霍怡彤，徐柯卉，陸宇婷，馬菱蔓，周長林，杭太俊，宋 敏*

（1中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198；2中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198）

隨著抗生素的濫用，病原菌進(jìn)化速度加快，多重耐藥菌大量出現(xiàn)。近年來，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）被認(rèn)為是現(xiàn)有抗生素最有潛力的替代品，與傳統(tǒng)抗生素相比，AMPs 具有相對分子質(zhì)量小、抗菌機(jī)制廣、熱穩(wěn)定性好、毒性低等優(yōu)點。由于其獨特的抗菌機(jī)制和多樣的生物活性，AMPs的研究和應(yīng)用已成為生物制藥領(lǐng)域的熱點［1-2］。

Cbf-14 是一種由14 個氨基酸組成的陽離子抗菌肽，是根據(jù)天然抗菌肽cathelicidin-BF（BF-30）的序列利用生物信息學(xué)設(shè)計獲得的多肽突變體［3-5］。其氨基酸序列為Arg-Leu-Leu-Arg-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val（RLLRKFFRKLKKSV），相對分子質(zhì)量為1 819.33，等電點為12.31。Cbf-14具有抵抗耐藥病原菌感染的作用，還可用于治療真菌感染［5-6］。獲得批準(zhǔn)的專利制劑Cbf-14凝膠用于術(shù)后創(chuàng)面的護(hù)理及皮膚消毒處理，具有優(yōu)異的殺菌活性，且無毒、無刺激。多肽藥物的穩(wěn)定性一直是備受關(guān)注的問題，其中的有關(guān)物質(zhì)可能產(chǎn)生不良反應(yīng)甚至毒性，因此Cbf-14 凝膠整個生產(chǎn)過程中的雜質(zhì)譜研究至關(guān)重要［7-10］。

本研究采用液相色譜-高分辨率質(zhì)譜（LCHRMS）聯(lián)用技術(shù)，分離和鑒定Cbf-14 凝膠中的肽類有關(guān)物質(zhì)，共鑒定出5個制劑生產(chǎn)工藝雜質(zhì)和19個強(qiáng)制降解產(chǎn)物，以上24個雜質(zhì)均未見文獻(xiàn)報道。結(jié)合母離子及碎片離子的相對分子質(zhì)量和元素組成分析，本研究闡明了以上雜質(zhì)的來源和形成機(jī)制，為Cbf-14 凝膠中的有關(guān)物質(zhì)檢查和質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

抗菌肽Cbf-14醋酸凍干粉（純度≥99%，南京金斯瑞生物科技有限公司，批號：C660QFK300-1/20110501-DG01），甘油、甲基纖維素（上海阿拉丁試劑有限公司）；甲酸銨、甲酸（AR 級，南京化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC 級，德國默克公司）；去離子水（市售娃哈哈純凈水）。

1.2 儀 器

島津LCMS-9030四極桿飛行時間質(zhì)譜儀、Lab-Solutions 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（日本島津公司）；BS21S 分析天平（德國Sartorius公司）。

2 方 法

2.1 液相色譜條件

Agilent Zorbax SB-Phenyl 色譜柱（150 mm ×4.6 mm，3.5 μm）；流動相A 相為20 mmol/L 甲酸銨緩沖溶液（用甲酸調(diào)節(jié)pH至3.0），B相為乙腈，線性梯度洗脫（A∶B）：0 min（95∶5）→30 min（80∶20）→50 min（40∶60）→52 min（95∶5）→60 min（95∶5），流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

高分辨Q-TOF/MS 測定，NaI 溶液（400 μg/mL）準(zhǔn)確質(zhì)量校正。電噴霧正離子化，噴霧電壓4.0 kV，霧化氣壓力230 kPa，流量3 L/min，接口溫度300 ℃，加熱氣流量10 L/min，干燥氣流量10 L/min，氬氣CID 碰撞能量5 ~ 50 eV，掃描范圍m/z 50 ~2 000。

2.3 樣品配制

Cbf-14 凝膠：將 Cbf-14 醋酸凍干粉 20 mg 和甘油100 mg 溶解于無菌純凈水860 mg 中，充分混勻并完全溶解。然后將甲基纖維素20 mg 攪拌加入上述溶液中，溶脹均勻后，離心除去氣泡即得含量為2%的Cbf-14凝膠。

