楊美豐，紀(jì)坤發(fā)，何 瑛，楊愛君

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 511356

0 引言

牛乳含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素以及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，不但可以很好地維持人體的健康水平，而且在預(yù)防各種慢性疾病方面也有一定地食療作用[1，2]，深受消費(fèi)者的喜愛。

但牛乳的質(zhì)量安全問題也一直是消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)。一般情況下，牛乳中會(huì)含有微量的亞硝酸鹽，其可被人體正常代謝而不會(huì)產(chǎn)生傷害。但在奶牛場(chǎng)水質(zhì)、飼料、環(huán)境受到污染的情況下，牛乳中的亞硝酸鹽含量會(huì)出現(xiàn)超標(biāo)問題。超標(biāo)的亞硝酸鹽可能會(huì)使人體內(nèi)的血紅蛋白發(fā)生異常而損害人體健康，甚至?xí)隗w內(nèi)轉(zhuǎn)換成致癌性的亞硝胺[3]。因此，牛乳中亞硝酸鹽含量的準(zhǔn)確檢測(cè)極其重要。

本試驗(yàn)通過《GB 5009.33—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》[1]中的第二法分光光度法對(duì)乳中亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，并參照《JJF 1059.1—2012 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[4]和《CNAS-CL006-2019 化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[5]的要求對(duì)試驗(yàn)過程中的不確定度進(jìn)行分析，得到試驗(yàn)過程中測(cè)量不確定度的主要來源，為日常檢測(cè)牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度評(píng)定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 樣品

生乳：來自廣東、福建、甘肅等地的奶牛場(chǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

亞硝酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（200 μg/mL），北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；亞鐵氰化鉀溶液（150 g/L)、乙酸鋅溶液（220 g/L）、飽和硼砂溶液（50 g/L）、鹽酸（20%），廣州化學(xué)試劑廠；對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為一級(jí)水。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（40 mg/L）：吸取10 mL亞硝酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50 mL容量瓶，用水定容，混勻后放于4 ℃避光保存。

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5 mg/L）：吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液3.125 mL于25 mL容量瓶，用水定容，搖勻。

1.1.4 儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800)，島津中國(guó)；冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；電磁爐，九陽股份有限公司；振蕩水浴箱，德國(guó)Julabo公司；電冰箱，西門子公司；超純水系統(tǒng)，德國(guó)Millipore公司；移液器、容量瓶，德國(guó)Brand公司；渦旋振蕩器，廣州海太公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

吸取樣品18 mL放于50 mL離心管，加入飽和硼砂溶液2.5 mL，渦旋振蕩器混勻后再加入70 ℃左右的水12 mL，繼續(xù)混勻后在95 ℃水中加熱15 min，取出放置至室溫后加入亞鐵氰化鉀溶液1 mL，搖勻，再加入乙酸鋅溶液1 mL，搖勻，以沉淀蛋白質(zhì)，最后加5.5 mL水定容至40 mL。放置沉淀2 h后離心（9 000 r/min，3 min），過濾，濾液備用。

1.2.2 測(cè)定

吸取4 mL樣品于10 mL比色管，另外吸取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150μL、180 μL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL比色管，相當(dāng)于0.075 μg、0.15 μg、0.3 μg、0.45 μg、0.6 μg、0.75 μg、0.9 μg亞硝酸鈉，加入對(duì)氨基苯磺酸溶液0.6 mL，在渦旋振蕩器上混勻后靜置3～5 min，再加入鹽酸萘乙二胺溶液0.3 mL，加水定容至10 mL刻度線，再次搖勻勻，靜置15 min用零號(hào)管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于538 nm的波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較，同時(shí)做試劑空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型和測(cè)量不確定度來源分析

2.1.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)GB 5009.33—2016[6]中的第二法分光度度法計(jì)算亞硝酸鹽（以NaNa2計(jì)）含量的公式，可得出評(píng)定牛乳中亞硝酸鈉含量的測(cè)量不確定度的數(shù)學(xué)模型為:

公式中：X為樣品中亞硝酸鈉含量，mg/kg；C為曲線得出亞硝酸鹽的濃度，mg/L；m為樣品質(zhì)量（18 mL×ρ樣品），g；V0-試樣處理液總體積，40 mL；V1-測(cè)定樣液定容體積，10 mL；V2-測(cè)定樣液體積，4 mL；1000為換算系數(shù)。

2.1.2 測(cè)量不確定度來源分析

根據(jù)亞硝酸鹽含量的檢測(cè)步驟及輸入量的函數(shù)關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，測(cè)量不確定度分量主要來源為：（1）紫外分光光度計(jì)引入的不確定度；（2）取樣量引入的不確定度；（3）試樣處理液總體積引入的不確定度；（4）測(cè)定樣液定容體積引入的不確定度；（5）測(cè)定樣液體積引入的不確定度；（6）制備標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的不確定度；（7）樣品重復(fù)性引入的不確定度。

