陶怡，楊嘉輝，黃暉，劉家仁，3，胡恭華，3

(1. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 贛南醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與健康管理學(xué)院，江西 贛州 341000；3. 贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000)

氫醌(hydroquinone，HQ)是一種白色晶狀固體，由苯環(huán)和對羥基組成的芳香族化合物，目前，HQ多用于化妝品中的有效增白成分、黑白攝影技術(shù)的顯影劑和橡膠抗氧化劑等。在環(huán)境和職業(yè)暴露中，HQ可經(jīng)皮膚、消化道、呼吸道等途徑被人體吸收，主要經(jīng)肝臟代謝[1]。長期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，HQ具有肝臟毒性[2]。大量的研究發(fā)現(xiàn)，HQ可促進(jìn)機(jī)體自噬水平的增加[3-4]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)HQ可促進(jìn)L02肝細(xì)胞的自噬水平的增加。

自噬(autophagy)是一種依賴于自噬體和溶酶體合作的細(xì)胞分解代謝過程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常的細(xì)胞功能中起著重要作用[5]。研究表明[6]，自噬和DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)之間存在廣泛的相互作用。DNA依賴的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與了DDR過程[7]，并且作為DNA修復(fù)機(jī)制的關(guān)鍵組成部分，控制著對DNA損傷的反應(yīng)，從而有助于維持基因組的完整性[8]。DNA-PK全酶是一個(gè)由催化亞基、DNA-PKcs和Ku70/80異質(zhì)體組成的三聚體復(fù)合物[9]。有研究表明，DNA-PKcs已被確定為輻射誘導(dǎo)自噬的負(fù)調(diào)控因子[10]。雖然目前對DNA-PK的功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了大量的研究，但是對于DNA-PK在自噬中的作用機(jī)制仍不明確。

基于此，本研究將L02肝細(xì)胞作為研究對象，以HQ和DNA-PK抑制劑(NU7026)為受試物，采用CCK-8法、Western blot 實(shí)驗(yàn)和免疫熒光技術(shù)來探討HQ對L02肝細(xì)胞DNA-PK蛋白表達(dá)和亞細(xì)胞定位的影響，并探討在HQ作用下，抑制DNA-PK活性對L02細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、p62和Beclin-1表達(dá)的影響，從而為深入闡明HQ的毒性作用機(jī)制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及受試物 L02肝細(xì)胞由深圳市疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)；DNA-PK抑制劑(5 mM，NU7026，MCE公司)；氫醌，純度≥99.9%，購自美國SIGMA公司。

1.2主要試劑及耗材 牛血清白蛋白(上海生物工程有限公司)；雙抗(青霉素、鏈霉素混合液)購自美國SIGMA公司； DNA-PK抗體(美國Abcam公司)；p62抗體(美國CST公司)；Beclin-1抗體(美國CST公司)；LC3A/B抗體(美國Abcam公司)；BCA蛋白測定試劑盒(北京索萊寶公司)；蛋白酶抑制劑(GLPBIO公司)；抗兔二抗(美國Abcam公司)；抗鼠二抗(美國Abcam公司)；GAPDH抗體(中國Proteintech公司)；1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；脫脂奶粉(中國伊利公司)； CCK-8試劑(Biosharp公司)；PBS緩沖液粉末(ORIGENE公司)；胎牛血清(美國GIBCO公司)。

1.3設(shè)備與儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)；普通雙開門冰箱(格力電器公司)；垂直板電泳機(jī)(美國BIO-RAD公司)；電泳轉(zhuǎn)移槽(美國BIO-RAD公司)； Zeiss LSM 880共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)； AI600化學(xué)發(fā)光成像儀(美國通用公司)；醫(yī)用低溫箱(Panasonic公司)；倒置光學(xué)顯微鏡(德國Laica公司)；普通冰箱(青島海爾公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈安泰公司)；恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) L02肝細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清和青鏈霉素混合液的1640培養(yǎng)基中，置于在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，每天換液1次，當(dāng)L02肝細(xì)胞數(shù)量為85%～95%時(shí)即可傳代處理，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5實(shí)驗(yàn)分組 通過查閱文獻(xiàn)及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)分為：對照組、NU7026組、HQ組、HQ+NU7026組、DMSO組。NU7026處理濃度為10 μM，HQ作用濃度為80 μM，作用時(shí)間均為24 h。

1.6CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，數(shù)量為5000個(gè)/孔，接種于96孔板內(nèi)，37 ℃，5%CO2孵育24 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求處理細(xì)胞，每個(gè)處理組設(shè)置3～5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對照孔及空白對照孔，每孔內(nèi)培養(yǎng)基200 μL。24 h后棄除培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基100微升/孔，加入CCK-8試劑10微升/孔，均勻混勻后放入培養(yǎng)箱孵育1～2 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下各孔的吸光度值。細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)×100%。

