袁 凱，李培源，郭 綽，楊旭東，楊 曦，郭玉蓉

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710119)

乳液凝膠是一類被乳狀液填充、具有凝膠網絡結構、機械性能良好的軟物質[1]。乳液凝膠因兼具乳液和凝膠的特點，性質獨特，近年來被廣泛用于功能活性成分負載[2]、固體脂肪替代[3]及酸奶、奶酪、肉制品加工等方面[4-6]。乳液凝膠的制備方式簡單，通常將乳液分散于凝膠的前體溶液中，再誘導溶液發(fā)生凝膠化即可得到乳液凝膠[7]。多糖和蛋白質在乳液凝膠的制備中非常關鍵，它們不僅是食品體系中常見的聚合物，而且對調控食品微觀結構具有重要作用[8]。制備多糖或蛋白質乳液凝膠時，既可以單獨選用多糖或蛋白質作為凝膠前體溶液，也可以選擇多糖和蛋白質的混合溶液作為凝膠前體溶液[1,9]，采用不同制備方式獲得的乳液凝膠具有不同的理化性質[10]。與單一的多糖或蛋白質乳液凝膠相比，多糖-蛋白質復合乳液凝膠更具優(yōu)勢。例如，蛋白質具有較好的表面活性，可以乳化并穩(wěn)定乳滴，而多糖具有良好的增稠和持水能力[9]，通過結合多糖和蛋白質各自的優(yōu)點，可賦予多糖-蛋白質乳液凝膠更加優(yōu)良的特性。已有研究表明，多糖-蛋白質復合乳液凝膠在風味物質控釋[11-12]、低脂食品構建[13-14]、功能成分包埋[3,5]等方面比單一的多糖或蛋白質乳液凝膠更具潛力。

從結構上分析，影響乳液凝膠性質的主要因素包括乳液連續(xù)相的性質、乳滴性質及乳滴和連續(xù)相之間的相互作用等[10]，這三個因素也受乳液凝膠制備方式的影響。對多糖-蛋白質復合乳液凝膠而言，多糖和蛋白質在乳滴表面的吸附行為是影響乳液凝膠結構特性的重要因素，包括多糖和蛋白質的界面競爭吸附、基于靜電相互作用的多層吸附、多糖和蛋白質在界面的體積排斥效應等[8,15-17]。不同的界面吸附機制不僅影響乳滴的大小、穩(wěn)定性，也影響乳滴和連續(xù)相之間的相互作用，并最終影響乳液凝膠的性質。目前，在有關乳液凝膠的研究中，乳滴的界面行為及其與連續(xù)相之間的相互作用已經得到廣泛研究[8,18-19]。然而，在多糖和蛋白質的混合體系中，聚合物濃度較高，連續(xù)相會發(fā)生離散型相分離，表現出復雜的相行為。此時，連續(xù)相形成分離的兩相，一相以蛋白質為主、包含少量多糖，另一相以多糖為主、包含少量蛋白質[20]，乳液凝膠的結構也因此更加復雜。但是，針對連續(xù)相的復雜相行為對乳液凝膠結構特性的影響目前還沒有相關報道。

基于此，本研究以海藻酸鈉和酪蛋白2種常見的食品聚合物為試材，分別制取由2種聚合物穩(wěn)定的乳液；再通過將海藻酸鈉/酪蛋白制備的乳液與另一聚合物混合，添加葡萄糖酸內酯酸化復合體系，誘導酪蛋白凝膠化，制備海藻酸鈉-酪蛋白復合乳液凝膠[21-22]。以該乳液凝膠為模型體系，采用流變學和電子顯微技術探究不同制備方式(乳化劑不同)和海藻酸鈉添加量對上述乳液凝膠結構特性的影響，并討論其形成機制，以期為開發(fā)新型凝膠類食品提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(純度92%)、海藻酸鈉(sodium alginate，Alg)、葡萄糖酸內酯(glucono-δ-lactone，GDL)、1, 2-丙二醇、尼羅藍A、尼羅紅均購自上海源葉生物科技有限公司；油菜籽購自當地華潤萬家超市；其他化學試劑由西安晶博生物科技有限公司提供，均為分析純。