亞硝酸鹽含量的測(cè)量不確定度分類見表1和不確定度因果關(guān)系見圖1。

表1 亞硝酸鹽含量的測(cè)量不確定度來源及分類

圖1 測(cè)量不確定因果關(guān)系圖

2.2 亞硝酸鹽含量測(cè)量不確定度分量的量化

2.2.1 紫外可見分光光度計(jì)影響因子的不確定度

樣品經(jīng)前處理提取離心定容后，使用紫外可見分光光度計(jì)在538 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所用儀器的的穩(wěn)定性、靈敏度等會(huì)影響測(cè)量結(jié)果的不確定度，根據(jù)紫外可見分光光度計(jì)校準(zhǔn)證書（校準(zhǔn)證書編號(hào)NW202105138）中給出U=0.4 nm，k=2，可以計(jì)算出儀器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u為：

將紫外可見分光光度計(jì)影響因子分量轉(zhuǎn)化為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urelnm()為：

2.2.2 吸樣量的不確定度

由制造商提供的10 mL可調(diào)移液器校準(zhǔn)證書（校準(zhǔn)證書編號(hào)BSH-CL-2020080029-5）中標(biāo)明其容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度（k=2）為5 μL，因此10 mL可調(diào)移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

18 mL的樣品分兩次吸取，即吸樣量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 試樣處理液總體積的不確定度

吸取樣品18 mL放于50 mL離心管，加入飽和硼砂溶液2.5 mL，渦旋振蕩器混勻后再加入70 ℃左右的水12 mL，繼續(xù)混勻后在95 ℃水中加熱15 min，取出放置至室溫后加入亞鐵氰化鉀溶液1 mL，搖勻，再加入乙酸鋅溶液1 mL，搖勻，以沉淀蛋白質(zhì)，最后加5.5 mL水定容至40 mL。

2.2.3.1 由2.2.2中可知urelm()=0.00039

2.2.3.2 由制造商提供的5 mL可調(diào)移液器校準(zhǔn)證書（校準(zhǔn)證書編號(hào)BSH-CL-2020080029-4）中標(biāo)明其容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度（k=2）為4.3 μL，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

5 mL可調(diào)移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

2.2.3.3 由制造商提供的A級(jí)25 mL分度吸量管校準(zhǔn)證書（校準(zhǔn)證書編BSH-CL-2020070020-1M）中標(biāo)明其容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度（k=2）為0.02 mL，因此25 mL分度吸量管的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

即25 mL分度吸量管相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3.4 由制造商提供的1 mL可調(diào)移液器校準(zhǔn)證書（校準(zhǔn)證書編號(hào)BSH-CL-2020080029-3）標(biāo)明其容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度（k=2）為1.3 μL，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

由于加亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液時(shí)使用了2次1 mL可調(diào)移液器，因此1 mL可調(diào)移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

2.2.3.5 由2.2.2可知10 mL可調(diào)移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=2.5μL ，其引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

2.2.3.6 合成上述五項(xiàng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，可得試樣處理液總體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.4 測(cè)定樣液定容體積的不確定度

①校準(zhǔn)引入的不確定度：根據(jù)《JJG 10—2005 專用玻璃量器檢定規(guī)程》[7]，10 mL比色管容量允許誤差為±0.10 mL，按照矩形分布可得10 mL比色管校準(zhǔn)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

②溫度引入的不確定度：玻璃器皿校準(zhǔn)時(shí)的溫度為20 ℃，而試驗(yàn)室的溫度控制在（20±4）℃之間，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃[8]，玻璃的膨脹系數(shù)忽略不計(jì)，按照矩形分布可得標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

合成上述2項(xiàng)不確定度分量，則測(cè)定樣液定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因此，10 mL比色管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 測(cè)定樣液體積的不確定度

由2.2.3.2中可知5 mL可調(diào)移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u=2.15μL，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

2.2.6 制備標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的不確定度

2.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液引入的不確定度

試驗(yàn)中所用的亞硝酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為200 μg/mL，由北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司提供，GBW（E）100156國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，批號(hào)為84G1，證書上標(biāo)明食品檢測(cè)用亞硝酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)擴(kuò)展不確定度（k=2）為2%，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定為

