黨仟仟,周賓賓,曾俊林,曾智鵬,唐 攀,李欣憶
(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)
脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)損傷,可引起永久性的功能障礙,致殘率較高,給患者家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。近年來(lái),SCI的發(fā)病率逐年上升[1-2]。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性,目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)SCI有效的治愈方法。西醫(yī)針對(duì)SCI急性期主要采用手術(shù)減壓、靜脈注射大劑量甲基強(qiáng)的松龍,穩(wěn)定期予抗炎、神經(jīng)保護(hù)藥物,恢復(fù)期主要采用康復(fù)理療等方法[3]。然而,手術(shù)不可控的高風(fēng)險(xiǎn)、藥物療效的爭(zhēng)議不斷、康復(fù)理療的周期漫長(zhǎng)均是SCI治療的難點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),中樞神經(jīng)軸突的表面有一層富含膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘,髓鞘受損后,軸突將暴露在含有神經(jīng)再生抑制因子(MAIF)的髓鞘碎片中,并活化重組人Ras同源物基因(Rho),激活下游Rho蛋白激酶Ⅱ(Rho-associate kinase Ⅱ,RockⅡ)引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組、髓鞘磷酸化,導(dǎo)致生長(zhǎng)錐塌陷,使軸突再生失敗[4]。提高中樞神經(jīng)再生能力的有效策略是阻斷抑制信號(hào)通路,保護(hù)受損神經(jīng)元,防止生長(zhǎng)錐的塌陷而喪失可塑性。
針灸是中醫(yī)學(xué)的重要組成部分,廣泛應(yīng)用于臨床多種疾病的治療和預(yù)防,與藥物比較,針灸具有操作簡(jiǎn)單、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn),針灸具有抗氧化作用,不同形式的針刺治療均能有效促進(jìn)SCI后神經(jīng)功能的恢復(fù)、增強(qiáng)神經(jīng)再生能力[5]。溫針灸結(jié)合了針可通脈、灸可補(bǔ)陽(yáng)的優(yōu)勢(shì),臨床研究證實(shí),溫針灸可以通過(guò)保護(hù)受損的神經(jīng)元、抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)SCI的恢復(fù)[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)溫針灸干預(yù)大鼠SCI模型,檢測(cè)大鼠神經(jīng)再生抑制因子RhoA、RockⅡ的變化,探討溫針灸治療SCI的作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD大鼠40只,體重180~200 g,購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(湘)2019-0014]。本研究所有實(shí)驗(yàn)均在廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成,實(shí)驗(yàn)大鼠在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)房中喂養(yǎng),濕度40%~47%,溫度26 ℃左右,光照10 h黑暗14 h交替,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。
1.2 主要儀器 勻漿機(jī)(T18),低溫離心機(jī)(5418R),Real-time PCR System(Aria Mx),核酸檢測(cè)儀(FC-1100),光學(xué)顯微鏡(BX53),蛋白轉(zhuǎn)印模,電泳儀。
1.3 主要試劑和藥物 RIPA裂解液(R0010),Anti-RhoA(K001649P),Anti-RockⅡ(K008935P),山羊抗兔IgG(ab6721),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MR05101),Universal SYBR qPCR Mix(11201ES03),Tri Quick Reagent(R1100),鹽酸法舒地爾(H20040356),清艾條(Z32020253),1%戊巴比妥鈉(F20020915)。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 分組、建模及干預(yù):40只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、溫針灸組和法舒地爾組,每組10只,再根據(jù)干預(yù)時(shí)間節(jié)點(diǎn)分為7、14 d兩個(gè)亞組。