供試品溶液：取Cbf-14 凝膠適量（約相當(dāng)于Cbf-14 10 mg），精密稱定，置10 mL 量瓶中，加水適量，超聲使Cbf-14 凝膠溶解，再以水稀釋至刻度，搖勻，以0. 45μm 水系濾膜過濾，取續(xù)濾液即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的供試品溶液。精密量取上述溶液適量，加流動相定量稀釋，配制0.5 %的自身對照溶液。

2.4 藥物穩(wěn)定性

查閱相關(guān)文獻(xiàn)［11］，本研究對 Cbf-14 凝膠進(jìn)行了酸、堿、氧化、高溫和光照加速破壞，考察Cbf-14凝膠潛在的降解雜質(zhì)。強(qiáng)制降解實驗操作如下：取 Cbf-14 凝膠適量（約相當(dāng)于Cbf-14 10 mg），加1.0 mol/L 鹽酸溶液 1 mL 并于 60 ℃水浴放置 2 h，或加1 mol/L 氫氧化鈉溶液1 mL 并于室溫放置2 h，或加3%過氧化氫溶液1 mL 并于60 ℃水浴放置2 h，或于40 ℃烘箱中放置1 h，或于強(qiáng)光照射（1.62 × 106lx·h，324 W·h/m2，25 ℃）下放置10 d分別處理。酸堿處理溶液放置室溫后分別用同濃度的酸堿溶液中和，高溫干燥樣品和強(qiáng)光照射樣品分別加水適量，振搖使溶解。以上強(qiáng)制降解溶液分別加水稀釋至10 mL，以0.45μm 水系濾膜過濾，取續(xù)濾液作為Cbf-14 質(zhì)量濃度約為1 mg/mL 的強(qiáng)制降解試驗溶液。同時采用空白溶液進(jìn)行平行對照試驗。

3 結(jié) 果

3.1 有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果

對于含有芳香族氨基酸的多肽類物質(zhì)的分析，苯基柱是一種獨特的選擇，因為它具有疏水相互作用和π-π 電子相互作用的雙重分離機(jī)制，使其顯示出與烷基鍵合硅膠固定相不同的特性，可以替代ODS 和C4 分析多肽和蛋白質(zhì)。參考各國藥典中關(guān)于胰島素、醋酸奧曲肽、鮭降鈣素和醋酸亮丙瑞林有關(guān)物質(zhì)的分析方法，離子對色譜法最為常用。但是，這種分離模式不適用于LC-MS 聯(lián)用技術(shù)。本研究開發(fā)了一種使用揮發(fā)性流動相的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，用于在線分離和鑒定Cbf-14 凝膠制劑中的有關(guān)物質(zhì)，并采用多級液相梯度以減少分析時間。

本研究建立了適用于Cbf-14 有關(guān)物質(zhì)分離檢查和MS鑒定的反相HPLC 方法。供試品溶液及其強(qiáng)制降解試驗溶液有關(guān)物質(zhì)的HPLC 檢查結(jié)果見圖1。按保留時間由小到大順序?qū)看笥?.5%的主要有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行識別和編號，共分離并檢出24 個主要有關(guān)物質(zhì)，其中有關(guān)物質(zhì)19~23 為制劑生產(chǎn)工藝雜質(zhì)，有關(guān)物質(zhì)1~18和24為降解產(chǎn)物。

強(qiáng)制降解試驗結(jié)果表明，本品對強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫條件、強(qiáng)光照射均不穩(wěn)定。在酸破壞條件下產(chǎn)生13 個主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)1 ~ 11、15、18，圖1-a）；在堿破壞條件下產(chǎn)生4 個主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)12~14、16，圖1-b）；在氧化破壞條件下產(chǎn)生2個主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)17、24，圖1-c），有關(guān)物質(zhì)24 的含量較大；在高溫條件下產(chǎn)生4個主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)12~14、16，圖1-d）；在光照條件下產(chǎn)生1 個主要降解產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)10，圖1-e）。

Figure 1 Total ion chromatograms of Cbf-14 gel and its stressed test solutionsa:Acid;b:Alkaline;C:Oxidation;D:Pyrolysis;e:Photolysis;f:Cbf-14 gel;g:Cbf-14 API;h:Blank gel;i:0.5%Reference

