文/薛達(dá)冰

目前，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RTPCR)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床RNA病毒核酸定性檢測(cè)。FQ-RTPCR具有許多優(yōu)勢(shì)：（1）FQ-RTPCR在封閉的8聯(lián)管中進(jìn)行，無(wú)須進(jìn)行后處理，產(chǎn)物污染少，假陽(yáng)性發(fā)生率比較低；（2）能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化，結(jié)果簡(jiǎn)單明了；（3）工作效率高，可以實(shí)現(xiàn)樣本高通量檢測(cè)；（4）靈敏度高、特異性強(qiáng)，能快速、準(zhǔn)確完成核酸樣本檢測(cè)。但是，在近期的臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，核酸檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)與臨床診斷不符，出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的現(xiàn)象，檢測(cè)結(jié)果有時(shí)會(huì)受到質(zhì)疑。因此，核酸檢測(cè)的質(zhì)量控制是當(dāng)下臨床檢驗(yàn)工作者重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。為此，本文將從以下三個(gè)方面闡述利用FQ-RTPCR定性檢測(cè)RNA病毒核酸的質(zhì)量控制要素，為提高核酸檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性提供保障。

1 分析前的質(zhì)量控制

1.1 樣本運(yùn)輸與保存

在自然條件下存在著大量的RNA酶。有研究表明，RNA病毒的核酸在室溫條件下極易降解。因此，在RNA病毒樣本采集后，應(yīng)立即將樣本置于的RNA病毒核酸專用保存液中，并盡快安排送檢，并用冰袋保持樣本處于低溫狀態(tài)。如果采集后的樣本不能及時(shí)送檢，則應(yīng)將樣本存放于4℃中保存。標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室后，實(shí)驗(yàn)室工作人員盡快安排檢測(cè)，如果樣本能在24h內(nèi)檢測(cè)，則可置于4℃保存；若樣本在24小時(shí)內(nèi)無(wú)法將樣本檢測(cè)完畢，則應(yīng)將樣本放于-70℃冰箱保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)室設(shè)施

在PCR實(shí)驗(yàn)室，用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的儀器主要有實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、全自動(dòng)核酸提取儀、生物安全柜、冰箱、移液器、小型低速離心機(jī)等。在儀器投入使用前，必須對(duì)所有儀器設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)以及性能驗(yàn)證，評(píng)估整套設(shè)備的重復(fù)性、準(zhǔn)確性、最低檢測(cè)限等，只有結(jié)果符合要求才能投入使用。儀器在使用的過(guò)程中不可避免出現(xiàn)儀器老化、性能下降，由此出現(xiàn)儀器系統(tǒng)誤差的情況。定期對(duì)核酸檢測(cè)的主要儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，對(duì)校準(zhǔn)不通過(guò)的儀器因此，需要暫停使用并進(jìn)行查找原因?qū)ΠY處理，最后再次進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)后的儀器通過(guò)性能驗(yàn)證后才能投入使用。對(duì)儀器設(shè)備定時(shí)校準(zhǔn)是保證核酸檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵。

1.3 檢測(cè)試劑耗材

在核酸檢測(cè)過(guò)程中主要用到的試劑有核酸提取試劑和核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑。投入使用的核酸提取試劑主要的原理方法有磁珠法、柱提法、煮沸裂解法等。煮沸裂解法是比較簡(jiǎn)單的核酸提取方法，但是主要的缺點(diǎn)是提取后的核酸存在較多的雜質(zhì)，這對(duì)后續(xù)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)有著較大的抑制作用，容易產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。目前，臨床上使用較多的方法為柱提法和磁珠法，柱提法主要是通過(guò)手工進(jìn)行提取，成本比較低，方法簡(jiǎn)單，而且不需要比較高端的儀器設(shè)備，主要用于標(biāo)本量比較少的實(shí)驗(yàn)室，而磁珠法可以實(shí)現(xiàn)儀器自動(dòng)化，核酸提取時(shí)間短，可進(jìn)行高通量提取核酸，適用于大批量標(biāo)本檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室。在選擇核酸提取試劑時(shí)，我們建議選擇標(biāo)本加樣量大，并且最終的核酸洗脫液體積小的提取試劑，以獲得高濃度的病毒RNA，提高檢出率。目前，市場(chǎng)上針對(duì)不同的RNA病毒都會(huì)有多種相應(yīng)的核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑，選擇檢測(cè)限低、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的核酸擴(kuò)增試劑是提高核酸檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵。在使用新的品牌試劑或者新批號(hào)的試劑前都應(yīng)對(duì)該試劑進(jìn)行性能驗(yàn)證，認(rèn)真評(píng)估該試劑的重復(fù)性、準(zhǔn)確性、最低檢測(cè)限等性能，只有檢測(cè)結(jié)果符合要求才能正式投入使用[8-9]。