1.7Western blot實(shí)驗(yàn) 處理細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總蛋白，用BCA定量法將蛋白定量到20 μg。根據(jù)伯樂快速凝膠試劑盒的說明書比例配制凝膠，每孔上樣20 μg總蛋白后180 V恒壓電泳，經(jīng)PVDF轉(zhuǎn)膜并用5%脫脂奶粉封閉，使用兔抗一抗DNA-PK(1∶2000)，P62(1∶1000)，Beclin 1(1∶1000)、LC3A/B(2 μg/mL)，鼠抗一抗GAPDH(1∶200)，4 ℃孵育過夜。第2天加入抗兔或抗鼠二抗孵育1 h后PBS洗3遍，顯影后用 Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8免疫熒光法 在24孔板中接種5×104個(gè)細(xì)胞做細(xì)胞玻片爬片，至處理時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入500 μL的4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片15 min后用PBS輕柔的漂洗3次，用含0.3% Trion X的5% BSA通透及封閉細(xì)胞爬片1 h，棄封閉液后加一抗4 ℃孵育過夜，加入對應(yīng)的熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗3遍后加DAPI工作液避光浸染5 min，棄去后取爬片置于滴有熒光淬滅劑的載玻片上，最后固定玻片。1周內(nèi)用激光共聚焦顯微鏡觀察，記錄細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1不同濃度HQ對L02肝細(xì)胞DNA-PK蛋白表達(dá)及亞細(xì)胞定位的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0 μM、10 μM、20 μM、40 μM和80 μM HQ作用下L02肝細(xì)胞DNA-PK蛋白的相對灰度值依次為：0.67±0.03、0.72±0.12、0.84±0.15、1.11±0.12、1.08±0.06，其中40 μM和80 μM劑量組DNA-PK的相對灰度值明顯高于0 μM劑量組(P<0.01)；10 μM和20 μM劑量組DNA-PK蛋白的相對灰度值與0 μM劑量組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測HQ作用下DNA-PK蛋白在L02肝細(xì)胞中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位特征。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，在L02細(xì)胞中，DNA-PK主要分布于細(xì)胞核中；隨著HQ作用劑量的增加，DNA-PK在細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，見圖2。

注：與對照組(濃度0 μM)相比，**P<0.01；n=3。

注：DNA-PK蛋白(綠色)；DAPI(藍(lán)色)作為細(xì)胞核復(fù)染劑；Merge(綠色和藍(lán)色圖片的疊加)

2.2不同處理組細(xì)胞存活率的CCK-8檢測結(jié)果 與對照組相比，HQ組和HQ+NU7026組細(xì)胞存活率有明顯降低(P<0.01)。NU7026組和DMSO組細(xì)胞存活率與對照組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。因此，本研究在后續(xù)的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中不設(shè)DMSO溶劑對照。

表1 各處理組對L-02細(xì)胞存活率的影響 (n=4)

2.3不同處理組L02肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 各處理組與對照組相比較在細(xì)胞形態(tài)上均未發(fā)生明顯變化，細(xì)胞呈貼壁生長，細(xì)胞保持多邊形或梭狀形態(tài)，大小一致，排列緊密，邊界較為清楚。HQ組和HQ+NU7026組出現(xiàn)少量因貼壁能力下降而漂浮的細(xì)胞。見圖3。

注：A～E分別代表對照組、NU7026組、HQ組、HQ+NU7026組、DMSO組。

2.4DNA-PK抑制對L02肝細(xì)胞中p62蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、NU7026組、HQ組、NU7026+HQ組L02細(xì)胞中p62蛋白的相對灰度值依次為0.68±0.08、0.95±0.01、0.79±0.02、0.85±0.02。NU7026組和NU7026+HQ組的p62蛋白的相對灰度值與對照組相比較均有升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NU7026+HQ組的p62表達(dá)與HQ組相比較無明顯差異(P>0.05)。見圖4。

注：與對照組相比，**P<0.01；n=3。

2.5DNA-PK抑制對肝細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、NU7026組、HQ組、NU7026+HQ組L02細(xì)胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的相對灰度值依次為：0.88±0.21、1.20±0.19、3.04±0.93、3.50±1.13。其中HQ組、NU7026+HQ組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的相對灰度值明顯高于對照組(P<0.05)；NU7026組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的相對灰度值與對照組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。NU7026+HQ組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)與HQ組相比無明顯差異(P>0.05)，見圖5。