3.2 Cbf-14質(zhì)譜裂解規(guī)律

使用HPLC-QTOF/MS 對Cbf-14 及其有關(guān)物質(zhì)在ESI+模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜數(shù)據(jù)匯總見表1。Cbf-14 的［M + 3H］3+離子的精確質(zhì)量數(shù)為m/z 607.068 8，與離子式［C86H154N27O16］3+相應(yīng)。Cbf-14的MS/MS二級質(zhì)譜圖見圖2-a，Cbf-14的MS/MS主要特征碎片為 m/z 880.574 7、735.482 7、601.393 4、574.045 9、539.031 7 和 533.356 3。m/z 880.574 7（［C85H148N24O16］2+）是由母離子中性丟失 1 分子胍（CH5N3）形成的；m/z 539.031 7（［C78H138N25O12］3+）歸因于母離子C 端的Ser-Val 殘基的中性丟失，在此基礎(chǔ)上脫去1 分子NH3形成m/z 533.356 3（［C78H135N24O12］3+）；m/z 574.045 9（［C82H145N24O16］3+）是由母離子中性丟失1 分子C4H9N3，表明Cbf-14 分子中存在精氨酸殘基。

3.3 Cbf-14凝膠中工藝雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定

為了研究Cbf-14凝膠制劑的工藝相關(guān)雜質(zhì)，對Cbf-14原料藥和空白凝膠輔料進(jìn)行對比分析，如圖1 所示，原料藥和空白輔料中均未檢出含量大于0.5 %的雜質(zhì)峰，Cbf-14 凝膠在 24.256 min 至31.507 min 處檢出一系列含量在0.5 %左右的雜質(zhì)峰，ESI（+）-QTOF-MS 共提取出 5 個不同的相對分子質(zhì)量，編號為雜質(zhì)19~23，推測以上雜質(zhì)為工藝雜質(zhì)。

Table 1 Related substances in Cbf-14 gel identified by LC-QTOF/MS

（Continued）

Figure 2 Product mass spectra of Cbf-14 gel and impurities 19-24A: Cbf-14 (m/z 607.068 8); B: Impurity 19 (m/z 611.067 4); C: Impurity 20 (m/z 615.739 4); D: Impurity 21 (m/z 621.071 0); E: Impurity 22 (m/z 625.743 0);F:Impurity 23(m/z 631.074 3);G:Impurity 24(m/z 606.723 6)

3.3.1 一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析 采用高分辨QTOF/MS 測定各有關(guān)物質(zhì)的母離子及子離子的相對分子質(zhì)量和元素組成，并與Cbf-14 的質(zhì)譜特征進(jìn)行對比分析，鑒定出各主要有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)19~23的一級質(zhì)譜圖見圖3，質(zhì)譜數(shù)據(jù)匯總見表1。分析一級質(zhì)譜信息，共提取出10 種不同的加合物離子。其中，611.067 2、615.739 5、621.070 9、625.743 0、631.074 3為［M+3H］3+離子，916.100 8、923.109 2、931.106 4、938.114 5、946.111 4為相應(yīng)的［M+2H］2+離子。

ESI（+）-QTOF-MS測得雜質(zhì)19［M+3H］3+的m/z為611.067 2，與分子式C87H151N27O16相應(yīng)，其相對分子質(zhì)量為1 830.183 2，與Cbf-14 相比，其相對分子質(zhì)量增加12，與Cbf-14 分子結(jié)構(gòu)中引入一個亞甲基（CH2==）相應(yīng)。

Figure 3 Mass spectrum of impurities 19-23 in Cbf-14 gel

ESI（+）-QTOF-MS測得雜質(zhì)20［M+3H］3+的m/z為615.739 5，與分子式C88H153N27O16相應(yīng)，其相對分子質(zhì)量為1 844.198 9，與Cbf-14 相比，其相對分子質(zhì)量增加26，與Cbf-14 分子結(jié)構(gòu)中引入一個亞乙基（CH3CH==）相應(yīng)。

ESI（+）-QTOF-MS測得雜質(zhì)21［M+3H］3+的m/z為621.070 9，與分子式C88H153N27O17相應(yīng)，其相對分子質(zhì)量為1 860.193 8，與雜質(zhì)20相比，其相對分子質(zhì)量增加16，與雜質(zhì)20 分子結(jié)構(gòu)中引入一個氧（O）相應(yīng)。

ESI（+）-QTOF-MS測得雜質(zhì)22［M+3H］3+的m/z為625.743 0，與分子式C89H155N27O17相應(yīng)，其相對分子質(zhì)量為1 874.209 4，與雜質(zhì)21相比，其相對分子質(zhì)量增加14，與雜質(zhì)21 分子結(jié)構(gòu)中引入一個亞甲基（-CH2-）相應(yīng)。

ESI（+）-QTOF-MS測得雜質(zhì)23［M+3H］3+的m/z為631.074 3，與分子式C89H155N27O18相應(yīng)，其相對分子質(zhì)量為1 890.204 3，與雜質(zhì)22相比，其相對分子質(zhì)量增加16，與雜質(zhì)22 分子結(jié)構(gòu)中引入一個氧（O）相應(yīng)。

