劉生鳳 ，張 嵐 ，劉書丞 ，侯臣之 ，徐 鵬 ，狄 斌 **

（1中國藥科大學藥物分析系，南京 210009；2國家禁毒委員會辦公室-中國藥科大學禁毒關鍵技術聯合實驗室，南京 210009；3公安部禁毒情報技術中心，毒品監(jiān)測管控與禁毒關鍵技術公安部重點實驗室，北京 100193）

合成大麻素是最常見的非法制造、販賣及濫用的一類新精神活性物質，主要以電子煙、草藥混合物等形式出現，可作用于中樞神經大麻素受體CB1和/或CB2，因此也被稱為合成大麻素受體激動劑［1-3］。合成大麻素的藥理作用與四氫大麻酚（Δ9-THC，傳統(tǒng)大麻毒品的主要有效成分）相似，然而濫用合成大麻素更易產生嚴重的不良反應，包括癲癇發(fā)作、胃腸道反應、心臟毒性甚至死亡等［4-6］。為逃避管制，合成大麻素迅速更新變種，自2008年檢測到第一代萘甲酰吲哚類JWH-018 以來，合成大麻素迄今已發(fā)展至第8 代吲哚/吲唑酰胺類合成大麻素，2021 年7 月起，我國已整類列管合成大麻素以加強立法監(jiān)管［7-8］。

由于合成大麻素進入人體后廣泛代謝，尿液中幾乎無原型，因而針對毒品原型的檢測方法極易導致該類毒品無法被檢出，造成假陰性的結果［9］。在現階段禁毒工作中，亟需通過推斷新型酰胺類合成大麻素的代謝過程確定代謝標志物，為建立尿液和污水等生物樣品中該類毒品的檢驗方法提供依據。雖然許多國內外學者已針對個別合成大麻素體內外代謝情況開展了深入研究，但合成大麻素結構類似、變異迅速，也應該研究合成大麻素類毒品的代謝規(guī)律，給潛在的新型合成大麻素代謝提供一定的參考［10-12］。2020年，蘇格蘭監(jiān)獄和國內案件中相繼出現3 種新型酰胺類合成大麻素N-（1-乙氧基羰基-2-甲基丙基）-1-（5-氟戊基）吲哚-3-甲酰胺（5F-EMB-PICA）、N-（1-氨基-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基）-1-（4-戊烯-1-基）-1H-吲唑-3-甲酰胺（ADB-4en-PINACA）和 2-［1-（4-氟丁基）-1H-吲哚-3-甲酰氨基］-3，3-二甲基丁酸甲酯（4FMDMB-BUTICA），目前國內外對其代謝產物少有研究，各僅有一篇利用斑馬魚或人肝細胞實驗模型研究其代謝產物［13-17］。2016年，1-（4-氰基丁基）-N-（1-甲基-1-苯乙基）-1H-吲唑-3-甲酰胺（4CN-CUMYL-BUTINACA）在土耳其查獲的香草藥中首次被檢測到，目前發(fā)現有濫用的趨勢，然而國內尚未報道關于此物質的代謝研究［18-21］。

人肝微粒體體外溫孵法可以模擬人體代謝過程，目前已應用于醫(yī)藥學領域，具有簡便、快捷等優(yōu)點，在法庭科學領域對新型毒品代謝物的研究方面也具有很好的應用推廣前景。本研究結合人肝微粒體體外溫孵法，借助超高效液相色譜-高分辨質譜聯用技術檢測ADB-4en-PINACA、4CNCUMYL-BUTINACA、5F-EMB-PICA 和 4F-MDMBBUTICA 酰胺類合成大麻素（結構式見圖1）在人肝微粒體中的Ⅰ相代謝物，并推斷其Ⅰ相代謝途徑，總結4種酰胺類合成大麻素代謝規(guī)律，以期對潛在的新型酰胺類合成大麻素代謝研究提供一定的參考，為建立生物樣品中該類物質的檢驗方法提供相關代謝研究數據。