假手術(shù)組手術(shù)咬除大鼠椎板,暴露脊髓;其余三組建立半橫斷SCI模型。半橫斷SCI模型制備方法:大鼠稱重,腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉,大鼠深度麻醉后,取俯臥位,定位T10椎體;以T10為中心消毒、開皮,分離皮下組織,去掉T10椎板,暴露脊髓;用無(wú)菌手術(shù)刀片以脊髓上附著的中央血管作為切入點(diǎn),切斷右側(cè)脊髓(不可跨越中間的血管及對(duì)側(cè)脊髓),造模成功的標(biāo)志為大鼠后肢、軀干、尾巴痙攣性抽動(dòng),肉眼可見脊髓斷端分離;分層縫合,術(shù)后每天1次人工按摩腹部排便,避免術(shù)后腸梗阻、尿潴留等并發(fā)癥增加大鼠死亡風(fēng)險(xiǎn)。造模后,溫針灸組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》選取大椎、命門穴,消毒后進(jìn)針約2~3 cm,得氣后在針柄固定艾條施灸,每次3壯,灸完后留針15 min,1次/d,施灸過(guò)程防止艾條脫落燙傷對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。法舒地爾組大鼠造模成功后,100 mg鹽酸法舒地爾凍干粉溶于100 ml的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射,10 ml/kg,1次/d,每周6次。
1.4.2 取材:分別于干預(yù)7、14 d取材,操作如下。組織病理染色、免疫組化取材:腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠,剃毛、消毒,打開胸腔,暴露心臟;將灌胃針從心尖部插入主動(dòng)脈,剪開右側(cè)心耳,快速注入0.9%氯化鈉溶液200 ml沖洗血液,再用4%多聚甲醛溶液350 ml緩慢灌注,至大鼠四肢、軀干、尾巴等全身組織僵硬,分離T10節(jié)段脊髓,取損傷段上下5 cm的組織,立即放入4%多聚甲醛緩沖液常溫保存?zhèn)溆?。WB、PCR取材:大鼠深度麻醉后,冰上迅速取材,并保持取材過(guò)程無(wú)菌、無(wú)酶,將組織放入凍存管中,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.3 組織病理染色:HE染色方法為,將組織修剪后放入脫水盒中,脫水、浸蠟后包埋,制作成蠟塊備用;用切片機(jī)切取3 μm切片,48 ℃溫水中展片,65 ℃烤片過(guò)夜;配制梯度乙醇、蘇木精、伊紅等染色劑,上機(jī)自動(dòng)化完成染色、封片等;取出封閉好的玻片在Olympus BX53顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。尼氏染色:將石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟至水;用尼氏染色液(甲苯胺藍(lán)法)置于50~60 ℃溫箱浸染20~40 min,蒸餾水沖洗多余的染液;95%乙醇迅速分化后用無(wú)水乙醇脫水,二甲苯透明后中性樹膠封片,鏡下觀察尼氏體細(xì)胞的形態(tài)變化。
1.4.4 免疫組織化學(xué)染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,自來(lái)水沖洗2 min,蒸餾水浸泡5 min;在抗原修復(fù)液中微波爐中火加熱5 min,繼續(xù)低火加熱10 min,完成修復(fù)后自然冷卻;PBS洗片3次,每次5 min,加3%H2O2室溫避光孵育10 min,PBS洗片3次,每次5 min;滴加5%正常山羊血清(1×PBS稀釋)涂覆樣本,放入濕盒37 ℃封閉1 h;取出Anti-RhoA Polyclonal Antibody、Anti-RTN4 Polyclonal Antibody、Anti-RockⅡ Polyclonal Antibody抗體,冰上解凍,根據(jù)抗體說(shuō)明書推薦抗體稀釋比例為1∶400,去掉切片上多余的封閉液,將現(xiàn)配的一抗稀釋液均勻滴加在玻片表面覆蓋組織,4 ℃孵育過(guò)夜;水平搖床PBS洗片3次,每次5 min;根據(jù)抗體說(shuō)明書取Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)抗體稀釋比例為1∶1000,去掉切片表面液體,將配好的二抗稀釋液滴在玻片表面覆蓋組織,37 ℃孵育30 min;水平搖床PBS洗片3次,每次5 min;加現(xiàn)配的DAB顯色液,顯微鏡下控制顯色時(shí)間,目的蛋白逐漸顯色而背景無(wú)顯色時(shí),用自來(lái)水沖洗終止顯色;蘇木素染色、鹽酸酒精分化后,返藍(lán);常規(guī)脫水封片,光學(xué)顯微鏡下鏡檢。
