郭粉娥，李世英，郝乃猛

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 057150)

血管性認知障礙(Vascular cognitive impairment，VCI)是指腦血管疾病及其危險因素所致腦區(qū)低灌注而引發(fā)的認知障礙綜合征，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，若不積極治療，超過1/3的VCI患者將逐漸發(fā)展為血管性癡呆[1]。海馬體是負責(zé)學(xué)習(xí)記憶的腦功能區(qū)，其中海馬體CA1區(qū)是信息整理與轉(zhuǎn)存的關(guān)鍵區(qū)域，并且CA1區(qū)神經(jīng)元對缺血缺氧非常敏感[2-3]。長期血流低灌注導(dǎo)致海馬體神經(jīng)元損傷是VCI的病理基礎(chǔ)，其中氧化應(yīng)激和炎癥損傷是造成海馬體神經(jīng)元損傷的重要原因[4-6]。

中醫(yī)沒有VCI病名的記載，根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸入“癡呆”“呆病”“不慧”“健忘”“善忘”等范疇，其病機在于氣虛血虧、精損髓減或痰瘀。研究報道，活血化瘀治療可明顯改善血管性認知障礙癥狀[7]。藏紅花是我國珍貴中藥材，取其柱頭入藥，可活血化瘀、散郁開結(jié)。藏紅花的主要有效成分為藏紅花素，Nrf2/HO-1是調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路[8-10]。本研究旨在探討藏紅花素對VCI大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及相關(guān)機制，以期為VCI的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：120只清潔級雄性SD大鼠購自河北伊維沃生物科技有限公司[SYXK(冀)2020-002]，體重230～260 g。分籠飼養(yǎng)，室溫23～25 ℃，相對濕度55%～65%。

1.1.2 實驗藥物與試劑：純度≥98%的藏紅花素(批號E190407b)；鹽酸多奈哌齊片(國藥準(zhǔn)字H20030472，規(guī)格：5 mg/片)；注射用硝普鈉(國藥準(zhǔn)字H11021635，規(guī)格：50 mg/瓶，批號201126)。末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶切口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒(批號20210519)；丙二醛(MDA)試劑盒(批號BC0020)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號BC0170)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號BC1190)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(批號SEKR-0009)；白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒(批號SEKR-0002)；二辛可寧酸(BCA)試劑盒(批號PC0020)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(批號DA1015)；Nrf2抗體(批號bs-1074R)；HO-1抗體(批號bs-23397R)；核因子κB(NF-κB)抗體(批號bs-23217R)；β-actin抗體(批號bs-0061R)；IgG二抗(批號bs-0295G)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模、分組與給藥：隨機選取120只SD大鼠中的100只，參照文獻[11]報道的方法制備VCI大鼠模型。術(shù)前禁食12 h，3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛溶液實施麻醉后取仰臥位，沿頸正中切口鈍性分離兩側(cè)頸總動脈，2.5 mg/kg腹腔注射硝普鈉誘導(dǎo)低血壓，夾閉兩側(cè)頸總動脈10 min后，松開動脈夾恢復(fù)血流10 min，再夾閉兩側(cè)頸總動脈10 min，然后恢復(fù)血流，逐層縫合，手術(shù)過程保持肛溫(37±0.5)℃。將100只VCI模型大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、多奈哌齊組和藏紅花素低、中、高劑量組，每組20只；剩余20只大鼠設(shè)為假手術(shù)組(暴露雙側(cè)頸總動脈但不夾閉)。造模完成后，藏紅花素低、中、高劑量組分別腹腔注射10、20、40 mg/kg[12]藏紅花素，多奈哌齊組腹腔注射0.5 mg/kg[13]多奈哌齊，假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液，各組注射體積均為5 ml/kg，1次/d，療程4周。

1.2.2 學(xué)習(xí)能力和記憶能力評測：①Morris水迷宮定位航行實驗評測大鼠學(xué)習(xí)能力。將平臺裝置于Morris水迷宮第3象限，治療完成后每組隨機取10只大鼠，由第1、2、4象限放入水中并引導(dǎo)大鼠尋到第3象限平臺，5次/d，訓(xùn)練3 d，第4天分別由第1、2、4象限放入水中，記錄每只大鼠尋到第3象限平臺的時間，即逃避潛伏期。②Morris水迷宮空間探索實驗評測大鼠記憶能力。定位航行實驗完成后去掉平臺，將大鼠由第1象限放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)。