Figure 1 Structures of four amide synthetic cannabinoids4F-MDMB-BUTICA: Methyl (S)-2-(1-(4-fluorobutyl)-1H-indole-3-carboxamido)-3, 3-dimethylbutanoate; 5F-EMB-PICA: N-[[1-(5-fluoropentyl)-1H-indol-3-yl]carbonyl]-L-valine,ethyl ester;4CN-CUMYL-BUTINACA:1-(4-cyanobutyl)-N-(1-methyl-1-phenylethyl)-1H-indazole-3-carboxamide;ADB-4en-PINACA:N-(1-amino-3,3-dimethyl-1-oxobutan-2-yl)-1-(pent-4-en-1-yl)-1H-indazole-3-carboxamide

1 方 法

1.1 試 劑

ADB-4en-PINACA、4CN-CUMYL-BUTINACA、5F-EMB-PICA 和 4F-MDMB-BUTICA 標準品（公安部禁毒情報技術中心提供）。甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；甲酸、濃鹽酸（分析純，南京化學試劑股份有限公司）。男性蒙古人種（混合）人肝微粒體（LM-R-02M）［20 mg/mL，RILD 瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司］；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）（德國Roche Diagnostics GmbH公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；六水合氯化鎂（MgCl2·6H2O）（分析純，西隴化工股份有限公司）；去離子水由實驗室制備。

1.2 儀 器

LC-30AD 超高效液相色譜串聯9030 四極桿-飛行時間質譜聯用儀（日本Shimadzu 公司）；Auto Science MTN-2800D氮吹儀（天津Auto Science儀器有限公司）；D34135R 低溫冷凍離心機（瑞士Bio Tool公司）；實驗室超純水系統(tǒng)（南京妙之儀電子科技有限公司）；XPR10 百萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 分析條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm），柱溫40 ℃；流量0.3 mL/min；進樣量10μL；檢測波長254 nm。流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為乙腈；梯度洗脫程序如下（A∶B）：0 min（90∶10）→1 min（90∶10）→17 min（30∶70）→22 min（0∶100）→23 min（0∶100）→23.1 min（90∶10）→26 min（90∶10）。

ESI 電噴霧離子源；正離子模式；毛細管電壓為3.5 kV；霧化器氣體（N2）流速為3 L/min；加熱氣體（N2）流速為10 L/min；干燥氣體（N2）流速為10 L/min；接口溫度為300 ℃；DL 溫度為250 ℃；加熱塊溫度為400 ℃。各待測物通過正離子全掃描模式，掃描范圍：100~1 000 m/z；進一步選取特定質荷比（m/z）的離子作為目標物進行二級子離子掃描，碰撞能量為10~40 eV。

1.4 體外人肝微粒體孵育條件

孵育體系總體積200μL，包含50 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液（pH 7.4），6 mmol/L MgCl2，1 mg/mL肝微粒體，10 μg/mL 合成大麻素（除ADB-4en-PINACA 質量濃度為5μg/mL），溫孵體系中有機溶劑的含量小于總體積的1%，以保證混合人肝微粒體蛋白酶的活性（n = 3）。于37 ℃、150 r/min 預孵育5 min，加入NADPH溶液（終濃度0.50 mmol/L）啟動反應，分別于10 min、60 min、3 h加入等體積冰乙腈200μL終止反應，劇烈振蕩5 min。將混合人肝微粒體體外溫孵所得混合溶液在4 ℃、13 000 r/min條件下離心 10 min，取上清液 300 μL 在 40 ℃條件下用N2吹干。再用0.1%甲酸水-乙腈溶液（50∶50）120 μL 復溶，渦旋振蕩5 min，復溶溶液在4 ℃、13 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液立即進樣分析，采用Lab Solution 工作站對樣品進行數據采集并分析。

將空白溶劑和未加底物的孵育反應系統(tǒng)溶液作為陰性對照1 和2 同時進行分析；同時將加入高溫滅活的人肝微粒蛋白的反應體系（37 ℃，搖床振蕩3 h）作為陰性對照3 以確證底物孵育過程中沒有產生降解。

2 結 果

2.1 4種酰胺類合成大麻素代謝率分析

5F-EMB-PICA、ADB-4en-PINACA、4CN-CUMYL-BUTINACA 和 4F-MDMB-BUTICA 對 照 品 的液相色譜保留時間分別為16.07、14.29、15.33 和15.33 min。圖2 匯總了4 種合成大麻素液相色譜圖，其中每張小圖均疊加了陰性對照和人肝微粒體孵育10 min、60 min、3 h 的液相色譜圖（其中底物已用紅色方框標記）。從圖2 可以得出，人肝微粒體孵育后底物色譜峰明顯下降，且產生了一些新的色譜峰相對于陰性對照，說明4種酰胺類合成大麻素發(fā)生了代謝，從而可進一步篩選并鑒定可能的代謝產物。