1.2 實驗設備

PL203電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；EYELA OSB-2100恒溫水浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；TA.XT.Plus質構儀，英國Stable Micro System公司；FV1200激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)，日本奧林巴斯公司；AR-G2流變儀，美國TA公司；T25 digital ULTRA-TURRAX均質機，德國IKA公司；PHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

稱取80.0 g酪蛋白粉末于400 mL去離子水中，50 ℃水浴并不斷攪拌6 h至酪蛋白完全水化，用去離子水補充體系體積至500 mL，得到質量濃度160 g/L的酪蛋白母液。稱取5.0 g海藻酸鈉粉末置于90 mL去離子水中，室溫下(20 ℃)水化6 h，用去離子水補充體系體積至100 mL,得到質量濃度為50 g/L的海藻酸鈉母液。

海藻酸鈉-酪蛋白復合凝膠的制備：分別取50 g/L的海藻酸鈉母液4、8、15 mL與50 mL 160 g/L的酪蛋白母液混合，用去離子水補充體系體積至80 mL。稱取4.0 g GDL溶于20 mL去離子水中，并立刻添加至上述海藻酸鈉-酪蛋白混合體系中，充分攪拌30 s后，室溫下(20 ℃)靜置12 h至凝膠形成[23-24]。復合體系中酪蛋白的質量濃度為80 g/L，海藻酸鈉的質量濃度分別為2 g/L、4 g/L和7.5 g/L，GDL的質量濃度為40 g/L。以不添加海藻酸鈉的純酪蛋白凝膠作為對照。

海藻酸鈉-酪蛋白復合乳液凝膠的制備：采用2種方法制備復合乳液凝膠(如圖1)。

圖1 海藻酸鈉-酪蛋白復合乳液凝膠的制備Fig.1 Preparation of the sodium alginate-casein composite emulsion gels

方法一：將50 mL 160 g/L的酪蛋白母液與25 mL菜籽油混合后，在20 000 r/min的轉速下均質5 min形成酪蛋白乳液[25]。分別將4、8、15 mL 50 g/L的海藻酸鈉母液加去離子水補充至30 mL，再與上述酪蛋白乳液混合并攪拌均勻。之后，將4.0 g GDL溶于20 mL去離子水，并立刻添加至上述混合體系，攪拌均勻后室溫(20 ℃)下靜置12 h形成海藻酸鈉-酪蛋白復合乳液凝膠[7]。

方法二：分別將4、8、15 mL 50 g/L的海藻酸鈉母液用去離子水補充體積至30 mL，添加1 mL吐溫-80并混合均勻。上述溶液與25 mL菜籽油混合后，在20 000 r/min的轉速下均質5 min，并與50 mL質量濃度為160 g/L的酪蛋白母液混合均勻。后續(xù)采用與方法一相同的步驟添加GDL制備海藻酸鈉-酪蛋白復合乳液凝膠。

1.3.2 凝膠破裂強度測定

將GDL與方法一/方法二中未添加GDL的復合乳液混合攪拌后，立即倒入10 mL燒杯，室溫(20 ℃)下平衡12 h后取出凝膠，采用質構儀測定凝膠的破裂強度。參數[26]設定為：TPA壓縮模式，探頭為P/36R(直徑36 mm的圓柱狀平頭探頭)，測試前速度為2.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測試后速度為2.0 mm/s，應變?yōu)?0%,感應力為5.0 g。以凝膠破裂點探頭所記錄的力為凝膠強度，單位為g。每個樣品重復測定3次。

