韋嘉儀 綜述 王方 審校

同濟大學附屬第十人民醫(yī)院眼科，上海200072

視網膜位于眼球壁最內層，主要由視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞、感光細胞和Müller細胞組成。RPE完整性在維持視網膜功能中起著重要作用。RPE將神經視網膜與下層的Bruch膜及有孔的脈絡膜毛細血管分開，并通過分隔脈絡膜毛細血管形成血-視網膜外屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)。同時以多種生理功能，如提供視網膜營養(yǎng)因子、維持維生素A視覺循環(huán)、吞噬光感受器脫落盤膜等支持和穩(wěn)定神經視網膜的正常功能。RPE的這些重要作用均基于其細胞間連接的正常和穩(wěn)定。近年，隨著細胞分子生物學檢測技術不斷成熟和發(fā)展，重新認識RPE細胞間連接成為研究熱點。大量研究發(fā)現，RPE細胞間連接異常是許多眼底疾病發(fā)生的基礎或前奏，靶向保護RPE細胞間連接對于臨床預防和治療眼底疾病具有重要的意義。本文就RPE細胞間連接及其在眼底病變中的作用進行綜述。

1 RPE細胞間連接

大量研究證實，RPE細胞間連接對于組裝和維持細胞結構具有重要作用。超微結構下，RPE細胞間連接主要是緊密連接、黏附連接和縫隙連接。

1.1 緊密連接

緊密連接是上皮細胞和內皮細胞間黏附復合體，以緊密的膜接觸形成膜內擴散屏障，維持細胞表面極性，限制脂質細胞膜內外的擴散。與其他上皮細胞不同，RPE的頂面與神經組織直接接觸，參與感光細胞外節(jié)的日常吞噬作用。雖然目前對RPE內物質在細胞間運輸的研究甚多，但對緊密連接復合體在健康和疾病狀態(tài)中作用的研究甚少。

緊密連接是由一個復雜蛋白質網絡組成的跨膜蛋白和胞漿蛋白在上皮細胞中的一種細胞-細胞連接，構成了上皮細胞兩側固有的一種屏障，阻止大多數可溶性分子滲透。早期通過冷凍斷裂電子顯微鏡發(fā)現，緊密連接是以網狀結構包繞在頂層膜周圍。最近，通過制作非晶碳樣品在透射電子顯微鏡下觀察發(fā)現，緊密連接網狀結構膜內的原纖維呈雙鏈形態(tài)，這種雙鏈結構的緊密連接更有助于未來細化分析其時序性變化。在組織結構上，緊密連接由完整的膜蛋白、細胞骨架蛋白和細胞質斑蛋白組成。這些蛋白包括Occludin、Claudins、細胞黏附因子、Tricellulin以及膜相關的鳥苷酸激酶家族支架蛋白，即封閉蛋白(zonula occludens，ZO)，包括ZO1、ZO2和ZO3。其中ZO蛋白包含一系列保守的蛋白-蛋白相互作用結構域，即PDZ、SH3和GuK，負責連接不同的黏附受體，例如Claudins及其細胞骨架。緊密連接是特殊結構，即通過形成一條閉鎖小帶完全包圍單層上皮細胞，從而遮蓋RPE細胞之間幾乎所有的空間，以維持細胞極性，有效阻止血漿成分和有毒分子向視網膜移動，并允許液體和溶質通過滲透梯度從脈絡膜脈管系統(tǒng)滲透到視網膜外層。

1.2 黏附連接

黏附連接位于緊密連接正下方，可穩(wěn)定細胞結構和功能并執(zhí)行多種功能，包括維持細胞間黏附、調節(jié)肌動蛋白細胞骨架、參與細胞內信號傳導和細胞間通訊等，同時也受到多種細胞機制的調節(jié)。黏附連接有3個分子結構域，即微絲、細胞內噬菌斑和膜結構域。其核心蛋白包括經典鈣粘蛋白超家族的跨膜糖蛋白，包括E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白和P-鈣粘蛋白等，及連接蛋白家族成員，包括p120-連環(huán)蛋白，β-連環(huán)蛋白和α-連環(huán)蛋白等。鈣粘蛋白的黏附連接對于神經上皮的完整性至關重要，賦予了上皮堅固性和可塑性雙重功能特征，使得當組織損傷后可通過快速的細胞間接觸重塑加速傷口愈合。此外，黏附連接的堅固性特征在限制細胞遷移中起著至關重要的作用。