以陰性對照（0 min）中底物色譜峰峰面積為參照，分別用 10 min、60 min、3 h 的底物峰面積與之相比計算底物剩余百分比（n=3，圖3）。60 min 時ADB-4en-PINACA、5F-EMB-PICA、4CN-CUMYLBUTINACA 和4F-MDMB-BUTICA 底物剩余百分比均小于50%，分別為42.68%、1.98%、17.14%和25.94%；3 h 時 ADB-4en-PINACA、5F-EMB-PICA、4CN-CUMYL-BUTINACA 和 4F-MDMB-BUTICA 底物剩余百分比均小于20%，分別為19.13%、0.59%、13.25%和12.36%。結果顯示，4種合成大麻素在人肝微粒體中穩(wěn)定性較低，代謝迅速，3 h近乎代謝完全。

2.2 4 種酰胺類合成大麻素在人肝微粒體中Ⅰ相代謝分析

Figure 2 HPLC chromatograms of 5F-EMP-PICA(A),ADB-4en-PINACA(B),4CN-CUMYL-BUTINACA(C),and 4F-MDMB-BUTICA(D)1:Negative control;2:Incubated for 10 min;3:Incubated for 60 min;4:Incubated for 3 h

Figure 3 Residual percentage of the four amide synthetic cannabinoids after treatment with human liver microsomes(,n = 3)

2.2.1 5F-EMB-PICA 5F-EMB-PICA 在人肝微粒體實驗模型中初步鑒定出14 種Ⅰ相體外代謝物，圖4 是14 種代謝物的提取離子色譜圖，代謝產物信息列于表1（代謝產物標記為M），其中M1-2和M7 在3 h 沒有檢出，但在10 min 有檢出，因此也列入了表1。圖5 為人肝微粒體中5F-EMB-PICA 及其主要代謝物的二級質譜圖。

從代謝物的提取離子色譜圖峰面積初步推斷，5F-EMB-PICA 主要Ⅰ相代謝產物為酯水解代謝產物（M3）、酯水解合并吲哚環(huán)羥化代謝產物（M4-2）和酰胺水解代謝產物（M10），羥基化代謝反應優(yōu)先發(fā)生在吲哚環(huán)和氟戊烷側鏈上。根據原型化合物及代謝產物的質譜裂解信息，推測5F-EMBPICA的代謝途徑示于圖6。

2.2.2 ADB-4en-PINACA ADB-4en-PINACA 在人肝微粒體實驗模型中初步鑒定出12種Ⅰ相體外代謝物，圖7 是12 種代謝物的提取離子色譜圖，代謝產物信息列于表2。圖8 為人肝微粒體中ADB-4en-PINACA及其主要代謝物的二級質譜圖。

從代謝物的提取離子色譜圖峰面積初步推斷，ADB-4en-PINACA 主要Ⅰ相代謝產物為雙鍵氧化成鄰二醇代謝產物（M3）、戊烯側鏈單羥基化代謝產物（M1-1）和吲唑環(huán)單羥基化代謝產物（M1-2）。根據原型化合物及代謝產物的質譜裂解信息，推測ADB-4en-PINACA 可能的代謝途徑示于圖9。

2.2.3 4CN-CUMYL-BUTINACA 4CN-CUMYLBUTINACA 在人肝微粒體實驗模型中初步鑒定出14 種Ⅰ相體外代謝物，圖10 是14 種代謝物的提取離子色譜圖，代謝產物信息列于表3，其中M2-2 在10 min有檢出，因此也列入了表3。圖11為人肝微粒體中4CN-CUMYL-BUTINACA 及其主要代謝物的二級質譜圖。

Figure 4 Combined extracted ion chromatograms of 5F-EMB-PICA's metabolites identified in human liver microsomes

Table 1 Phase I metabolites of 5F-EMB-PICA

從代謝物的提取離子色譜圖峰面積初步推斷，4CN-CUMYL-BUTINACA 主要的Ⅰ相代謝產物為氧化脫氰羧基化代謝產物（M9）、氰基丁基側鏈單羥基化代謝產物（M1-2）和1-甲基-苯乙基單羥基化代謝產物（M1-1）。根據原型化合物及代謝產物的質譜裂解信息，推測4CN-CUMYL-BUTINACA可能的代謝途徑示于圖12。