2.6DNA-PK抑制對肝細(xì)胞中Beclin-1蛋白表達(dá)的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、NU7026組、HQ組、NU7026+HQ組L02細(xì)胞中Beclin-1蛋白的相對灰度值依次為0.86±0.09、0.83±0.02、0.87±0.10、0.81±0.03。各處理組Beclin-1蛋白表達(dá)與對照組相比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。NU7026+HQ組的Beclin-1蛋白表達(dá)與HQ組相比較無明顯差異(P>0.05)，見圖6。

3 討論

自噬是一種在真核生物中保守的分解代謝過程。從調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基本代謝功能到各種疾病，如衰老、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和溶酶體疾病等，自噬已成為控制人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)點(diǎn)[11]。目前最常用的自噬相關(guān)標(biāo)志物蛋白主要有Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)和SQSTM1/p62[12]。其中當(dāng)自噬被激活時(shí)，SQSTM1/p62的表達(dá)并不總是減少，有時(shí)會(huì)增加。有研究表明[13]，結(jié)直腸癌細(xì)胞中SQSTM1/p62的表達(dá)被β catenin/TCF4復(fù)合物抑制，該復(fù)合物抑制自噬小體的形成。然而，在淀粉誘導(dǎo)的自噬條件下，因?yàn)棣逻B環(huán)蛋白通過LC3結(jié)合β連環(huán)蛋白的LIR自發(fā)降解，所以SQSTM1/p62的表達(dá)顯著增加。

注：與對照組相比，*P<0.05；n=3。

注：n=3。

自噬在不同的DDR通路中起著重要的作用[14]。DNA-PK是調(diào)節(jié)DDR的激酶之一，有研究[15]發(fā)現(xiàn)DNA-PK也參與自噬的調(diào)控。例如，香蘭素衍生物溴霉素對DNA-PKcs的抑制作用，通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡和自噬，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗增殖作用。也有實(shí)驗(yàn)[16]使用人惡性膠質(zhì)瘤M059J和M059K細(xì)胞來研究DNA-PK在IR誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬細(xì)胞死亡中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺乏DNA-PKcs的M059J細(xì)胞中，低劑量的IR誘導(dǎo)了大量的自噬細(xì)胞死亡。但是目前國內(nèi)外對于DNA-PK在肝細(xì)胞中自噬的研究很少，其中的調(diào)控機(jī)制還尚不明確。

為了探討HQ對肝細(xì)胞DNA-PK表達(dá)的影響，并明確DNA-PK是否會(huì)影響肝細(xì)胞中HQ誘導(dǎo)的自噬過程，本研究采用了CCK-8、蛋白質(zhì)印跡和細(xì)胞免疫熒光的方法檢測不同濃度HQ作用下肝細(xì)胞DNA-PK的表達(dá)水平，以及DNA-PK抑制對HQ作用條件下自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMSO溶劑對照組和NU7026組細(xì)胞存活率與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，DMSO溶劑對NU7026組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有明顯影響。不同HQ濃度處理的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，在40 μM和80 μM HQ作用下，DNA-PK的表達(dá)較對照組明顯增加，這表明DNA-PK可能參與HQ所致L02細(xì)胞的DDR過程。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，不同濃度HQ處理下的DNA-PK蛋白的熒光強(qiáng)度表達(dá)與蛋白質(zhì)印跡結(jié)果基本相符。不同處理組的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，NU7026組的p62蛋白表達(dá)明顯增加，但Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)無顯著差異；HQ組的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)明顯增加，p62和Beclin-1表達(dá)無顯著差異；NU7026+HQ組的p62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)明顯增加。以上結(jié)果提示：HQ誘導(dǎo)的肝細(xì)胞自噬可以促進(jìn)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)變；出現(xiàn)p62和LC3均升高的原因可能是L02肝細(xì)胞在HQ作用下LC3蛋白降解了β-連環(huán)蛋白/轉(zhuǎn)錄因子4復(fù)合體，從而導(dǎo)致了p62表達(dá)的升高并且促進(jìn)了自噬小體的生成；DNA-PK可能會(huì)通過影響p62的表達(dá)而在肝細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮作用。但是與HQ組相比，NU7026+HQ組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p62表達(dá)均無顯著差異，這表明DNA-PK抑制劑(NU7026)在HQ誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞自噬中的影響不大，究其原因可能是DNA-PK在HQ誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞自噬中的作用并不是通過p62/Keap1/Nrf2這一信號(hào)通路[6]來調(diào)節(jié)的，更具體詳細(xì)的原因需要在以后的研究中進(jìn)行探索與驗(yàn)證。