Cbf-14 的分子結(jié)構(gòu)中有8 個伯胺，其中有3 個來自精氨酸胍基、4 個來自賴氨酸氨基、1 個來自N端游離氨基酸。雜質(zhì)19~23的MS/MS主要特征碎片有m/z 1 280.816 9、948.611 0和832.046 4，其中m/z 1 280.816 9（［C62H106N17O12］+）為KFFRKLKKSV碎片離子，m/z 948.611 0（［C48H78N13O7］+）為FFRKLKK碎片離子，m/z 832.046 4（［C80H141N23O15］2+）為LLRKFFRKLKKSV 碎片離子。根據(jù)二級質(zhì)譜分析，所得結(jié)果表明甘油與Cbf-14 發(fā)生反應(yīng)的位點為Cbf-14 的N 端精氨酸。此外，胍基是共軛結(jié)構(gòu)，電子云分布均勻，其反應(yīng)活性遠(yuǎn)低于伯胺。綜上所述，雜質(zhì)19 ~ 23 是甘油與Cbf-14 的N 端游離伯胺縮合形成的N 端亞胺產(chǎn)物，分別為N2-亞甲基-Cbf-14、N2-亞乙基-Cbf-14、N2-（2-羥基亞丙基）-Cbf-14、N2-（3-羥基亞丙基）-Cbf-14 和 N2-（2，3-二羥基亞丙基）-Cbf-14。

3.3.2 二級碎片裂解途徑歸屬 雜質(zhì)19 ~ 23 的MS/MS 二級質(zhì)譜圖見圖2-b~圖2-f，其二級碎片裂解規(guī)律總結(jié)如下：由于Cbf-14 富含賴氨酸和精氨酸，雜質(zhì)19~23 在二級裂解過程中易于丟失中性碎片氨［NH3］、胍［NH==C（NH2）2］和精氨酸殘基［C4N3H8］。雜質(zhì) 19 ~ 23 還易于丟失 C 端的 Val 殘基和Ser-Val 殘基。對于N2-（3-羥基亞丙基）-Cbf-14 和N2-（2，3-二羥基亞丙基）-Cbf-14，由于具有游離羥甲基結(jié)構(gòu)，二者均可以失去1 分子的甲醛。此外，N2-（2，3-二羥基亞丙基）-Cbf-14 的N 端精氨酸胍基上的伯胺可攻擊α-碳形成二氮雜?七元環(huán)，在此基礎(chǔ)上失去1 分子3-氨基-1，2-丙二醇［CH2（OH）CH（OH）CH2NH2］產(chǎn)生特征碎片離子m/z 600.720 1（［C60H149N26O16］3+），進(jìn)一步失去 1 分子碳二亞胺［NH==C==NH］產(chǎn)生特征碎片離子m/z 586.712 8（［C85H147N24O16］3+），N2-（3-羥基亞丙基）-Cbf-14具有上述相同的裂解規(guī)律。

3.4 Cbf-14凝膠中降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

在Cbf-14 凝膠強(qiáng)制降解試驗樣品中還鑒定出了 19 個有關(guān)物質(zhì)。其中雜質(zhì) 1 ~ 11、15、17、18 為Cbf-14 水解產(chǎn)物，雜質(zhì) 12 ~ 14、16 為 Cbf-14 異構(gòu)體，雜質(zhì)24為Cbf-14氧化產(chǎn)物，以上雜質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)匯總見表1。

雜質(zhì)1~11、15、17、18是Cbf-14在酸或氧化條件下肽鍵水解所產(chǎn)生的。根據(jù)二級質(zhì)譜分析，雜質(zhì) 1 是 Cbf-14（1-5），雜質(zhì) 2 是 Cbf-14（7-14），雜質(zhì) 3是 Cbf-14（1-4），雜質(zhì) 4 是 Cbf-14（4-14），雜質(zhì) 5 是Cbf-14（1-3），雜質(zhì) 6 是 Cbf-14（5-14），雜質(zhì) 7 是 Cbf-14（1-6），雜質(zhì) 8 是 Cbf-14（6-14），雜質(zhì) 9 是 Cbf-14（3-14），雜質(zhì)10 是Cbf-14（1-12），雜質(zhì)11 是Cbf-14（1-13），雜質(zhì) 15 是Cbf-14（1-8），雜質(zhì) 17 是 Cbf-14（2-14），雜質(zhì)18是Cbf-14（1-10）。