2.2.4 4F-MDMB-BUTICA 4F-MDMB-BUTICA在人肝微粒體實驗模型中初步鑒定出21種Ⅰ相體外代謝物，圖13 是21 種代謝物的提取離子色譜圖，代謝產物信息列于表4，其中M2、M3-1 和M3-2在10 min有檢出，因此也列入了表4。圖14為人肝微粒體中4F-MDMB-BUTICA 及其主要代謝物的二級質譜圖。

從代謝物的提取離子色譜圖峰面積初步推斷，4F-MDMB-BUTICA 主要的Ⅰ相代謝產物為酯水解代謝產物（M7）、N-脫烷基代謝產物（M14）和酯水解合并脫氫代謝產物（M9），且羥基化代謝反應優(yōu)先發(fā)生在吲哚環(huán)上。根據原型化合物及代謝產物的質譜裂解信息，推測4F-MDMB-BUTICA 可能的代謝途徑見圖15。

Figure 5 Mass spectrum and fragmentation information of 5F-EMB-PICA and its main metabolites in human liver microsomesA:5F-EMB-PICA;B:Ester hydrolysis metabolite(M3);C:Ester hydrolysis and hydroxylation metabolite(M4-2);D:Ester hydrolysis,oxidative defluorination and hydroxylation metabolite(M5);E:Ester hydrolysis and dehydrogenation metabolite(M6);F:Amide hydrolysis metabolite(M10)

Figure 6 Metabolic pathways of 5F-EMB-PICA in human liver microsomes

Figure 7 Combined extracted ion chromatograms of ADB-4en-PINACA's metabolites identified in human liver microsomes

Table 2 Phase Ⅰmetabolites of ADB-4en-PINACA

3 討 論

3.1 體外人肝微粒體孵育底物濃度優(yōu)化

在人肝微粒體蛋白質量濃度為1 mg/mL，孵育時間為60 min條件下，分別考察了3種酰胺類合成大麻素質量濃度（1，5，10 μg/mL）對其代謝的影響，結果見圖16。

結果顯示，除ADB-4en-PINACA 濃度為10μg/mL 時，底物剩余百分比為64.8%，其余均小于25%。在不顯著影響代謝率的情況下，當底物濃度選擇更高時，潛在的代謝物的響應也會更高，更容易被檢出。基于以上考慮，本研究酰胺類合成大麻素的孵育質量濃度選擇為10 μg/mL（除ADB-4en-PINACA質量濃度為5μg/mL）。

3.2 4種酰胺類合成大麻素代謝規(guī)律

Figure 8 Mass spectrum and fragmentation information of ADB-4en-PINACA and its main metabolites in human liver microsomesA: ADB-4en-PINACA; B: Hydroxylation metabolite (M1-1); C: Hydroxylation metabolite (M1-2); D: Dihydroxylation metabolite (M2); E: Dihydrodiol(N-pentenyl tail)metabolite(M3);F:Amide hydrolysis and dihydrodiol(N-pentenyl tail)metabolite(M6)

Figure 9 Metabolic pathways of ADB-4en-PINACA in human liver microsomes

Figure 10 Combined extracted ion chromatograms of 4CN-CUMYL-BUTINACA's metabolites identified in human liver microsomes

Table 3 Phase Ⅰmetabolites of 4CN-CUMYL-BUTINACA

根據表1 ~ 4，匯總統(tǒng)計出4 種酰胺類合成大麻素在人肝微粒體中一共存在27 種Ⅰ相代謝途徑，包括羥基化、羰基化、羧基化、N-脫烷基和酯水解等。首先，從27種代謝途徑發(fā)生的頻率可知，單羥基化、雙羥基化、N-脫烷基、N-脫烷基合并羥基化、酯/酰胺水解、酯水解合并羥基化和酯水解合并脫氫在4 種酰胺類合成大麻素中普遍發(fā)生。羥基化反應位點普遍發(fā)生在烷基側鏈、吲哚/吲唑環(huán)和酰胺N 端，羥基化的目的是使分子極性增大，更有利于體內通過代謝后排出體外，是非常常見的一種代謝方式。其次，根據提取離子色譜圖的峰面積，初步得出4 種酰胺類合成大麻素主要的Ⅰ相代謝途徑為酯水解、雙鍵氧化成鄰二醇、氧化脫氟羧基化、單羥基化和N-脫烷基，其中羥基化代謝反應優(yōu)先發(fā)生在烷基側鏈和吲哚/吲唑環(huán)上。以上4 種酰胺類合成大麻素代謝規(guī)律的總結，希望能給新出現的酰胺類合成大麻素代謝研究提供參考。