黏附連接的核心成分鈣粘蛋白分子簇是通過反式的親和相互作用介導細胞間的黏附。經典的鈣粘蛋白在許多上皮細胞中為E-鈣粘蛋白，由跨膜受體介導，以蛋白復合物形式發(fā)揮作用。E-鈣粘蛋白的非結構化胞質區(qū)域可直接與β-連環(huán)蛋白結合，β-連環(huán)蛋白依次與α-連環(huán)蛋白結合，形成鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復合物。復合物中結合的α-連環(huán)蛋白還可通過其肌動蛋白結合域與F-肌動蛋白相互作用。這種鈣粘蛋白與肌動蛋白細胞骨架的相互作用，構成了上皮的堅固性和可塑性。黏附連接在生物生長發(fā)育中也起到了重要作用。一項針對果蠅眼發(fā)育的研究發(fā)現，黏附連接對于果蠅視網膜神經上皮發(fā)育、視網膜細胞極性、控制光感受器狀態(tài)等方面具有重要作用。

雖然黏附連接研究領域取得了長足的進步，但是許多重要的問題仍存在爭議。最近一個新觀點更新了傳統(tǒng)的黏附連接由鈣粘蛋白、β-連環(huán)蛋白和α-連環(huán)蛋白與肌動蛋白細胞骨架結合組成穩(wěn)定復合物模型的認識，認為黏附連接是一種動態(tài)結構，當其相關蛋白與相鄰細胞的對應物產生短暫連接以及E-鈣粘蛋白參與肌動蛋白細胞骨架重塑，通過Rac、Cdc42和Arp2/3活性促進細胞表面片狀和絲狀突起；這些動態(tài)突起進一步促進了E-鈣粘蛋白相互作用和聚集；這樣黏附連接會不斷重復形成并加強。盡管鈣粘蛋白與β-連環(huán)蛋白和α-連環(huán)蛋白形成復合物，但這種鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復合物與肌動蛋白細胞骨架無關；α-連環(huán)蛋白不直接將細胞黏附蛋白錨定到肌動蛋白細胞骨架上，而是作為一種調節(jié)蛋白來控制肌動蛋白纖維動力學。

Gaonac'h-Lovejoy等研究顯示，Ras家族小G蛋白基因

Rap1

突變上皮細胞的黏附連接會濃縮在細胞一側，而失去其正常的位置分布。以往研究認為黏附連接和緊密連接互不相關，最新證據表明二者之間高度依賴，且之間存在直接連接和信號連接關系，例如，ZO-1通過與Afadin、α-連環(huán)蛋白和肌動蛋白結合后的相互作用促進緊密連接和黏附連接，同時通過信號傳導調節(jié)黏附連接的成熟和緊密連接的后續(xù)組裝。

1.3 縫隙連接

超微結構下，相鄰上皮細胞間的縫隙連接結構為約2 nm的窄隙，此區(qū)域內的細胞間通道允許離子、小分子和低分子量代謝物在相鄰細胞之間擴散，以保證上皮細胞的許多生理功能，包括傳導電信號和調節(jié)細胞間信號功能等。在脊椎動物中縫隙連接由來自相鄰細胞的連接小體并置形成的縫隙連接蛋白組成。最新研究發(fā)現，縫隙連接通道的門控特性和通透性取決于縫隙連接蛋白同工型及其翻譯后修飾。組成視網膜的細胞中都存在縫隙連接，其中也包括RPE細胞。據報道，在黃斑變性、青光眼和糖尿病視網膜病變以及相關動物模型中，縫隙連接均與RPE細胞損傷有關。例如壓力或者損傷情況下，縫隙連接通過降低代謝緩解細胞間壓力，其相連細胞可以共享代謝產物。但在更高壓力下，細胞間縫隙連接反而導致代謝產物耗盡而逐步導致細胞死亡。

1.4 橋粒

橋粒被定義為鈣依賴性錨定連接點，其主要由橋粒鈣粘蛋白家族(包括desmocollins和desmoglein)，Armadillo蛋白家族(包括plakoglobin和plakophilins)和血小板溶素家族(主要為desmoplakin)3種基因家族組成。橋粒通過與中間絲耦合發(fā)揮細胞間黏附作用，其中plakoglobin和plakophilins與desmoplakin直接相連，并介導橋粒鈣粘蛋白與中間絲相連。超微結構下相鄰的RPE細胞間橋粒呈對稱分布，但RPE細胞與Bruch膜間這種特化結構呈半橋粒狀態(tài)。橋粒是一種多蛋白復合體，且其中間絲錨定在質膜上可介導細胞間的黏附，賦予了RPE細胞之間、RPE與基底膜較強的黏附力和細胞骨架結構，具有較強的抗機械力能力。