雜質(zhì)12 ~ 14、16 是Cbf-14 的同分異構(gòu)體。一般來說，多肽分子中存在許多手性中心，常見的消旋化機(jī)制主要有以下兩種類型：直接烯醇化和唑酮（氮雜內(nèi)酯）的形成，它們都是堿催化的消旋化機(jī)制。

雜質(zhì)24（m/z 606.723 6，z = 3）被鑒定為［1-AIMAOPA］Cbf-14，是Cbf-14 的氧化產(chǎn)物。HO·是非常強(qiáng)的氧化劑，在過渡金屬催化的Fenton 或Udenfriend 反應(yīng)條件下在原位生成。原位產(chǎn)生的HO·氧化，要么發(fā)生在氨基的α-碳上，要么在胍基的α-碳上。所得到的α-羥基氨基酸殘基很容易分解，分別產(chǎn)生谷氨酸半醛和氨基己二酸半醛［12-13］。由于雜質(zhì)24與API相對分子質(zhì)量相差1，結(jié)合其碎片信息和Cbf-14 結(jié)構(gòu)特征，推測雜質(zhì)24 為Cbf-14 N 端游離氨基的α-C 上發(fā)生氧化所得的α-羥基氨基酸脫去1 分子的游離氨，產(chǎn)生的2-氧代精氨酸。形成機(jī)制見圖4。

雜質(zhì)24 的MS/MS 二級質(zhì)譜圖見圖2-g，其主要特征碎片為 m/z 600.720 5、586.713 3、573.701 0、538.686 6 和 533.012 0。［1-AIMAOPA］Cbf-14 的 N端精氨酸胍基上的伯胺可攻擊α-碳形成二氮雜卓七元環(huán)，在此基礎(chǔ)上失去1分子H2O產(chǎn)生特征碎片離子m/z 600.720 5（［C60H149N26O16］3+），進(jìn)一步失去1分子碳二亞胺［NH==C==NH］產(chǎn)生特征碎片離子m/z 586.713 3（［C85H147N24O16］3+）。 m/z 573.701 0（［C81H142N25O16］3+）是由母離子C端的Val殘基丟失形成的；m/z 538.686 6（［C78H135N24O13］3+）歸因于母離子C 端的Ser-Val 殘基的中性丟失，在此基礎(chǔ)上脫去1分子NH3形成m/z 533.012 0（［C78H132N23O13］3+）。

Figure 4 Formation mechanisms of aminoadipic semialdehyde,glutamate semialdehyde and 2-oxoarginine

4 討 論

本研究建立了能夠有效檢測和分離Cbf-14 及其有關(guān)物質(zhì)的揮發(fā)性流動相色譜條件，適用于Cbf-14 有關(guān)物質(zhì)的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定。在此條件下，共檢測出24 個有關(guān)物質(zhì)，其中5 個為制劑生產(chǎn)工藝有關(guān)物質(zhì)，19 個為強(qiáng)制降解產(chǎn)物。對Cbf-14 有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)及來源的推測對其生產(chǎn)工藝質(zhì)量控制、評估藥物穩(wěn)定性及制定存儲條件具有一定意義。

本研究建立的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒定出Cbf-14 凝膠制劑生產(chǎn)工藝有關(guān)物質(zhì)19~23 分別為N2-亞甲基-Cbf-14、N2-亞乙基-Cbf-14、N2-（2-羥基亞丙基）-Cbf-14、N2-（3-羥基亞丙基）-Cbf-14 和 N2-（2，3-二羥基亞丙基）-Cbf-14。以上雜質(zhì)為凝膠輔料甘油與原料藥Cbf-14 的N 端游離氨基縮合形成的N端亞胺產(chǎn)物，提示可能存在的原輔料相互作用。

強(qiáng)制降解試驗表明，Cbf-14凝膠在酸性條件下易發(fā)生肽鍵水解產(chǎn)生特征有關(guān)物質(zhì)1~11、15、18，在堿性條件或高溫條件下易消旋異構(gòu)產(chǎn)生特征有關(guān)物質(zhì)12~14、16，在氧化條件下易產(chǎn)生水解產(chǎn)物17，并且易發(fā)生α-C 氧化形成脫氨氧代產(chǎn)物（有關(guān)物質(zhì)24）。因此，Cbf-14 凝膠對酸、堿、氧化、高溫及光照均比較敏感。Cbf-14 凝膠的儲藏需密封避光，避酸避堿，盡量冷藏。