1.3.3 激光共聚焦顯微鏡觀察

將20 mg尼羅藍A溶解于10 mL 50 ℃的去離子水中，得到質量濃度為2 g/L的尼羅藍A染色液。然后將1 mL尼羅藍A染色液加入至50 mL 160 g/L的酪蛋白母液中，攪拌，避光靜置3 h，標記酪蛋白[27]。20 mg尼羅紅溶解于10 mL的1, 2-丙二醇中，制備質量濃度為2 g/L的尼羅紅染色液，移取1 mL尼羅紅染色液至100 mL菜籽油中，攪拌3 h，標記油滴。之后參照1.3.1中的制備方法制備復合乳液凝膠，加入GDL后，滴加一滴樣品于載玻片上，加蓋玻片，室溫(20 ℃)下避光靜置12 h。采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察復合乳液凝膠的微觀結構。設置尼羅藍A熒光的激發(fā)波長為488 nm，尼羅紅熒光的激發(fā)波長為633 nm，分別對酪蛋白及油滴成像。合并酪蛋白和油滴形貌的熒光圖像后，得到整個復合體系的激光共聚焦圖譜。同時，以不含海藻酸鈉的純酪蛋白凝膠作為對照。

1.3.4 復合乳液凝膠流變學特性測定

采用AR-G2流變儀對樣品進行時間掃描。按照1.3.1中的方法制備樣品凝膠，加入GDL后，立即移取2 mL樣品于流變儀樣品臺，采用直徑為20 mm的粗面平行板(板間間距為1 mm)立刻進行時間掃描，監(jiān)測儲存模量G′與損耗模量G″的變化趨勢[28]。測定溫度設置為20 ℃，應變范圍為1%(線性黏彈區(qū)范圍內)，頻率為1 Hz。

1.3.5 復合乳液凝膠pH值測定

為了追蹤添加GDL后復合凝膠的pH值變化，采用pH計測定凝膠形成過程中不同時間節(jié)點的pH值。將pH計感應探頭直接插入凝膠基質，待pH計指數穩(wěn)定后，記錄數值[29]。

1.4 數據分析

上述測定均重復3次，每次測試均需更換樣品。所有圖表均使用Origin 2018軟件進行繪制，利用IBM SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析(P<0.05為差異顯著)。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉-酪蛋白復合凝膠的制備及表征

成功制備海藻酸鈉-酪蛋白復合凝膠是后續(xù)構建復合乳液凝膠的第一步。本研究制備的復合凝膠分別包含質量濃度為0 g/L、2 g/L、4 g/L和7.5 g/L的海藻酸鈉及80 g/L的酪蛋白。采用尼羅藍A標記酪蛋白并在CLSM下成像，結果見圖2。熒光模式下，綠色區(qū)域代表酪蛋白的位置，黑色區(qū)域代表海藻酸鈉的位置。當海藻酸鈉的質量濃度為0 g/L時，凝膠結構呈現均勻的綠色，表明酪蛋白明顯聚集。隨著體系中海藻酸鈉的質量濃度從2 g/L增加至4 g/L，凝膠結構由酪蛋白主導的單一網絡結構轉變?yōu)椤八比橐航Y構；其中，酪蛋白為連續(xù)相，海藻酸鈉為分散相。當海藻酸鈉的質量濃度繼續(xù)增加至7.5 g/L時，凝膠結構轉變?yōu)橛衫业鞍着c海藻酸鈉共同組成的雙連續(xù)相結構。添加吐溫-80的復合凝膠微觀結構并未發(fā)生顯著改變。