RNA病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)耗材質(zhì)量的好壞也將直接影響到后續(xù)核酸擴(kuò)增檢測(cè)的結(jié)果。我們應(yīng)使用質(zhì)量可靠的耗材，包括離心管、八聯(lián)管、各種不同規(guī)格帶濾芯的吸頭。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)新批號(hào)、同一批號(hào)不同貨運(yùn)號(hào)的關(guān)鍵耗材進(jìn)行驗(yàn)收，重點(diǎn)關(guān)注實(shí)驗(yàn)耗材的批間差異、抑制物等。此外，我們對(duì)八聯(lián)管還應(yīng)關(guān)注其是否存在爆管的可能，應(yīng)將新批號(hào)、同一批號(hào)不同貨運(yùn)號(hào)的八聯(lián)管置于擴(kuò)增儀上進(jìn)行高低溫多次循環(huán)，觀察八聯(lián)管是否存在爆管。對(duì)各種不同規(guī)格帶濾芯的吸頭我們也應(yīng)關(guān)注其密閉性是否良好，對(duì)于密閉性不良的帶濾芯的吸頭，退回給廠家，拒絕使用。

1.4 工作人員

核酸檢驗(yàn)人員貫穿整個(gè)核酸檢測(cè)的過(guò)程，是影響核酸檢測(cè)結(jié)果的關(guān)鍵。PCR實(shí)驗(yàn)室的手工操作環(huán)節(jié)較多，比較煩瑣，每個(gè)環(huán)節(jié)都有可能對(duì)最終的結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，必須保證核酸檢驗(yàn)人員擁有扎實(shí)的理論基礎(chǔ)、規(guī)范的操作、PCR上崗證或核酸檢測(cè)合格證、生物安全合格證等。檢測(cè)人員必須經(jīng)過(guò)培訓(xùn)并考核合格后方能上崗。在工作的過(guò)程中，必須嚴(yán)格按照預(yù)先制定好的操作規(guī)程進(jìn)行。此外，實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)定期組織實(shí)驗(yàn)室相關(guān)技術(shù)人員參加實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部比對(duì)活動(dòng)，確保不同技術(shù)人員檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部比對(duì)樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在可控范圍之內(nèi)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確度、準(zhǔn)確度在國(guó)家允許的范圍內(nèi)。

2 分析中質(zhì)量控制

試劑配制是RNA病毒核酸檢測(cè)的關(guān)鍵步驟之一。在配制試劑前，檢驗(yàn)人員應(yīng)穿戴好防護(hù)用品。例如帽子、口罩、鞋套等，避免外來(lái)的核酸片段污染試劑，并保證吸取試劑準(zhǔn)確無(wú)誤，做到充分混勻，這是保證所后續(xù)檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵。在利用FQ-RTPCR定性檢測(cè)RNA病毒的過(guò)程中，每個(gè)批次應(yīng)設(shè)置三個(gè)陰性質(zhì)控、一個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控，質(zhì)控品應(yīng)隨機(jī)放到樣品中一起參與提取、擴(kuò)增的過(guò)程。三個(gè)陰性質(zhì)控品主要監(jiān)測(cè)提取樣本核酸過(guò)程及環(huán)境是否受到污染。我們建議使用弱陽(yáng)性質(zhì)控品參與核酸提取、核酸擴(kuò)增的過(guò)程。弱陽(yáng)性質(zhì)控能更靈敏反映出核酸檢測(cè)體系的檢測(cè)水平，監(jiān)測(cè)是否存在假陰性的問(wèn)題；而且弱陽(yáng)性質(zhì)控品在提取過(guò)程中產(chǎn)生的陽(yáng)性基因片段氣溶膠污染概率較低。