3.3 4種酰胺類合成大麻素代謝標志物分析

從代謝物的提取離子色譜圖峰面積得知，ADB-4en-PINACA、5F-EMB-PICA、4CN-CUMYLBUTINACA 和4F-MDMB-BUTICA 的峰度最大代謝產物分別為酯水解、雙鍵氧化成鄰二醇、氧化脫氰羧基化和酯水解代謝產物。在溫孵10 min，60 min和3 h 過程中，4 種合成大麻素對應的峰度最大代謝產物的峰面積均逐漸增大，這與圖3底物剩余百分比逐漸降低結論相對應。綜上，酯水解代謝產物可推薦作為5F-EMB-PICA 和4F-MDMB-BUTICA的代謝標志物，雙鍵氧化成鄰二醇和氧化脫氰羧基化代謝產物可分別推薦作為ADB-4en-PINACA和4CN-CUMYL-BUTINACA的代謝標志物。

Figure 11 Mass spectrum and fragmentation information of 4CN-CUMYL-BUTINACA and its main metabolites in human liver microsomesA: 4CN-CUMYL-BUTINACA; B:Hydroxylation metabolite (M1-1); C: Hydroxylation metabolite (M1-2);D: Dihydroxylation metabolite (M2-1); E: NDealkylation metabolite(M5);F:Oxidative decyanation,hydroxylation and carboxylation metabolite(M9)

Figure 12 Metabolic pathways of 4CN-CUMYL-BUTINACA in human liver microsomes

Figure 13 Combined extracted ion chromatograms of 4F-MDMB-BUTICA's metabolites identified in human liver microsomes

Table 4 Phase I metabolites of 4F-MDMB-BUTICA

Figure 14 Mass spectrum and fragmentation information of 4F-MDMB-BUTICA and its main metabolites in human liver microsomesA: 4F-MDMB-BUTICA; B:Hydroxylation metabolite (M1-1);C: Ester hydrolysis metabolite (M7); D: Ester hydrolysis and dehydrogenation metabolite(M9);E:N-Dealkylation metabolite(M14);F:N-Dealkylation and ester hydrolysis metabolite(M16)

通過分析4 種酰胺類合成大麻素原型及其61種代謝物的結構特點，得出吲唑酰胺類合成大麻素（ADB-4en-PINACA 和 4CN-CUMYL-BUTINACA）具有m/z 145 的骨架結構，其代謝物具有m/z 145 或161（吲唑環(huán)單羥基化）的骨架結構；吲哚酰胺類合成大麻素（5F-EMB-PICA 和4F-MDMB-BUTICA）具有m/z 144 的骨架結構，其代謝物具有m/z 144 或160（吲哚環(huán)單羥基化）的骨架結構。在基層公安實踐中，可通過掃描特征碎片m/z 144、145、160 和161，來初步篩選酰胺類合成大麻素。

4 總 結

本研究應用UHPLC-HRMS技術篩選并初步鑒定了4 種酰胺類合成大麻素在人肝微粒體孵育模型中的61 種Ⅰ相代謝產物，推測了其化學結構及27 種Ⅰ相代謝途徑。該研究結果為新型酰胺類合成大麻素代謝研究提供了參考，為4種酰胺類合成大麻素常規(guī)尿液樣本分析和污水中該類毒品毒情評估提供了潛在的檢測標志物。此外，后續(xù)工作一方面可以制備主要代謝物的標準品，進一步對本研究代謝物的結構進行確證；另一方面，在禁毒實踐中亟需針對合成大麻素類毒品的Ⅱ相代謝及排泄展開研究，為該類毒品的認定及生物檢材中該類毒品檢驗方法的建立提供依據。

Figure 15 Metabolic pathways of 4F-MDMB-BUTICA in human liver microsomes

Figure 16 Residual percentage of substrate after treatment with different concentration of four amide synthetic cannabinoids （,n = 3）