2 RPE細胞間連接在眼底病變中的作用

2.1 RPE細胞間連接與增生性玻璃體視網膜病變

增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)被定義為孔源性視網膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment，RRD)和RRD手術后在玻璃體及視網膜內外表面形成無血管的纖維細胞性增生膜，進而收縮和牽拉視網膜所致的一類病變。目前玻璃體切割術、鞏膜扣帶術是PVR主要的治療方式。盡管在PVR發(fā)病機制研究和手術技巧上已經有了長足進步，但是嚴重PVR視網膜不能有效復位仍是其復位術失敗的主要原因。正常靜止狀態(tài)下，RPE細胞通過緊密連接和黏附連接結合在一起，并通過半橋粒附著在Bruch膜上。RRD發(fā)生后，靜止的RPE將暴露于玻璃體和血液衍生的細胞因子和生長因子環(huán)境下，導致RPE細胞從Bruch膜上脫落。在整個病變過程中，RPE細胞丟失了黏附連接中的E-鈣粘蛋白、緊密連接中的ZO-1蛋白和縫隙連接中的縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)等上皮連接標志物，最終細胞間連接分解。Zhou等研究發(fā)現，RPE細胞保留了重編程能力，可連續(xù)地從極化上皮細胞向間充質細胞轉變，提示其功能發(fā)生障礙，其機制可能與緊密連接破壞、錯誤折疊的蛋白積累以及一些關鍵途徑失調有關。連接復合物的破壞使RPE細胞在細胞因子和生長因子的刺激下激活信號通路，如β-連環(huán)蛋白/Wnt和Hippo信號傳導，啟動上皮細胞向間充質轉化過程，這是PVR發(fā)生的重要機制。除此之外，Bao等研究證明在RPE細胞中E-鈣粘蛋白、ZO-1和Cx43共定位且彼此直接結合，它們之間的相互作用對于RPE功能具有重要作用，敲低其中1種蛋白質的表達就會導致其他2種蛋白表達下調。Yao等研究表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白7可通過Smad2/3途徑抑制轉化生長因子-β介導的RPE細胞上皮-間質轉化，從而抑制纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的上調以及E-鈣粘蛋白和ZO-1的下調，并抑制RPE收縮。Hazim等和Lidgerwood等專注研究緊密連接形成機制，先后證明維生素B家族成員煙酰胺是RPE細胞轉分化中緊密連接形成的必要因素；RPE細胞中溶血磷脂酸以受體依賴性機制調節(jié)緊密連接。該發(fā)現有助于尋找新的PVR治療干預措施。

2.2 RPE細胞間連接與年齡相關性黃斑變性

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種進行性慢性疾病，因黃斑感光細胞損傷導致患者發(fā)生不可逆視力喪失。RPE長期耗氧產生的氧化應激損傷及生理過程中代謝產物不斷累積是AMD發(fā)生的主要因素，且氧化應激下RPE細胞自噬功能異常也加速這一病理過程。氧化應激反應直接結果是RPE細胞間連接蛋白不能正常成熟或失去表達，破壞RPE完整性從而導致oBRB破壞。

Borras等通過體外研究發(fā)現，補體因子H(complement factor，CFH)基因中的Y402H多態(tài)性與AMD發(fā)生密切關聯；重組CFH可抵抗氧化脂質4-羥基-2-壬烯醛(4-HNE)誘導的ARPE-19和多能干細胞誘導RPE細胞氧化損傷，其原因在于CFH能加強RPE細胞的緊密連接結構，穩(wěn)定oBRB。自噬是維持RPE上皮形態(tài)和功能的關鍵調控途徑。自噬在AMD發(fā)病機制中的作用研究廣泛，但仍有許多未解答的問題，其中包括RPE細胞自噬異常后對RPE細胞間連接蛋白的影響。Ji Cho等研究發(fā)現，當體外HO誘導人RPE細胞系ARPE-19細胞氧化損傷后，硫氧還原蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)表達迅速下調，同時細胞的多項生物活力發(fā)生變化，包括自噬活性增加，其機制可能與氧化應激導致AMPK激活有關，而AMPK是自噬過程中細胞能量感知和細胞信號調控的重要激酶；RPE細胞自噬異?？芍苯悠茐木o密連接，破壞RPE的完整性。進一步研究發(fā)現，在TXNIP蛋白缺失的ARPE-19細胞中，ZO-1蛋白基本消失，而肌動蛋白應力纖維顯著增加，因此研究者認為應力纖維很可能是利用其張力直接破壞RPE細胞間的緊密連接；此外，該研究還顯示

