馬常娥,于 沛,趙小云,肖紅霞,陳維香

(1.河西學(xué)院附屬張掖人民醫(yī)院，2.河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院,甘肅 張掖 734000；3.上海市第六人民醫(yī)院,上海 200233)

高糖誘導(dǎo)腎小球基底膜外側(cè)的足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能受損，是引發(fā)糖尿病腎病的重要原因[1]。格列齊特是第二代磺脲類藥物，對糖尿病腎病患者的腎功能具有保護(hù)作用[2]，但目前缺乏格列齊特在腎病細(xì)胞層面具體功能與機(jī)制的研究，因此本研究探討格列齊特對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的影響及機(jī)制，為闡明格列齊特對糖尿病腎病的保護(hù)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器MPC5細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫；D-葡萄糖、格列齊特，均購自上海源葉生物科技有限公司；Hoechst 33258購自北京索萊寶科技有限公司；一抗抗體Bax、Bcl-2、Nephrin、podocin、p-mTOR、mTOR、p-P70S6K、P70S6K、p-4E-BP1、4E-BP1均購自美國Abcam公司；流式細(xì)胞儀，型號：BD FACSCalibur，購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組MPC5細(xì)胞用含有10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素和10 kU·L-1的γ-干擾素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前用不含 γ-干擾素的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 d誘導(dǎo)分化。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組、高糖組、格列齊特組(5、10、20 μmol·L-1)。

1.3 MTT檢測MPC5細(xì)胞存活率按“1.2”分組，培養(yǎng)24 h，加入100 μL MTT溶液，孵育4 h，棄上清后用二甲基亞砜重懸，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MPC5細(xì)胞凋亡率按“1.2”分組，培養(yǎng)24 h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，加入結(jié)合緩沖液、Annexin V-FITC與PI，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.5 Western blot檢測MPC5細(xì)胞Bax、Bcl-2、Nephrin、podocin、mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表達(dá)按“1.2”分組，培養(yǎng)24 h，提取總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗、二抗，曝光后用ImageJ分析條帶。

1.6 Transwell檢測MPC5細(xì)胞遷移水平按“1.2”分組，細(xì)胞在Transwell小室上室培養(yǎng)24 h，固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

Tab 1 Effect of gliclazide on proliferation,apoptosis and migration of MPC5 cells induced by high glucose n=9)

Tab 2 Effect of glicizide on protein levels of nephrin,podocin,p-mTOR /mTOR,p-P70S6K /P70S6K and p-4E-BP1/4E-BP1 of MPC5 cells induced by high glucose n=9)

2 結(jié)果

2.1 格列齊特對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響與對照組比較，高糖組MPC5細(xì)胞存活率明顯降低，凋亡率、Bax/Bcl-2蛋白水平、遷移數(shù)明顯增加(P<0.01)，與高糖組比較，格列齊特組(5、10、20 μmol·L-1)MPC5細(xì)胞存活率明顯增加，凋亡率、Bax/Bcl-2蛋白水平、遷移數(shù)明顯降低(P<0.05)，見Tab 1。

2.2 格列齊特對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞Nephrin、podocin蛋白水平的影響與對照組比較，高糖組MPC5細(xì)胞Nephrin、podocin蛋白水平明顯降低(P<0.01)，與高糖組比較，格列齊特組(5、10、20 μmol·L-1)MPC5細(xì)胞Nephrin、podocin蛋白水平明顯增加(P<0.01)，見Tab 2。

2.3 格列齊特對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞mTOR信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響與對照組比較，高糖組MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4E-BP1/4E-BP1蛋白水平明顯增加(P<0.01)，與高糖組比較，格列齊特組(5、10、20 μmol·L-1)MPC5細(xì)胞p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4E-BP1/4E-BP1蛋白水平明顯降低(P<0.01)，見Tab 2。

3 討論

Bax、Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要蛋白，當(dāng)Bax/Bcl-2比值增加時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。Nephrin和podocin蛋白常用于衡量足細(xì)胞損傷[4]，本研究發(fā)現(xiàn)，格列齊特處理可明顯提高高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞存活率和Nephrin、podocin蛋白水平，降低凋亡率、遷移數(shù)和Bax/Bcl-2蛋白水平，表明格列齊特對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

mTOR信號通路在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷及多種藥理過程中發(fā)揮重要作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，格列齊特明顯降低高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞mTOR、P70S6K、4E-BP1的磷酸化水平，推測格列齊特對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞的影響可能與其抑制mTOR信號通路有關(guān)。

綜上所述，格列齊特可能通過抑制mTOR信號通路減輕高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞損傷。