高[21]。雖然沒有關(guān)于DMA和DR直接關(guān)聯(lián)性的研究，但Jin等[17]研究認(rèn)為DMA水平至少能部分反映DR患者視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激增強(qiáng)和內(nèi)皮功能障礙狀態(tài)。Wang等[11]在DR患者房水中檢測(cè)到抗壞血酸水平降低。早期Sinclair等[22]研究發(fā)現(xiàn)，DR患者血清抗壞血酸水平顯著降低。Haines等[13]在DR患者玻璃體液樣本中也檢測(cè)到抗壞血酸水平降低?？箟难峋哂幸种颇[瘤血管生成的作用[23]。因此，推測(cè)抗壞血酸可能參與DR血管生成過程。此外，Wang等[11]利用GC-TOFMS技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DR患者房水中D-2,3-二羥丙酸、異檸檬酸和L-乳酸含量與空腹血糖和糖化血紅蛋白水平均呈顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)糖酵解或糖異生、半乳糖代謝和抗壞血酸-醛酸代謝可能是DR患者房水中3個(gè)顯著干擾途徑。與玻璃體液相比，房水樣本取材感染風(fēng)險(xiǎn)較低，但其與視網(wǎng)膜組織距離較遠(yuǎn)，對(duì)視網(wǎng)膜代謝改變的代表性不如玻璃體液。但對(duì)于無法收取玻璃體液樣本或玻璃體有積血的患者，房水中代謝組學(xué)研究結(jié)果仍可以提示視網(wǎng)膜代謝功能改變。

2.4 DR患者血漿的代謝組學(xué)研究

由于血液的取材相對(duì)簡(jiǎn)單且成熟，血漿和血清常作為代謝組學(xué)的研究對(duì)象[24]。Chen等[25]利用GC-MS方法對(duì)40例DR患者、40例未發(fā)生DR的糖尿病患者和40例非糖尿病者血漿樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DR患者血漿中3,4-二羥基丁酸(dihydroxybutyric acid，DHBA)和2-脫氧核糖表達(dá)升高，而在未發(fā)生DR的糖尿病患者和非糖尿病者血漿中未發(fā)現(xiàn)此變化，推測(cè)這些代謝產(chǎn)物可能是DR區(qū)別于糖尿病的生物標(biāo)志物。目前已知3,4-DHBA是琥珀酸半醛脫氫酶缺乏癥的尿液生物標(biāo)志物，2-脫氧核糖是DNA氧化損傷所形成的產(chǎn)物。Curovic等[14]對(duì)1型糖尿病個(gè)體人群進(jìn)行代謝組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，血漿較高水平3,4-DHBA是DR進(jìn)展的生物標(biāo)志物。Sumarriva等[26]通過非靶向LC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)，血漿中高肉堿水平與PDR發(fā)生相關(guān)。3,4-DHBA和肉堿均參與腸道微生物群落的代謝，而腸道微生物群落的代謝改變參與了肥胖和糖尿病的發(fā)展[27-28]。腸道微生物群落代謝與DR發(fā)生和發(fā)展過程的聯(lián)系仍需進(jìn)一步探討。

Lin等[29]通過NMR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血漿樣本中BCAA、芳香族氨基酸和生糖氨基酸含量與糖尿病患者微血管并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)均呈正相關(guān)。然而Curovic等[14]在1型糖尿病患者的血漿中未發(fā)現(xiàn)這些氨基酸水平出現(xiàn)顯著改變，該研究認(rèn)為這可能是1型和2型糖尿病的異質(zhì)性。Zhu等[30]利用LC-MS技術(shù)對(duì)PDR患者血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PDR患者血清中富馬酸水平異常升高。已有研究表明，富馬酸與腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)慢性缺氧環(huán)境有關(guān)[31]。由于持續(xù)高血糖狀態(tài)往往導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺氧，因此，推測(cè)富馬酸可能參與了DR的發(fā)生和發(fā)展。然而，Haines等[13]在PDR患者玻璃體液中檢測(cè)到富馬酸下調(diào)，血漿和玻璃體的代謝產(chǎn)物存在差異性可能與血-眼屏障相關(guān)，富馬酸在DR中的作用仍有待進(jìn)一步研究。血漿較易得，以其為樣本的代謝組學(xué)研究更多是利用質(zhì)譜技術(shù)尋找DR潛在生物標(biāo)志物，探討DR發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，但這些機(jī)制目前仍不十分明確，血液反映患者全身代謝變化，難以展示眼局部病變的代謝變化，且個(gè)體差異較大，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性差，仍需更多的研究來驗(yàn)證這些結(jié)論。

3 小結(jié)與展望

目前，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)已廣泛應(yīng)用于DR發(fā)病機(jī)制、診斷以及預(yù)后研究中，相比于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，代謝組學(xué)從基因、蛋白質(zhì)改變的下游產(chǎn)物——代謝物層面對(duì)疾病進(jìn)行探索，從更接近生物表型的角度反映DR進(jìn)展過程中機(jī)體的病理改變。此外，隨著代謝物通過對(duì)大分子DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾來調(diào)節(jié)上游生物過程的功能被闡明，代謝組學(xué)成為探索DR病理機(jī)制的有力工具。

目前，DR代謝組學(xué)研究主要以人眼內(nèi)液和血漿為樣本，人眼內(nèi)液取樣具有侵入性，但對(duì)眼部代謝改變的表現(xiàn)更加直觀；血漿取材易得，但其中代謝物質(zhì)改變并不能和眼部病變完全一致，同時(shí)外周血中代謝物水平更易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致部分結(jié)果不能被重復(fù)[32]；DR相關(guān)的動(dòng)物模型僅能模擬DR患者部分病理改變，其代謝組學(xué)研究結(jié)果需在DR患者樣本中進(jìn)行驗(yàn)證。相信隨著醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，會(huì)有更多與DR相關(guān)的代謝物被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)在大量樣本中驗(yàn)證異常代謝物和代謝通路，從而提高數(shù)據(jù)的可靠性，使代謝組學(xué)具有更大的研究和應(yīng)用潛力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

志謝感謝天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院張慧對(duì)本綜述的貢獻(xiàn)