1.4.5 qRT-PCR檢測(cè)RhoA、RockⅡ表達(dá):取30~50 mg組織,用Tri Quick Reagent提取總RNA,測(cè)定濃度;用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在DNA聚合酶的作用下將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;熒光定量PCR儀進(jìn)行cDNA擴(kuò)增檢測(cè),反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;PCR循環(huán)(40個(gè)循環(huán)):95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s;反應(yīng)體系為2×Universal SYBR qPCR Mix 7.5 μl,上、下游引物各0.6 μl,cDNA 1 μl,超純水5 μl。記錄每個(gè)樣本所對(duì)應(yīng)基因的Ct值,2-△△Ct法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。
表1 引物序列
2.1 各組大鼠HE染色 見圖1。假手術(shù)組大鼠脊髓組織結(jié)構(gòu)致密,神經(jīng)元分布均勻,灰質(zhì)和白質(zhì)邊界清楚,灰質(zhì)呈蝴蝶狀,白質(zhì)排列整齊,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整。模型組干預(yù)7 d,結(jié)構(gòu)極度紊亂、缺損,細(xì)胞炎性浸潤(rùn),灰質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少;干預(yù)14 d,脊髓結(jié)構(gòu)紊亂依然存在,炎性浸潤(rùn)稍有改善,組織液化壞死,空洞形成。溫針灸組、法舒地爾組干預(yù)7 d,組織結(jié)構(gòu)紊亂,有較多的炎性細(xì)胞,病理改變程度較模型組輕;隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),干預(yù)14 d后上述組織形態(tài)變化較之前有好轉(zhuǎn),組織結(jié)構(gòu)呈中度紊亂,神經(jīng)元數(shù)量有所增加,炎性細(xì)胞減少,但仍有小膠質(zhì)細(xì)胞增生。
注:A、C(×50),B、D(×200)
2.2 各組大鼠尼氏染色 見圖2。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元胞漿中的尼氏小體分布集中,呈藍(lán)色斑塊和條索狀,大小適中,尼氏染色清晰;模型組大鼠尼氏細(xì)胞數(shù)量減少,分散分布,尼氏小體固縮,呈異常的小顆粒狀,部分細(xì)胞溶解,尼氏染色較暗淡不清;溫針灸組和法舒地爾組較模型組明顯改善,尼氏細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù),分布較為密集,著色相對(duì)均勻、清晰,尼氏小體仍有不同程度缺失。
圖2 各組大鼠7、14 d脊髓病理形態(tài)(尼氏染色,×200)
2.3 各組大鼠脊髓組織Rock Ⅱ、RhoA蛋白表達(dá)比較 見表2(圖3)。免疫組化結(jié)果顯示,Rock Ⅱ、RhoA主要在胞漿中呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞胞體可縮小變圓。假手術(shù)組干預(yù)7、14 d,Rock Ⅱ、RhoA蛋白均呈低水平表達(dá),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組同時(shí)間節(jié)點(diǎn)Rock Ⅱ、RhoA蛋白表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,溫針灸組、法舒地爾組各時(shí)間點(diǎn)Rock Ⅱ、RhoA蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與干預(yù)7 d比較,溫針灸組、法舒地爾組干預(yù)14 d時(shí)Rock Ⅱ、RhoA蛋白表達(dá)均降低,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表2 各組大鼠脊髓組織Rock Ⅱ、RhoA蛋白表達(dá)比較
圖3 各組大鼠RockⅡ、RhoA表達(dá)(免疫組化,×400)
2.4 各組大鼠脊髓組織Rock Ⅱ、RhoA mRNA表達(dá)比較 見表3。干預(yù)7、14 d,假手術(shù)組Rock Ⅱ、RhoA mRNA均呈低水平表達(dá),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)7、14 d,模型組Rock Ⅱ、RhoA mRNA表達(dá)高于假手術(shù)組同時(shí)間節(jié)點(diǎn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)7、14 d,溫針灸組、法舒地爾組Rock Ⅱ、RhoA mRNA表達(dá)均低于模型組同時(shí)間節(jié)點(diǎn)(P<0.05)。與干預(yù)7 d比較,溫針灸組、法舒地爾組干預(yù)14 d的Rock Ⅱ、RhoA mRNA表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表3 各組大鼠脊髓組織RockⅡ、RhoA mRNA表達(dá)比較
