韓涵 綜述 何宇茜 張妍 審校

吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科中心角膜屈光科，長春 130041

角膜是一種無血管的透明曲面結(jié)構(gòu)，提供了眼屈光系統(tǒng)約70%的屈光力。角膜包含5層結(jié)構(gòu)，由前向后依次為上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層。其中，角膜基質(zhì)層是角膜的主要結(jié)構(gòu)，是角膜透明性的主要提供者，含有以Ⅰ型膠原蛋白為主要結(jié)構(gòu)成分的膠原纖維、以小分子亮氨酸重復(fù)蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycans，SLRPs)為代表的蛋白聚糖和角膜基質(zhì)細(xì)胞等。SLRPs家族主要分為Ⅰ型(biglycan和decorin)、Ⅱ型(fibromodulin、keratocan和lumican)和Ⅲ型(osteoglycin)。生理狀態(tài)下，SLRPs家族成員間相互作用并與膠原蛋白相互作用，共同維持合適的膠原纖維直徑和纖維間距，在調(diào)控膠原纖維的形成、裝配和空間上的有序排列中起重要作用。此外，SLRPs還可以通過結(jié)合轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等細(xì)胞因子及其受體在角膜創(chuàng)傷修復(fù)和基質(zhì)重塑等病理過程中發(fā)揮重要作用。深入理解SLRPs在角膜透明性維持生理病理過程中的作用對于我們探索角膜透明性下降等疾病的治療手段具有重要意義。本文就生理病理狀態(tài)下SLRPs維持角膜透明的分子機(jī)制和SLRPs家族成員間的相互作用進(jìn)行綜述。

1.SLRPs家族成員及其生物學(xué)活性

SLRPs均由含有亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeats，LRRs)的同源核心蛋白和1～2個(gè)通過共價(jià)鍵與核心蛋白連接的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)側(cè)鏈構(gòu)成。角膜基質(zhì)層中的SLRPs主要由角膜基質(zhì)細(xì)胞分泌，并依據(jù)GAG側(cè)鏈的類型主要分為3類，即含有硫酸皮膚素(dermatan sulfate，DS)的Ⅰ型SLRPs、含有硫酸角質(zhì)素(keratan sulfate，KS)的Ⅱ型和Ⅲ型SLRPs。SLRPs可通過GAG側(cè)鏈影響細(xì)胞生長、結(jié)合水分子和生長因子，調(diào)控基質(zhì)含水量以及膠原纖維的形成、裝配和排列，進(jìn)而維持角膜透明性；同時(shí)，核心蛋白中央?yún)^(qū)的LRRs也可幫助SLRPs與膠原蛋白、生長因子及其細(xì)胞膜受體等蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，從而促進(jìn)SLRPs對角膜透明性的調(diào)節(jié)作用。

1.1 Ⅰ型SLRPs

1.1.1

結(jié)構(gòu)及分布 Decorin和biglycan均屬于Ⅰ型SLRPs，結(jié)構(gòu)包含10個(gè)LRRs和N端特異性絲氨酸序列(CXCXCXC)。在角膜發(fā)育階段，decorin和biglycan在角膜基質(zhì)層中均勻分布且含量均較高；在成熟角膜基質(zhì)層中，biglycan含量有所降低；而在角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程中，角膜基質(zhì)層中biglycan含量有所升高。

1.1.2

生物學(xué)活性 Decorin和biglycan在維持角膜基質(zhì)層膠原纖維的正常結(jié)構(gòu)和排列等方面發(fā)揮重要作用。Decorin缺失小鼠模型中角膜膠原纖維直徑增大、排列紊亂，角膜透明性明顯下降。此外，decorin可通過降低血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule,Pecam)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等促血管生成因子的表達(dá)，抑制角膜新生血管，提高角膜透明度。Biglycan與decorin存在補(bǔ)償性作用。在decorin缺失模型小鼠發(fā)育階段，角膜基質(zhì)層中biglycan的表達(dá)將會上升，可部分緩解因decorin缺失而產(chǎn)生的不良效應(yīng)；而在biglycan缺失模型小鼠發(fā)育階段，角膜基質(zhì)層decorin的表達(dá)量并未代償性升高，故推測decorin是膠原纖維形成的主要調(diào)節(jié)分子，而biglycan是補(bǔ)償性調(diào)節(jié)分子。因此，當(dāng)decorin缺失時(shí)，biglycan表達(dá)代償性升高；而當(dāng)decorin和biglycan均缺失時(shí)，會產(chǎn)生基質(zhì)層膠原纖維直徑增大且形態(tài)不規(guī)則、基質(zhì)層后部纖維直徑增大和形態(tài)較前部更不規(guī)則等影響，膠原纖維堆積和基質(zhì)層的有序結(jié)構(gòu)受到破壞，影響角膜透明性的維持。在decorin缺失模型小鼠的成體階段，角膜透明性并未顯著下降，但會出現(xiàn)皮膚脆性增加、肌腱無力和氣道阻力降低等癥狀；而在biglycan水平較低的成年患者骨骼中，成骨細(xì)胞數(shù)量和活性均下降，易引起骨質(zhì)疏松癥等骨骼疾病，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，但這些患者的角膜并未出現(xiàn)異常。