圖2 復合凝膠的CLSM形貌Fig.2 CLSM images of composite gels注：網絡版為彩圖。

不同質量濃度海藻酸鈉的復合凝膠強度如表1所示。可以看出，隨著海藻酸鈉質量濃度的增加，凝膠強度呈現出先增加后降低的趨勢，在4 g/L的海藻酸鈉質量濃度下，復合凝膠強度最大。這是因為起初隨著海藻酸鈉質量濃度的增加，體系相分離逐漸明顯，促進了酪蛋白一相的聚集，加強了酪蛋白連續(xù)相的強度。而當海藻酸鈉質量濃度繼續(xù)增加至7.5 g/L時，海藻酸鈉一相的體積增加，但其分散相不形成凝膠，因此削弱了復合凝膠的強度[30]。與未添加吐溫-80的凝膠相比，加入吐溫-80后，凝膠強度略有增加，這可能是由于吐溫-80作為小分子表面活性劑，可以和酪蛋白膠束中的疏水區(qū)域結合，從而干擾酪蛋白的膠束結構，降低酪蛋白在溶液中的溶解度，使酪蛋白在酸化過程中更容易因溶解度降低而聚集[31]。但整體而言，吐溫-80的添加并未顯著影響海藻酸鈉-酪蛋白復合凝膠的強度。

表1 復合凝膠強度Tab.1 The strength of composite gels 單位：g

2.2 海藻酸鈉-酪蛋白復合乳液凝膠的制備及表征

2.2.1 復合乳液凝膠的CLSM形貌及強度變化

如圖3所示，方法一與方法二制備的復合乳液凝膠外觀均呈乳白色。當海藻酸鈉濃度較低時，乳液凝膠表面相對光滑，反之則較為粗糙，這可能是因為海藻酸鈉濃度較高時酪蛋白和海藻酸鈉發(fā)生了相分離，影響了凝膠質構。2種制備方法相比，方法二制備的乳液凝膠具有更光滑的表面，可能是因為吐溫-80加入后提高了體系的乳化效果。激光共聚焦成像結果顯示，隨著海藻酸鈉濃度的增加，方法一制備的復合乳液凝膠從初始酪蛋白主導的網絡結構逐漸轉變?yōu)橛衫业鞍着c海藻酸鈉共同組成的雙連續(xù)相結構(圖3a)，該變化趨勢與2.1中復合凝膠的變化趨勢一致，表明油滴的加入并未影響復合乳液凝膠體系的相分離趨勢。在方法二中，復合乳液凝膠也出現了從網絡結構到雙連續(xù)相結構的轉變，但吐溫-80的加入降低了凝膠結構的轉變程度(圖3b)。此外，雖然2種乳液凝膠的制備方法不同，但油滴均一直位于酪蛋白主導的網絡結構中，這可能是由于酪蛋白本質上是一種蛋白質，具有比海藻酸鈉更高的表面活性[32]。

圖3 復合乳液凝膠的CLSM形貌Fig.3 CLSM images of composite emulsion gels注：網絡版為彩圖。

凝膠強度是反映凝膠內部網絡結構的重要參數，復合乳液凝膠強度的測定結果如圖4所示。在0～7.5 g/L的海藻酸鈉質量濃度范圍內，方法一制備的乳液凝膠強度呈現先上升后下降的趨勢，與2.1中復合凝膠強度的變化趨勢相似。而方法二制備的復合乳液凝膠強度呈現出隨著海藻酸鈉質量濃度增加而持續(xù)上升的趨勢，這可能是因為乳液凝膠制備方法不同改變了體系各組分間的相互作用，影響了相分離速率，導致凝膠強度出現了不同的變化。

圖4 復合乳液凝膠強度Fig.4 The strength of composite emulsion gels注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2 復合乳液凝膠的流變學特性和結構演化