TXNIP

基因敲除后可上調缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的表達，導致RPE細胞分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)增加，這是AMD的另一種病理學基礎。

最新研究證實，淀粉樣蛋白β可以在體內外激活RPE細胞的核因子(nuclear factor，NF)-κB信號通路，即通過NF-κB信號傳導途徑破壞RPE細胞的緊密連接。抑制NF-κB信號傳導可防止淀粉樣蛋白β介導的緊密連接破壞，有助于探索AMD治療的新靶點。Warden等的研究證明，膽汁酸?；悄懰峥梢酝ㄟ^保護RPE細胞間的緊密連接抑制細胞在百草枯誘導下的氧化損傷。氨基酸同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高引發(fā)的高同型半胱氨酸血癥通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)破壞BRB，從而誘發(fā)AMD，而抑制或消除NMDAR能夠通過恢復緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達，抑制Hcy誘導的BRB分解，對治療AMD有一定的臨床意義。

2.3 RPE細胞間連接與糖尿病視網膜病變

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是發(fā)達國家工作年齡人群致盲的重要原因。DR的主要病理性特征是視網膜內、外屏障破壞，新生血管生成和視網膜神經變性。在糖尿病進展過程中由于RPE細胞之間的緊密連接蛋白表達降低、緊密連接復合物分解致使脈絡膜毛細血管的生物大分子可通過RPE細胞間隙滲漏，形成黃斑水腫。Lopes等研究證明，δ阿片受體激動劑治療可以通過上調claudin-1、ZO-1等緊密連接蛋白，抑制DR模型中視網膜病變早期VEGF、色素上皮衍生因子的表達，證明其具有治療DR的潛能。

Zhang等研究表明，鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型大鼠RPE細胞HIF-1α和JNK信號通路被激活，細胞中ZO-1和Occludin表達下降，從而導致PRE完整性破壞和oBRB功能受損；而促紅細胞生成素可通過下調HIF-1α和JNK信號表達，穩(wěn)定緊密連接蛋白的表達及oBRB的完整性。體外高糖處理的ARPE-19細胞會發(fā)生RPE細胞間緊密連接丟失和形態(tài)學損傷，而維生素D可修復這一變化，這一發(fā)現在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型小鼠眼得到證實。另有研究表明，Norrin蛋白丟失將導致DR表型，VEGF誘導的DR中oBRB損害可以通過注射Norrin蛋白抑制，其機制是Norrin蛋白以黏附連接中β-連環(huán)蛋白依賴的方式恢復緊密連接中Claudin-5的表達并恢復oBRB的功能及完整性。在轉基因糖尿病小鼠眼中，葡萄糖/淀粉樣蛋白β觸發(fā)的活性氧和晚期糖基化終產物生成可使RPE中ZO-1、Occludin-1、基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9的表達水平下降，桉樹素可以通過對抗這些產物，維持RPE細胞間連接和細胞的完整性。這些保護因子可以通過穩(wěn)定細胞連接表達、維持RPE完整性來抑制DR的發(fā)生和發(fā)展。

3 總結與展望

在生理以及病理狀態(tài)下，RPE細胞間連接對于視網膜結構和功能的建立和維持至關重要。RPE細胞作為神經視網膜層和脈絡膜層交界處的重要支持細胞，穩(wěn)定細胞間連接的完整性是維持RPE穩(wěn)定的首要基礎。在病理條件下，RPE細胞間連接，尤其是緊密連接和黏附連接破壞常常是導致各種眼底病變的觸發(fā)因素。近年越來越多研究開始聚焦RPE細胞間的連接蛋白變化，甚至以這些蛋白的變化作為疾病診斷和治療效果指標。

有關RPE細胞間連接和眼底病變之間關系的基礎研究和臨床應用尚不完善。例如，細胞間連接蛋白破壞的具體分子機制還不清楚；關于RPE細胞間縫隙連接破壞與疾病發(fā)生關系的研究較少；通過何種給藥方式以靶向保護受損部位等問題都值得繼續(xù)研究和探討?？傊?，隨著RPE細胞間連接蛋白維持RPE完整性研究的不斷深入，有望為眼底疾病診斷和治療帶來新的策略和手段。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突