1.2 Ⅱ型SLRPs

1.2.1

結(jié)構(gòu)及分布 Lumican、keratocan和fibromodulin均屬于Ⅱ型SLRPs，結(jié)構(gòu)包含10個(gè)LRRs和N端特異性絲氨酸序列(CXCXCXC)。胚胎發(fā)育階段及剛出生時(shí)，lumican和keratocan在角膜基質(zhì)層中分布均勻，fibromodulin主要分布在角膜表面和基質(zhì)層后部；成熟角膜中，lumican的表達(dá)被限制在角膜基質(zhì)層后部，而keratocan仍均勻分布于角膜基質(zhì)層，fibromodulin在基質(zhì)層中的表達(dá)減少，定位于角膜緣。

1.2.2

生物活性 Lumican在維持角膜透明等方面發(fā)揮重要作用。Chakravarti等對lumican缺失模型小鼠的角膜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)模型小鼠出生后透明角膜逐漸變混濁。Lumican缺失引起的膠原纖維直徑增大、排列紊亂等不良效應(yīng)主要局限在基質(zhì)層后部，這與角膜發(fā)育成熟過程中l(wèi)umican由均勻分布在角膜基質(zhì)層中逐漸變?yōu)閮H分布在基質(zhì)層后部相一致。進(jìn)一步對lumican缺失模型小鼠的角膜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，lumican可通過改變自身表達(dá)模式使其僅在基質(zhì)層后部表達(dá)，從而把lumican缺失引起的小鼠角膜混濁限制于基質(zhì)層后部；同時(shí)，通過移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至lumican缺失模型小鼠角膜基質(zhì)層后，角膜基質(zhì)層lumican表達(dá)增加，基質(zhì)層膠原纖維直徑變小、形態(tài)變規(guī)則，膠原纖維有序排列，角膜透明度有所恢復(fù)。此外，發(fā)育成熟過程中l(wèi)umican的GAG側(cè)鏈在酶催化下發(fā)生硫酸化，以促進(jìn)角膜透明性的形成。

在發(fā)育和成體階段，keratocan缺失可引起角膜基質(zhì)層變薄、基質(zhì)膠原纖維直徑輕度增大，可能與扁平角膜的發(fā)生有關(guān)，但其未對角膜透明性造成明顯影響。此外，在成年小鼠角膜中，keratocan僅在角膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，因此keratocan可以作為角膜基質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，用于角膜基質(zhì)的組織特異性啟動子等遺傳靶點(diǎn)的操控。Fibromodulin與lumican有50%氨基酸序列相同，可與lumican競爭結(jié)合Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)膠原纖維的成熟。Fibromodulin缺失可能會影響角鞏膜整合，但未對角膜透明性造成明顯影響。

Lumican與SLRPs其他家族成員間存在多種相互作用。Lumican與decorin以及biglycan間均存在協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)角膜膠原纖維結(jié)構(gòu)和空間排列。Lumican與fibromodulin間也存在補(bǔ)償作用。在fibromodulin缺失模型小鼠角膜中l(wèi)umican含量代償性升高；同時(shí)，lumican和fibromodulin均缺失的模型小鼠角膜基質(zhì)膠原纖維缺陷較僅lumican缺失模型小鼠更嚴(yán)重，推測二者還存在協(xié)同作用。人突變

lumican

轉(zhuǎn)基因模型小鼠角膜中biglycan、decorin和keratocan表達(dá)均下降，與圓錐角膜患者角膜中SLRPs的表達(dá)改變相類似，提示