葡萄糖酸內酯誘導的酪蛋白聚集是時間依賴性過程，因此本研究對凝膠形成過程中的流變特性進行時間掃描，通過監(jiān)測凝膠形成過程中體系儲存模量G′和損耗模量G″的變化，得到凝膠網絡形成隨時間的變化關系。如圖5所示，添加GDL之初，所有樣品的G″高于G′，表明此時樣品中損耗模量占主導，即樣品仍具有流動性，且未形成凝膠網絡。隨著時間的延長，所有樣品的G′和G″均有所增加，但G′的增加速率高于G″，表明凝膠網絡開始形成；隨后出現了G′和G″的交點，該點所對應的時間即為凝膠化時間(Tgel)。當體系的海藻酸鈉為0 g/L時，不加吐溫-80的Tgel為1 295 s,加入吐溫-80后，Tgel延后為1 428 s，這是因為吐溫-80作為非離子型表面活性劑，可以與酪蛋白發(fā)生疏水相互作用，干擾酪蛋白聚集，導致凝膠形成略微緩慢[31]。然而，在2種方法制備的復合乳液凝膠中，Tgel均隨海藻酸鈉質量濃度的增加而明顯縮短。原因主要歸結于兩點：其一，海藻酸鈉質量濃度增加時，復合體系中總聚合物的濃度也增加，更容易形成凝膠網絡；其二，隨著海藻酸鈉質量濃度的增加，酪蛋白與海藻酸鈉之間的分子排斥力更顯著，促進了酪蛋白聚集，利于凝膠形成[33]。

圖5 復合乳液凝膠的流變特性時間掃描結果Fig. 5 Time sweep results of rheological behavior of emulsion gels注：網絡版為彩圖。

采用CLSM對復合乳液凝膠形成過程中的微觀結構變化進行觀察，結果如圖6所示?？梢钥闯?，在加入GDL后，純酪蛋白乳液凝膠(對照組)的結構均勻，酪蛋白充滿整個區(qū)域，油滴分散于酪蛋白主導的凝膠網絡中。對于方法一制備的復合乳液凝膠，隨著酸化時間的延長，其微觀結構很快出現相分離。該現象也在方法二制備的復合乳液凝膠中觀察到，但當方法二中的海藻酸鈉質量濃度為2 g/L時，乳滴粒徑明顯增大。造成上述現象的原因可能是方法二中使用了海藻酸鈉與吐溫-80的混合體系作為乳化劑，乳液存在于海藻酸鈉一相中，當海藻酸鈉濃度較低時，海藻酸鈉一相的黏度也較低，不能很好地阻止乳滴聚集和融合，導致乳滴粒徑增大；而當海藻酸鈉濃度增高時，海藻酸鈉一相的黏度增大，可有效阻礙乳滴聚集和融合。因此，當海藻酸鈉濃度高于4 g/L時，未觀察到明顯的乳滴融合現象。

圖6 復合乳液凝膠結構演化的CLSM形貌Fig. 6 CLSM images of composite emulsion gel structure evolution注：網絡版為彩圖。

2.2.3 復合乳液凝膠的pH值變化

復合乳液凝膠pH值動態(tài)測定結果見圖7。未添加GDL時，復合乳液的pH值為7.1，加入GDL后，復合體系的pH值立即下降至6.5～6.75。隨著酸化過程的進行，pH值繼續(xù)緩慢下降，60 min后，復合乳液凝膠的pH值仍高于酪蛋白的等電點(約為4.6)。該結果表明，在加入GDL后的60 min內，酪蛋白和海藻酸鈉均攜帶有負電荷，分子間靜電斥力是主要作用力。在分子間斥力的作用下，海藻酸鈉和酪蛋白會發(fā)生相分離，該結論與圖6中的結果一致。在室溫下平衡12 h后，測得所有凝膠的pH值均在3.50～3.59之間。在此pH值范圍內，海藻酸鈉與酪蛋白之間存在靜電引力，但由于在添加GDL 60 min內乳液已經形成了凝膠網絡，因此靜電引力并未引起凝膠網絡的明顯變化。

圖7 加入GDL后復合乳液凝膠的pH值Fig.7 pH of the composite emulsion gels after GDL addition

2.3復合乳液凝膠的形成機制

本文以海藻酸鈉和酪蛋白復合體系為模型，制備了多糖-蛋白質復合乳液凝膠。在制備乳液時，既可選擇酪蛋白為乳化劑(方法一)，也可選擇海藻酸鈉為乳化劑(方法二)。由于海藻酸鈉屬于親水性較強的多糖，疏水官能團含量低，因此乳化性較差[34]。為了獲得穩(wěn)定性良好的乳液，在方法二中采用了吐溫-80和海藻酸鈉的混合溶液作為乳化劑。2種方法制備的復合乳液凝膠形成機制略有不同。