3 檢測(cè)后質(zhì)量控制

3.1 核酸檢測(cè)結(jié)果的判讀

判斷某批次的核酸檢測(cè)結(jié)果是否準(zhǔn)確，首先，查看該批次的質(zhì)控是否在控。如果質(zhì)控結(jié)果為失控，則應(yīng)對(duì)失控的原因進(jìn)行分析，找出問(wèn)題。只有質(zhì)控在控，這一批次的核酸檢測(cè)結(jié)果才可以正常報(bào)告。其次，對(duì)于每一份樣本的核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該按照說(shuō)明書(shū)提示的方法來(lái)判讀，不能僅僅根據(jù)個(gè)人工作經(jīng)驗(yàn)來(lái)判讀結(jié)果，否則極有可能做出錯(cuò)誤的判斷。

3.2 實(shí)驗(yàn)室污染控制

FQ-RTPCR是一個(gè)高靈敏度的技術(shù)，微量的靶基因污染都會(huì)引起假陽(yáng)性的結(jié)果，因此，PCR實(shí)驗(yàn)室防污染是提高核酸檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。PCR實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)，以降低實(shí)驗(yàn)室受到核酸污染的風(fēng)險(xiǎn)。在工作時(shí)，工作人員必須按照工作的單一方向進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所有的耗材必須嚴(yán)格分區(qū)使用，并在各區(qū)的耗材上寫(xiě)上各區(qū)的標(biāo)志，不能將耗材相互串用，否則將會(huì)極易引起核酸污染。在工作中要時(shí)刻注意可能會(huì)引起的核酸污染，在打開(kāi)樣本蓋子的過(guò)程中，應(yīng)該注意盡量避免在核酸提取板上方打開(kāi)蓋子，否則會(huì)出現(xiàn)樣本攜帶污染，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。提取核酸后，用于提取核酸的攪拌套應(yīng)該用密封袋裝好并密封后才丟棄，避免攪拌套攜帶陽(yáng)性質(zhì)控的核酸揮發(fā)到樣本處理區(qū)，盡量降低陽(yáng)性質(zhì)控的核酸日積月累導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室發(fā)生污染的風(fēng)險(xiǎn)。

我們需要定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室的工作區(qū)間、儀器設(shè)備進(jìn)行清潔消毒。主要步驟包括：（1）使用75%酒精對(duì)精密儀器設(shè)備、工作臺(tái)面等進(jìn)行擦拭；（2）在PCR每個(gè)區(qū)噴灑75%酒精用于沉降懸浮于空氣中的部分核酸片段；（3）使用濃度為1000mg/L含氯消毒液對(duì)實(shí)驗(yàn)室的地面、污染區(qū)等進(jìn)行徹底消毒；（4）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后開(kāi)啟紫外燈照射2h以上，如果有條件可以照射過(guò)夜，使得實(shí)驗(yàn)室的基因片段徹底變性。

4 小結(jié)

利用FQ-RTPCR定性檢測(cè)RNA病毒核酸的整個(gè)流程包括檢驗(yàn)前、檢驗(yàn)中、檢驗(yàn)后，其每個(gè)細(xì)節(jié)都有可能對(duì)最終的結(jié)果產(chǎn)生比較大的影響。在臨床實(shí)踐過(guò)程中，如果不嚴(yán)格控制檢驗(yàn)質(zhì)量，這將會(huì)嚴(yán)重影響著臨床的正確診療。因此，只有不斷提高FQ-RTPCR的質(zhì)量控制水平，對(duì)檢驗(yàn)質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格把關(guān)才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的正確性，才能為臨床提供有價(jià)值的檢驗(yàn)報(bào)告。