1.2.3 海馬體CA1區(qū)病理學(xué)變化和神經(jīng)元凋亡觀察：每組取10只大鼠腦組織，經(jīng)多聚甲醛固定、包埋、切片、脫蠟、透明后，實施HE染色(蘇木精染色5 min，1%伊紅染色2 min)和TUNEL染色，顯微鏡觀察CA1區(qū)病理學(xué)變化和神經(jīng)元凋亡狀況，胞核黃褐色為陽性著色，在400倍顯微鏡下，每張切片取5個視野計數(shù)細胞總數(shù)和凋亡細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)。

1.2.4 海馬體氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子水平檢測：取各組剩余大鼠海馬體，冰上勻漿、裂解后離心取上清，按照試劑盒說明處理后，通過分光光度計檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)[抗氧化酶(SOD、GSH-Px)活力和MDA含量]，通過酶標(biāo)儀檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β水平。

1.2.5 海馬體Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達檢測：取海馬體裂解溶液，4 ℃、12000 r/min離心取上清，BCA法總蛋白定量，SDS-PAGE電泳分離蛋白、濕法轉(zhuǎn)膜、5%蛋白封閉液室溫封閉1 h，4 ℃孵育Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶1000)、NF-κB(1∶800)、β-actin(1∶2000)一抗過夜，室溫孵育二抗(1∶2000)1 h，DAB顯色后計算條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，若方差齊，組間比較行單因素方差分析和LSD-t檢驗；若方差不齊時，組間比較行Kruskal-WallisH和Mann-WhitneyU檢驗；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃逸潛伏期顯著延長(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和多奈哌齊組大鼠逃逸潛伏期顯著縮短(P<0.05)；藏紅花素對VCI大鼠逃逸潛伏期的作用具有劑量依賴性，藏紅花素低、中、高劑量組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與多奈哌齊組比較，藏紅花素高劑量組逃逸潛伏期顯著縮短(P<0.05)。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力比較

與假手術(shù)組比較，模型組穿越平臺次數(shù)顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和多奈哌齊組穿越平臺次數(shù)顯著增多(P<0.05)；藏紅花素對VCI大鼠穿越平臺次數(shù)的作用具有劑量依賴性，藏紅花素低、中、高劑量組組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與多奈哌齊組比較，藏紅花素高劑量組穿越平臺次數(shù)顯著增多(P<0.05)。

2.2 各組大鼠海馬體CA1區(qū)病理學(xué)改變及神經(jīng)元凋亡比較 見圖1、2(表2)。假手術(shù)組海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元未見異常。模型組CA1區(qū)神經(jīng)元由類圓形變?yōu)槿切位虿灰?guī)則多邊形，松散紊亂、無層次感，胞體固縮，凋亡神經(jīng)元數(shù)量增多，凋亡指數(shù)較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，藏紅花素低、中、高劑量組和多奈哌齊組海馬體CA1區(qū)病理學(xué)改變不同程度減輕，凋亡神經(jīng)元數(shù)量不同程度減少，藏紅花素對VCI大鼠CA1區(qū)病變的改善作用和神經(jīng)元凋亡的抑制作用具有劑量依賴性，藏紅花素低、中、高劑量組間凋亡指數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與多奈哌齊組比較，藏紅花素高劑量組凋亡指數(shù)顯著降低(P<0.05)。

A:假手術(shù)組；B:模型組；C:藏紅花素低劑量組；D:藏紅花素中劑量組；E:藏紅花素高劑量組；F:多奈哌齊組

A:假手術(shù)組；B:模型組；C:藏紅花素低劑量組；D:藏紅花素中劑量組；E:藏紅花素高劑量組；F:多奈哌齊組

表2 各組大鼠海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較(%)

2.3 各組大鼠海馬體氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎癥因子水平比較 見表3、4。與假手術(shù)組比較，模型組SOD、GSH-Px活力降低，MDA、TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。與模型組比較，藏紅花素中、高劑量組和多奈哌齊組SOD、GSH-Px活力升高，MDA、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)。與藏紅花素低劑量組比較，藏紅花素中、高劑量組和多奈哌齊組SOD活力升高，MDA、TNF-α水平降低(P<0.05)，藏紅花素高劑量組GSH-Px活力升高(P<0.05)，藏紅花素高劑量組和多奈哌齊組IL-1β水平降低(P<0.05)。與藏紅花素中劑量組比較，藏紅花素高劑量組SOD活力升高，TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)。與多奈哌齊組比較，藏紅花素高劑量組SOD活力升高，MDA、TNF-α水平降低(P<0.05)。