如圖8所示，采用方法一制備乳液時，酪蛋白為乳化劑，吸附于油滴表面穩(wěn)定乳液，繼續(xù)和海藻酸鈉溶液混合后，體系的pH值為7.1，此時海藻酸鈉和酪蛋白均攜帶負電荷，在靜電斥力的作用下復合體系隨海藻酸鈉濃度的不同出現不同的相行為。當海藻酸鈉質量濃度由低至高增加時(小于4 g/L)，復合體系由單一網絡結構轉變?yōu)椤八毙腿橐航Y構，此時海藻酸鈉為分散相，酪蛋白為連續(xù)相。當海藻酸鈉的質量濃度增加至7.5 g/L時，凝膠結構轉變?yōu)橛衫业鞍着c海藻酸鈉共同組成的雙連續(xù)相結構。由于乳滴由酪蛋白穩(wěn)定，因而乳滴總是存在于酪蛋白連續(xù)相中。添加GDL后，體系pH值降低，酪蛋白溶解度不斷下降，最終引起分子聚集，從而形成凝膠。在這一過程中，復合體系逐漸固化，保留了最初的相分離狀態(tài)。

方法二中，采用海藻酸鈉和吐溫-80的混合溶液做乳化劑制備乳液。由于吐溫-80的分子量較小且乳化性能優(yōu)良，因此在制備乳液時，吐溫-80優(yōu)先吸附于乳滴表面，而海藻酸鈉存在于連續(xù)相中增加黏度，進一步穩(wěn)定乳液。將乳液和酪蛋白混合后，復合體系仍然會在分子間靜電斥力的作用下發(fā)生相分離，但由于海藻酸鈉并未吸附至乳滴表面，因而發(fā)生相分離時乳滴未存在于海藻酸鈉一相中，而是與海藻酸鈉一相混合存在。需要指出的是，盡管方法一和方法二制備的復合乳液凝膠結構特性非常相似，但在方法一中，乳滴表面由酪蛋白穩(wěn)定，而在方法二中，乳滴表面由吐溫-80穩(wěn)定，二者的乳滴界面層有所差別。

圖8 復合乳液凝膠形成機制示意圖Fig.8 Schematic diagram of formation mechanism for the composite emulsion gels注：網絡版為彩圖。

3 結論

本文采用2種方法制備海藻酸鈉-酪蛋白復合乳液凝膠，比較了不同制備方法和海藻酸鈉濃度對復合乳液凝膠CLSM微觀結構及流變學特性的影響，并探討了復合乳液凝膠的形成機制。研究表明，在80 g/L固定酪蛋白條件下，隨著海藻酸鈉濃度的增加，體系從酪蛋白主導的單一相逐漸轉變?yōu)槔业鞍诪檫B續(xù)相、海藻酸鈉為分散相的“水包水”型乳液結構。當海藻酸鈉質量濃度繼續(xù)增加至7.5 g/L時，形成了雙連續(xù)相結構。油滴的加入并未改變海藻酸鈉-酪蛋白體系發(fā)生相分離的趨勢。雖然2種制備方法所選用的乳化劑不同，但油滴總是均勻地分布于酪蛋白為主體的網絡結構中。酸化過程中，凝膠化點出現于GDL添加后的60 min內，此時乳液凝膠中酪蛋白和海藻酸鈉的分子間靜電斥力是引起混合乳液凝膠相分離的關鍵原因。2種制備方法對乳液凝膠結構特性的影響有限，但方法一較為簡單，制備的乳液凝膠乳滴粒徑較小，且在海藻酸鈉質量濃度為4 g/L時形成的乳液凝膠質地較好。本研究結果為理解多糖-蛋白質復合乳液凝膠結構提供了理論依據，但在實際開發(fā)相關凝膠類食品時，仍需考慮風味、口感等指標。