黃佳南， 張媛莉

膿毒癥是由多種細菌等病原體感染入侵人體而引起各種生化、生理及病理異常的綜合癥，其發(fā)病率和病死率較高[1]。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，血小板胞外囊泡在膿毒癥中發(fā)揮不可替代的作用，被建議作為膿毒癥的生物標(biāo)志物。本綜述將從血小板胞外囊泡參與膿毒癥的炎癥反應(yīng)、凝血功能障礙、心肌損傷等多方面進行闡述，旨在進一步明確血小板胞外囊泡在膿毒癥的作用機制，并為膿毒癥的治療提供一定的參考和依據(jù)。

1 血小板與膿毒癥

在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中，血小板扮演著重要的角色。隨著膿毒癥促炎及促凝機制的發(fā)生，血小板是最先反應(yīng)的細胞之一[2]。血小板是由巨核細胞脫落形成的無核細胞碎片，作為最小的血細胞在健康個體的數(shù)量為(100～300)×109/L。血小板膜上表達著與炎癥、免疫相關(guān)的分子，包括補體受體、黏附分子、各種受體及與其他細胞相互接觸所必需的介質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)決定了其重要功能[3]。在從巨核細胞脫落后，血小板在循環(huán)中存在5～7天，主要作為止血和血栓形成的調(diào)節(jié)劑。在正常情況下，血管損傷后，血小板在血液中被激活，黏附于內(nèi)皮下暴露的細胞外基質(zhì)上，形成血小板血栓，最終與纖維蛋白等組成完整的血栓[4]。但目前關(guān)于血小板在膿毒癥中發(fā)揮的作用仍有異議，有部分研究[5-6]認(rèn)為，血小板會加重炎癥反應(yīng)。也有研究[7-8]表明，血小板在膿毒癥中能夠抑制炎癥的發(fā)生、發(fā)展。還有大量研究[9-10]證實，血小板胞外囊泡能夠通過不同機制參與到對固有免疫的調(diào)控中，進一步控制膿毒癥炎癥的發(fā)生。

2 血小板胞外囊泡

細胞外囊泡(extracellular vesicles)是從細胞質(zhì)膜(微囊泡或微粒)或細胞內(nèi)體區(qū)室(外泌體)釋放的膜囊泡[11]。由于文獻中對術(shù)語的使用不一致，且難以證明特定的生物發(fā)生途徑，現(xiàn)今細胞外囊泡是一個總稱，涵蓋細胞釋放的各種亞型膜結(jié)構(gòu)，包括微囊泡、微粒、外泌體、腫瘤小體、凋亡小體和許多其他名稱[12]。血小板胞外囊泡含直徑30 nm 至1 μm 的球形細胞外囊泡、1～5 μm長的管狀細胞外囊泡，主要存在于外周血液中，在血小板活化、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡時其數(shù)量增加，但因刺激因素的不同，所釋放的血小板胞外囊泡的類型會有所差異[13]。血小板胞外囊泡充當(dāng)多種功能分子，包括信號介質(zhì)、生長因子、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等，它們介導(dǎo)細胞間合作、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和修復(fù)等[14]。

3 血小板胞外囊泡與膿毒癥

3.1血小板胞外囊泡參與膿毒癥的炎癥反應(yīng)

在膿毒癥中，活化的血小板能夠誘導(dǎo)對感染的急性期反應(yīng)[6]。血小板的細胞質(zhì)中含有致密顆粒、α顆粒和溶酶體。致密顆粒含有鈣離子(Ca2+)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)等。而α顆粒則含有凝血酶、血管性血友病因子(VWF)、P選擇素(P-selectin)、生長因子、趨化因子，且α顆粒的形成與人類的疾病狀況相關(guān)[15-16]。這些顆粒、信號分子、蛋白質(zhì)部分被組裝包裹形成血小板胞外囊泡。在活化激動劑(如ADP、凝血酶、血栓素A2等)通過G蛋白偶聯(lián)受體或其他受體結(jié)合時，通過Ca2+/蛋白激酶C(PKC)通路磷酸化可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)后，血小板分泌胞外囊泡來釋放各種分子，進一步促進血小板活化、黏附、聚集和分泌，形成瀑布效應(yīng)，放大炎癥反應(yīng)[17]。而在膿毒癥中脂多糖(LPS)通過與血小板上Toll樣受體(TLR)4結(jié)合后，激活蛋白激酶B(Akt)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，促進血小板胞外囊泡的分泌上升，使釋放的白細胞介素(IL)-1β等炎癥因子增加[18]。此外，膿毒癥中葡萄球菌超抗原樣蛋白5(SSL5)能夠誘導(dǎo)血小板胞外囊泡通過單核細胞中CD40/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路激活單核細胞表達和釋放炎癥介質(zhì)，包括IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)，且呈劑量和時間依賴性[19]。