2.2.6.2 稀釋配制過程容量瓶引入的不確定度

25 mL容量瓶（A級(jí)）和50 mL容量瓶（A級(jí)）引入的不確定度，其有校準(zhǔn)和溫度兩種影響因素

①校準(zhǔn)：由制造商提供的25 mL容量瓶（A級(jí)）和50 mL容量瓶（A級(jí)）校準(zhǔn)證書（校準(zhǔn)證書編號(hào)BSH-CL-2020070020-3）中標(biāo)明其在20 ℃下的擴(kuò)展不確定度（k=2）都為U=0.02 mL，按照矩形分布，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)不確定度

②溫度：根據(jù)證書信息，該容量瓶在20 ℃校準(zhǔn)，而試驗(yàn)室的溫度控制在（20±4）℃之間，根據(jù)JJG 196—2006規(guī)定，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃[8]，按照矩形分布可得25 mL容量瓶和50 mL容量瓶的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

由上述兩種分量可得使用25 mL容量瓶和50 mL容量瓶時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

因此，25 mL容量瓶和50 mL容量瓶的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.2.6.3 稀釋配制過程移液器引入的不確定度

由2.2.2可知10 mL可調(diào)移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u10mL移=2.5μL ，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

由2.2.3.2可得5 mL可調(diào)移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u5mL移=2.15μL ，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

由 制 造 商 提 供 的1 0 0 μ L和2 0 0 μ L可調(diào)移液器校準(zhǔn)證書（校準(zhǔn)證書編號(hào)B S HC L-2 0 2 0 0 8 0 0 2 9-1和校準(zhǔn)證書編號(hào)B S HCL-2020080029-2）標(biāo)明容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果擴(kuò)展不確定度（k=2）分別為0.09 μL和0.40 μL，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

表2 可調(diào)移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.6.4 稀釋配制過程比色管引入的不確定度

由2.2.4可知10 mL比色管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 urelV1()=0.0058

2.2.6.5 配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的不確定度

用10 mL可調(diào)移液器吸取10 mL 200 μg/mL亞硝酸鈉溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于50 mL容量瓶（A級(jí)），用水定容，混勻后可得40 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，則40 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.6.6 配制標(biāo)準(zhǔn)使用液引入的不確定度

用5 mL可調(diào)移液器吸取3.125 mL 200 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶（A級(jí)），用水定容，混勻后可得5 mg/L亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，則5 mg/L亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.6.7 配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度

用100 μL和200 μL可調(diào)移液器分別移取15 μL、30 μL、60 μL、90 μL、120 μL、150 μL、180 μL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL比色管，相當(dāng)于0.0075 mg/L、0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.045 mg/L、0.060 mg/L、0.075 mg/L、0.090 mg/L亞硝酸鈉。則0.0075 mg/L、0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.045 mg/L、0.060 mg/L、0.075 mg/L、0.090 mg/L的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線系列點(diǎn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別見公式1。

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各個(gè)系列點(diǎn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度方根求得，即：

2.2.7 樣品重復(fù)性的不確定度

將同一份生乳樣品做6個(gè)平行樣進(jìn)行重復(fù)性測(cè)定，試驗(yàn)所得回歸方程為y=0.7948x-0.0005，相關(guān)系數(shù)R2為0.99994。計(jì)算出生乳中亞硝酸鈉的平均含量及標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如下表3所示：

表3 乳中亞硝酸鈉的重復(fù)性試驗(yàn)（n=6）

所以重復(fù)性（Rep）引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

該方法測(cè)定牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度來源匯總?cè)绫?所示。

表4 牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度來源匯總

合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

即標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 亞硝酸鹽含量擴(kuò)展不確定度

分光光度法測(cè)定牛乳中亞硝酸鹽含量的擴(kuò)展不確定度，當(dāng)取置信度為95%，包含因子為k=2時(shí)，擴(kuò)展不確定度為

3 結(jié)論

分光光度計(jì)測(cè)定牛乳中亞硝酸鹽含量的測(cè)量不確定度報(bào)告，取置信度為95%，包含因子k=2時(shí)，報(bào)告結(jié)果為

通過此次分光光度法測(cè)定牛乳中亞硝酸鹽含量的不確定度評(píng)定分析可得，檢測(cè)結(jié)果的不確定度來源最主要是標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度，試樣處理液總體積、測(cè)定樣液定容體積和樣品重復(fù)性的影響次之，而儀器影響因子、樣品取樣量和測(cè)定樣液體積帶來的影響與前幾者相比，可以忽略不計(jì)。因此，在使用分光光度計(jì)測(cè)定牛乳中亞硝酸鹽時(shí)，需使用有證標(biāo)準(zhǔn)物，可增加平行樣的測(cè)定次數(shù)，使用精密度更高的玻璃器皿，試驗(yàn)設(shè)備也需要定時(shí)計(jì)量，減少不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。