SCI是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域難以攻克的課題之一,盡管中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有一定再生能力,但仍然難以建立有效的神經(jīng)傳導(dǎo)通路。SCI后多種抑制信號(hào)通路的激活降低了神經(jīng)微弱的再生能力。Rho/Rock信號(hào)通路是多種抑制蛋白的匯合點(diǎn),在介導(dǎo)SCI和神經(jīng)再生中起著重要作用[7]。RhoA是一種小GTPase蛋白,屬于Rho GTPase家族,包含Rho、Rac、Cdc42等7個(gè)亞族;RhoA介導(dǎo)黏著斑和應(yīng)力纖維的形成,調(diào)節(jié)細(xì)胞極性,為細(xì)胞黏附、遷移和形態(tài)改變提供力量[8]。Rock屬于絲氨酸蘇氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族,是RhoA的下游因子,有RockⅠ和RockⅡ兩個(gè)亞組,在氨基酸和激酶結(jié)構(gòu)域上有較高的相似性[9]。RhoA、RockⅡ參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本功能,包括收縮、運(yùn)動(dòng)、增殖、基因表達(dá)和細(xì)胞的凋亡[10]。基礎(chǔ)和臨床研究均表明,抑制RhoA/Rock通路是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的有效方法[11]。法舒地爾是目前唯一應(yīng)用于臨床的Rho/Rock抑制劑,可特異性地抑制RockⅡ因子的表達(dá),改善大鼠SCI后灰質(zhì)和白質(zhì)的血供,增加軸突出芽[12]。臨床主要將其用于改善腦血管痙攣、促進(jìn)損傷的神經(jīng)恢復(fù),法舒地爾還具有抑制HL-60細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)分化及抑制侵襲等作用[13-14]。研究發(fā)現(xiàn),法舒地爾的藥效維持期為4周,延長(zhǎng)治療無(wú)效,并且存在一定的不良反應(yīng),其臨床安全性有待證實(shí)[15]。
本研究基于Rho/Rock信號(hào)通路從分子水平探討溫針灸治療SCI的機(jī)制,通過(guò)病理染色、免疫組化和qRT-PCR等現(xiàn)代生物分子學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組脊髓組織中RhoA、RockⅡ因子表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,SCI后RhoA、RockⅡ因子的表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高,表明Rho/Rock為SCI后的抑制信號(hào),對(duì)損傷的神經(jīng)修復(fù)有負(fù)面阻礙作用;溫針灸組各時(shí)間節(jié)點(diǎn)RhoA、Rock Ⅱ表達(dá)均低于模型組,表明溫針灸治療可抑制Rho/Rock信號(hào)通路,對(duì)SCI恢復(fù)有促進(jìn)作用;病理染色結(jié)果顯示,溫針灸組損傷組織病理改變較模型組明顯減輕,炎性細(xì)胞減少,形態(tài)恢復(fù),表明溫針灸可以增強(qiáng)炎癥吸收、促進(jìn)水腫消退,促進(jìn)組織恢復(fù);溫針灸組在干預(yù)14 d的RhoA、RockⅡ因子表達(dá)顯著低于7 d,組織形態(tài)改善程度也優(yōu)于7 d,說(shuō)明溫針灸可以延長(zhǎng)治療周期。
針灸對(duì)功能性損傷及SCI的病理改變有積極治療作用[16]。SCI屬于“督脈”損傷,屬于中醫(yī)“痿證”范疇,主要病機(jī)為督脈受損,陽(yáng)氣不足,氣血不通,機(jī)體廢痿失用[17]。《名醫(yī)別錄》載:“艾味苦,微溫,無(wú)毒,主灸百病”。艾灸具有芳香透竅、溫陽(yáng)通絡(luò)之效,其藥效能貫穿全身十二經(jīng)絡(luò)?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),艾灸除了穴位刺激、溫?zé)醾鲗?dǎo)的理化效應(yīng)外,艾條在燃燒時(shí)產(chǎn)生的紅外線具有高效穿透力,刺激穴位產(chǎn)生“受激共振”效應(yīng),借助反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,改善局部血液循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),為機(jī)體細(xì)胞活動(dòng)提供必要能量,加速受損神經(jīng)、組織的修復(fù)[18-19]。臨床研究顯示,溫針灸能有效改善患者的神經(jīng)功能,減少氧化應(yīng)激反應(yīng),降低體內(nèi)炎癥因子水平[20]。研究發(fā)現(xiàn),溫針灸可促進(jìn)受損脊髓γ-氨基丁酸的分泌,改善大鼠的肢體痙攣,上調(diào)Shh、Gli-1因子表達(dá),促進(jìn)髓鞘形成和神經(jīng)回路重建[21-22]。
綜上所述,溫針灸可促進(jìn)大鼠SCI后組織形態(tài)恢復(fù),提高神經(jīng)再生能力,作用機(jī)制可能與下調(diào)受損節(jié)段RhoA、RockⅡ因子的表達(dá)相關(guān)。