lumican

基因突變可能與圓錐角膜相關(guān)。

1.3 Ⅲ型SLRPs

Osteoglycin屬于Ⅲ型SLRPs，主要定位于角膜上皮細(xì)胞、上皮基質(zhì)膜和基質(zhì)層的角膜基質(zhì)細(xì)胞中，其結(jié)構(gòu)包含6個(gè)LRRs和N端特異性絲氨酸序列(CXCXCXC)。在osteoglycin缺失小鼠的角膜發(fā)育階段，角膜結(jié)構(gòu)并不會出現(xiàn)明顯改變，角膜透明性也未受到明顯影響。Osteoglycin在角膜中的作用較小，但其在血管的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)中發(fā)揮重要作用。Wang等研究發(fā)現(xiàn)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞敲除

osteoglycin

基因后，通過VEGF和VEGF受體2(VEGF receptor 2，VEGFR2)促進(jìn)細(xì)胞的增生和遷移。

2.SLRPs家族調(diào)控角膜膠原纖維正常排列

2.1 SLRPs調(diào)節(jié)角膜膠原纖維間的橫向排列

SLRPs在調(diào)節(jié)角膜膠原纖維間的橫向排列中發(fā)揮重要作用。缺乏SLRPs，尤其是decorin和lumican，將引起膠原纖維直徑增大、形態(tài)不規(guī)則，最終導(dǎo)致角膜透明度降低、混濁等癥狀。角膜膠原纖維橫向排列可分為六邊形網(wǎng)格和無定形網(wǎng)格，對于SLRPs如何調(diào)節(jié)膠原纖維橫向排列的分子機(jī)制仍存在爭議。

2.1.1

SLRPs調(diào)控六邊形網(wǎng)格形成 Sawada等根據(jù)ECM中膠原纖維通過蛋白聚糖鏈與相鄰6條膠原纖維相連等觀察結(jié)果，提出定長的蛋白聚糖鏈可以驅(qū)動膠原纖維形成穩(wěn)定六邊形網(wǎng)格的機(jī)制。具體而言，膠原纖維表面存在的疏水力和靜電力可以驅(qū)動相鄰且平行的膠原纖維聚集形成更粗的纖維，而SLRPs的核心蛋白可以屏蔽這2種力，從而抑制相鄰且平行的膠原纖維聚集形成化學(xué)鍵并形成更粗的纖維，防止角膜混濁。

2.1.2

SLRPs調(diào)控?zé)o定形網(wǎng)格形成 根據(jù)吉布斯-唐南效應(yīng)，SLRPs的GAG側(cè)鏈帶負(fù)電荷，可吸引帶正電荷的離子，使膠原纖維間的離子濃度增加，從而通過滲透作用吸引水分子進(jìn)入膠原纖維間，膠原纖維間過多的水分子會形成壓力，構(gòu)成膠原纖維間的排斥力；與此同時(shí)，連接2個(gè)或多個(gè)膠原纖維的GAG側(cè)鏈?zhǔn)軣狎?qū)動而不能形成完全伸展的構(gòu)象，導(dǎo)致側(cè)鏈的末端緊密附著于膠原纖維上，從而提供膠原纖維間的吸引力；這2種相反的力最終會達(dá)到平衡，形成無定形網(wǎng)格，保證膠原纖維間的有序排列。相鄰膠原纖維間通過蛋白聚糖的結(jié)合是被不斷打破和重建的，該特性使角膜在結(jié)構(gòu)上富于流動性，便于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物在角膜中的運(yùn)輸，并有利于角膜消除由外壓引起的彈性變形。

2.2 SLRPs調(diào)節(jié)膠原纖維間的縱向排列

膠原蛋白組裝形成膠原纖維前先與SLRPs形成復(fù)合物，復(fù)合物組裝形成兩端呈錐形的膠原纖維，膠原纖維表面覆蓋的SLRPs可抑制相鄰纖維間的側(cè)向聚合；由于表面覆蓋SLRPs的數(shù)量隨著膠原纖維直徑的減小而減少，導(dǎo)致纖維尖端的SLRPs數(shù)量較少，甚至沒有，因此膠原纖維易發(fā)生端對端融合，促進(jìn)纖維的縱向生長。此外，隨著基質(zhì)中SLRPs的GAG側(cè)鏈電荷密度增加，端對端融合的概率也會增加，這對形成有序的膠原纖維間環(huán)境起誘導(dǎo)作用，促進(jìn)纖維的延長。