與此同時，這些血小板胞外囊泡也參與到與其他炎癥細胞的調(diào)節(jié)中，如中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等，促進炎癥細胞的募集，誘導(dǎo)炎癥細胞活化、分泌和黏附等[20]。Sung等[21]實驗發(fā)現(xiàn)，細胞外囊泡通過C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族5成員A(CLEC5A)/TLR2途徑誘導(dǎo)中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(NETs)形成和促炎細胞因子釋放，增強登革熱病毒誘導(dǎo)疾病的致死率。Chimen等[22]從血小板衍生的細胞外囊泡中提取出血小板膜糖蛋白Ibα(GPIbα)，并發(fā)現(xiàn)GPIbα支持單核細胞在全身炎癥中的募集。French等[23]發(fā)現(xiàn)，血小板衍生的細胞外囊泡在炎癥期間浸潤并改變骨髓，從而參與到免疫反應(yīng)中。值得一提的是，血小板胞外囊泡在活化和凋亡時從血小板中釋放出具有特異性的膜表位，這些分子在膿毒癥中可以作為個體化治療標(biāo)志物[24]。

3.2血小板胞外囊泡參與膿毒癥的凝血功能障礙

由于大量炎癥細胞和炎癥因子激活凝血級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致大量血小板被消耗，血栓形成，最終形成凝血功能障礙[25-26]。血小板胞外囊泡是凝血系統(tǒng)調(diào)節(jié)的重要組成部分，具有促凝的特性[27]。血小板胞外囊泡的凝血能力大約是單獨血小板的50～100倍，其凝血能力的增加是由于翻轉(zhuǎn)酶在活化狀態(tài)下導(dǎo)致血小板胞外囊泡表面上的磷脂酰絲氨酸表面積增加。Reddy等[28]使用成像流式細胞儀技術(shù)觀察到在活化狀態(tài)下具有胞外囊泡的血小板表面上暴露出大面積磷脂酰絲氨酸。Meijden等[29]發(fā)現(xiàn)，來自血小板和紅細胞的胞外囊泡不僅通過暴露磷脂酰絲氨酸促進凝血，而且還以凝血因子XⅡ(FXⅡ)依賴性方式獨立于組織因子(TF)，啟動凝血酶生成。Lopez等[30]使用大鼠失控出血模型來評估血小板胞外囊泡的促凝效果，發(fā)現(xiàn)凝血酶生成速率和數(shù)量以及整體凝塊強度與血小板胞外囊泡的劑量存在依賴性增加的關(guān)系，且出現(xiàn)血壓上升、乳酸水平降低、堿過量下降和血漿蛋白濃度增加等結(jié)果。

此外，血小板胞外囊泡的促凝作用不僅涉及促凝表面積的增殖，而且與損傷部位不同細胞參與者的交聯(lián)和轉(zhuǎn)移其他細胞類型的激活信號相關(guān)[31]。Gasecka等[32]通過使用P2Y12拮抗劑及P2Y1拮抗劑，抑制P2Y1和P2Y12受體，導(dǎo)致血小板聚集減少，并使血小板胞外囊泡的釋放量下降。而血小板活化后，在血小板表面表達P選擇素，并與免疫循環(huán)細胞表面所表達的P選擇素糖蛋白1(PSGL-1)相結(jié)合，從而促使單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞向活化的內(nèi)皮細胞募集、滾動及黏附，促進血栓形成[33]。Ssmajo等[34]發(fā)現(xiàn)，活化蛋白質(zhì)S和凝血因子V是抑制因子Ⅷa的協(xié)同輔助因子，而活化的蛋白C系統(tǒng)具有抵抗血小板胞外囊泡促凝能力的功能。血小板胞外囊泡的促凝功能加重了膿毒癥創(chuàng)傷，甚至導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的發(fā)生，這是膿毒癥最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。Ohuchi等[35]收集患者的基礎(chǔ)臨床資料，分析血小板胞外囊泡的分泌水平與住院病死率或DIC之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)血小板胞外囊泡與DIC具有相關(guān)性，但與住院病死率無關(guān)。Wang等[36]通過構(gòu)建盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)膿毒癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)血小板胞外囊泡是磷脂酰絲氨酸暴露和激活內(nèi)源性和外源性凝血途徑的總凝血酶(TG)的有效誘導(dǎo)劑，能夠調(diào)節(jié)膿毒癥凝血酶的產(chǎn)生，加重凝血功能障礙，促進DIC的發(fā)生。