2.4 各組大鼠海馬體Nrf2、HO-1、NF-κB表達比較 見圖3(表5)。與假手術(shù)組比較，模型組Nrf2、HO-1相對表達量降低，NF-κB相對表達量升高(P<0.05)。與模型組比較，藏紅花素低、中、高劑量組和多奈哌齊組Nrf2、HO-1相對表達量升高，NF-κB相對表達量降低(P<0.05)。藏紅花素對VCI大鼠海馬體Nrf2、HO-1、NF-κB表達的影響具有劑量依賴性，藏紅花素低、中、高劑量組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與多奈哌齊組比較，藏紅花素高劑量組Nrf2、HO-1相對表達量升高，NF-κB相對表達量降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠海馬體氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較

表4 各組大鼠海馬體炎癥因子水平比較

A：假手術(shù)組；B：模型組；C：藏紅花素低劑量組；

表5 各組大鼠海馬體Nrf2、HO-1、NF-κB表達比較

3 討 論

藏紅花是《中國藥典》收錄的中藥之一，其主要有效成分藏紅花素具有抗氧化、抗炎等藥理學(xué)作用[14-15]。多奈哌齊是臨床治療VCI的一線用藥，也是VCI動物實驗研究的常用陽性對照藥物[16-17]。本研究采用反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動脈的方法建立VCI動物模型，發(fā)現(xiàn)VCI模型大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力明顯下降，海馬體CA1區(qū)呈現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量減少、松散紊亂、形態(tài)不規(guī)則、胞體固縮等病理改變，與楊文強等[11]研究報道一致。經(jīng)藏紅花素或多奈哌齊治療能夠有效改善VCI大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶能力，改善海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元病變，減輕神經(jīng)元凋亡，藏紅花素上述作用呈現(xiàn)一定劑量依賴性，并且藏紅花素高劑量上述作用強于多奈哌齊，說明藏紅花素能夠減輕VCI大鼠海馬體CA1區(qū)損傷、改善學(xué)習(xí)能力和記憶能力。

VCI多繼發(fā)于腦血管病及危險因素所引發(fā)的腦血流低灌注，而大腦海馬體CA1區(qū)是對缺血缺氧最敏感的區(qū)域[18]。腦區(qū)持續(xù)血流低灌注導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈斷裂引發(fā)活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)大量生成，SOD、GSH-Px等能夠清除ROS的抗氧化酶被過度消耗，破壞“ROS-抗氧化酶”動態(tài)平衡，ROS過度蓄積可破壞蛋白質(zhì)、DNA、多肽等生物大分子結(jié)構(gòu)而誘導(dǎo)細胞凋亡[19]；并且ROS攻擊破壞細胞膜、線粒體膜，并生成具有生物毒性的MDA，導(dǎo)致VCI后海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元病變持續(xù)加重[20]。此外，腦區(qū)持續(xù)血流低灌注釋放病理性刺激炎癥因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，其中TNF-α、IL-1β具有炎性趨化因子屬性，能夠刺激中性粒細胞等進一步釋放白細胞介素、前列腺素、單核細胞趨化蛋白等加重炎癥反應(yīng)[21]。Nrf2是真核細胞中普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，侯書鵬[22]發(fā)現(xiàn)Nrf2可促抗氧化酶表達，從而降低氧化應(yīng)激損傷。HO-1能夠被Nrf2誘導(dǎo)表達，可促使血紅素分解、還原清除NO，降低氧化應(yīng)激損傷[23]。NF-κB能夠與染色體特定位點結(jié)合誘導(dǎo)炎癥因子TNF-α、IL-1β等表達與釋放，進而加重炎癥損傷[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藏紅花素或多奈哌齊治療能夠明顯提高VCI大鼠海馬體SOD、GSH-Px活力并降低MDA、TNF-α、IL-1β水平，上調(diào)Nrf2、HO-1表達，下調(diào)NF-κB表達，藏紅花素上述作用呈現(xiàn)一定劑量依賴性，并且藏紅花素高劑量對MDA、TNF-α水平，SOD活力及Nrf2、HO-1、NF-κB表達的作用強于多奈哌齊，說明藏紅花素可激活Nrf2/HO-1通路、減輕VCI大鼠海馬體氧化應(yīng)激和炎癥損傷。

綜上，藏紅花素可能通過激活Nrf2/HO-1通路降低海馬體氧化應(yīng)激損傷，對VCI大鼠學(xué)習(xí)記憶能力起到改善作用。但VCI病理機制復(fù)雜，藏紅花素治療VCI的作用機制有待進一步研究。