3.SLRPs家族在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中的作用機(jī)制

角膜創(chuàng)傷修復(fù)是一系列動態(tài)級聯(lián)反應(yīng)過程。首先，受損區(qū)的角膜基質(zhì)細(xì)胞迅速凋亡，部分基質(zhì)細(xì)胞壞死。然后，臨近受損區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞增生、遷移，進(jìn)而轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。角膜創(chuàng)傷修復(fù)是由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子在時(shí)間、空間上高度協(xié)調(diào)完成的，其中SLRPs在這一過程中發(fā)揮重要作用。

TGF-β是一種促纖維化細(xì)胞因子，生理狀態(tài)下，僅存在于角膜上皮；角膜損傷后TGF-β被釋放到基質(zhì)層，也可由肌成纖維細(xì)胞合成并分泌，加速炎癥反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)，但后期的過度表達(dá)可導(dǎo)致ECM合成及降解失衡，引起角膜纖維化。相關(guān)研究表明，小鼠角膜損傷后對混濁有著更強(qiáng)的抵抗能力，這是因?yàn)榻悄せ|(zhì)層中decorin的表達(dá)具有種屬差異，相較于兔和人，小鼠角膜中decorin表達(dá)量更高，可以充分結(jié)合并中和TGF-β。通過基因療法或?qū)ecorin包埋入凝膠同樣可促進(jìn)角膜創(chuàng)傷小鼠或兔模型的無瘢痕修復(fù)。此外，decorin還可作為基質(zhì)層成纖維細(xì)胞細(xì)胞膜上表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的配體，與其形成復(fù)合物并通過細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷介導(dǎo)的內(nèi)吞作用降解EGFR，以抑制EGFR信號通路和成纖維細(xì)胞的遷移，從而調(diào)節(jié)角膜的創(chuàng)傷修復(fù)。

Lumican也在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。Lumican是目前唯一已知的在角膜創(chuàng)傷修復(fù)中由角膜上皮細(xì)胞表達(dá)的SLRPs。Lumican缺失模型小鼠角膜傷口愈合變慢，而重組lumican在整合素β1、局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)的介導(dǎo)下，促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞遷移，加速傷口愈合。同時(shí)，在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，lumican被多種基質(zhì)金屬蛋白酶切割產(chǎn)生C端活性產(chǎn)物，該活性產(chǎn)物通過結(jié)合TGF-β受體1促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的增生和遷移。此外，在角膜基質(zhì)層中，lumican可通過激活Fas/Fas配體系統(tǒng)增強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞凋亡，以調(diào)控角膜創(chuàng)傷修復(fù)過程。

4.SLRPs家族在角膜基質(zhì)重塑中的作用機(jī)制

角膜基質(zhì)創(chuàng)傷修復(fù)過程中基質(zhì)細(xì)胞的死亡、促纖維化細(xì)胞因子和炎癥因子的釋放、中性粒細(xì)胞等的招募和ECM降解酶的產(chǎn)生等事件共同導(dǎo)致基質(zhì)重塑。在角膜基質(zhì)重塑的發(fā)生中，SLRPs可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的過程發(fā)揮調(diào)控作用。

在角膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的過程中，會喪失keratocan和lumican等的分泌功能，且肌成纖維細(xì)胞會大量產(chǎn)生含有biglycan、排列紊亂、過度壓縮的異常基質(zhì)，這些異?；|(zhì)沉積在角膜基質(zhì)層中，導(dǎo)致基質(zhì)重塑。由于decorin還可通過與TGF-β形成復(fù)合體或競爭性結(jié)合TGF-β受體，以降低TGF-β的生物利用率，從而抑制瘢痕形成和減輕角膜混濁，因此基因轉(zhuǎn)染過表達(dá)decorin可抑制TGF-β誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和基質(zhì)重塑。

5 小結(jié)與展望

SLRPs作為角膜的重要組成部分，在維持角膜膠原纖維的正常排列、創(chuàng)傷修復(fù)和基質(zhì)重塑等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。SLRPs家族成員間存在補(bǔ)償作用和協(xié)同作用，但是SLRPs家族成員間的相互作用和SLRPs調(diào)節(jié)膠原纖維橫向、縱向排列的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。SLRPs與角膜創(chuàng)傷修復(fù)和基質(zhì)重塑等多種病理過程相關(guān)，通過研究以decorin和lumican為代表的SLRPs與表皮細(xì)胞生長因子、TGF-β等細(xì)胞因子及其受體的相互作用、下游信號通路對于深入認(rèn)識角膜相關(guān)疾病具有重要意義，為相關(guān)臨床治療提供理論依據(jù)。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突