3.3血小板胞外囊泡參與膿毒癥的NETs形成 NEFs是一種基于染色質(zhì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可釋放到細胞外環(huán)境中以幫助清除病原體，但它們也與導(dǎo)致組織損傷、自身免疫增強和血管內(nèi)血栓形成的過度炎癥有關(guān)[37]。在膿毒癥期間，LPS能夠通過與血小板表面表達的TLR4相結(jié)合，以誘導(dǎo)血小板與中性粒細胞黏附，從而促使NEFs的形成[38]。在膿毒癥期間，NEFs通過提供高濃度的抗菌分子對細菌的隔離和殺滅，從而介導(dǎo)宿主的免疫防御[39]。盡管參與人血小板介導(dǎo)的NETs生成的介質(zhì)和分子途徑仍不明確，但仍有證據(jù)表明，血小板胞外囊泡參與到膿毒癥中的NETs形成。Mcvey等[40]假設(shè)來自于血小板和神經(jīng)酰胺依賴性的細胞外囊泡形成誘導(dǎo)了輸血相關(guān)性急性肺損傷，且列舉了小鼠血小板儲存過程中形成的細胞外囊泡，并將其應(yīng)用于小鼠輸血相關(guān)性急性肺損傷模型和體外內(nèi)皮屏障評估，以此證明血小板細胞外囊泡通過鞘脂變阻器失衡介導(dǎo)輸血相關(guān)的急性肺損傷。Jiao等[41]通過將健康對照者和感染性休克患者的血漿分離獲取外泌體，再將獲取的外泌體、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)及LPS刺激人血小板后獲取的上清液與多形核中性粒細胞(PMN)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外泌體高遷移率組蛋白1(HMGB1)和(或)微小RNA(miR)-15b-5p和miR-378a-3p，通過Akt/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬途徑誘導(dǎo)NETs形成，結(jié)果表明，IκB激酶(IKK)控制感染性休克中血小板衍生的外泌體分泌。

3.4血小板胞外囊泡參與膿毒癥的心肌損傷

膿毒癥心肌病是膿毒癥患者常見的并發(fā)癥之一，但膿毒癥心肌病的定義仍有異議[42]。膿毒癥產(chǎn)生的活性氧(ROS)將激活血小板，釋放含有高水平煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的外泌體，這些外泌體增加內(nèi)皮細胞內(nèi)的一氧化氮(NO)與ROS，這將導(dǎo)致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3級聯(lián)反應(yīng)的激活，促使內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生。Monteiro等[43]發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥中血小板通過ROS激活后，將含有高濃度的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的外泌體在心臟血管中釋放，而這些外泌體被內(nèi)皮細胞活化，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細胞死亡和心臟功能障礙。此外，Azevedo等[44]通過實驗發(fā)現(xiàn)，來自膿毒癥患者的循環(huán)血小板衍生外泌體在離體心臟和乳頭肌制劑中誘導(dǎo)心肌功能障礙，并且這種現(xiàn)象因LPS刺激而增強。

另一方面，血小板外泌體中含有miR-223，能夠下調(diào)內(nèi)皮細胞內(nèi)的細胞間黏附分子1(ICAM1)、轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、信號素3A(Semaphorin)及心肌細胞中的TNF-α、IL-6和IL-1β，從而減少內(nèi)皮細胞損傷和保護心肌。Li等[45]通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測膿毒癥患者的miR-132和miR-223，發(fā)現(xiàn)miR-132聯(lián)合miR-223對膿毒癥誘發(fā)的心肌病預(yù)后的敏感性及特異性分別為85.96%和65.22%，miR-132聯(lián)合miR-223可用于心肌病的早期診斷和預(yù)后評估。Wang等[46]通過盲腸結(jié)扎穿孔構(gòu)建膿毒癥小鼠模型，發(fā)現(xiàn)相較于miR-233-KO的小鼠，野生型小鼠的胞外囊泡具有更高水平的miR-233，可將其傳遞至心肌細胞，導(dǎo)致信號素3A和STAT3下調(diào)，減少炎癥反應(yīng)和心肌細胞死亡。

綜上所述，血小板來源的胞外囊泡在膿毒癥中發(fā)揮著重要作用，不僅能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和凝血功能障礙，而且可以協(xié)助NETs的形成，甚至可以減輕膿毒癥心肌病損傷，是具有一定潛力的膿毒癥治療靶點[47-48]。當(dāng)然膿毒癥發(fā)病機制復(fù)雜，僅針對血小板胞外囊泡治療膿毒癥無法達到最佳療效，未來還需探索更多的治療膿毒癥的新方案，更好地服務(wù)于人民大眾。