顏茹芳，李佳璟，查 進(jìn)，黃煥森，汪靈芝

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州 510260)

研究表明，大約有86%的患者在接受手術(shù)治療后會明顯感受到疼痛。盡管多模式鎮(zhèn)痛在臨床廣泛應(yīng)用，但患者對手術(shù)后急性疼痛的一般治療手段滿意度仍舊低于47%～75%[1]。另有研究顯示，約10%～50%的術(shù)后急性疼痛在不經(jīng)恰當(dāng)?shù)呐R床治療后可發(fā)展為慢性疼痛[2]。而應(yīng)用藥物或者康復(fù)治療有效地控制術(shù)后急性疼痛，可以極大地加快患者的康復(fù)并提高患者滿意度，已然成為加速康復(fù)外科在圍術(shù)期應(yīng)用的重要組成部分。因此，探討術(shù)后急性疼痛的發(fā)生機(jī)制將具有重要的意義。

細(xì)胞縫隙連接通道(gap junction,GJ)在20世紀(jì)60年代首次發(fā)現(xiàn)，其由連接蛋白(connexin，Cx)組成。目前已知Cx有21個(gè)亞型,所有已知的Cx亞型在結(jié)構(gòu)上相似，均有4個(gè)跨膜域(TM),2個(gè)細(xì)胞外環(huán)(EL)，1個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)(CL)，1個(gè)氨基端(NT)和1個(gè)C末端(CT)。6個(gè)環(huán)繞在一起的Cx蛋白在細(xì)胞膜上形成單一膜通道稱為半通道(hemichannel)。兩個(gè)相鄰細(xì)胞膜上的半通道對接形成GJ。細(xì)胞胞漿中分子量<1 ku的小分子物質(zhì)或者信號分子通過GJ擴(kuò)散，是細(xì)胞之間信號傳遞的一種重要方式[3]。除此之外，Cx 組成的半通道(hemichannel)本身也具有極其重要的功能，可通過旁分泌或者自分泌方式釋放活性物質(zhì)，如釋放ATP、ADP等作用于周圍細(xì)胞產(chǎn)生作用[4]。

既往研究顯示，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞通過其表達(dá)的Cx43及其組成的半通道在慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和后續(xù)維持階段發(fā)揮極其重要的作用[5]。我們通過前期研究發(fā)現(xiàn)，Cx43在急性切口痛大鼠脊髓背角中的表達(dá)在術(shù)后24 h內(nèi)增加[6]。另有研究表明，通過使用非特異性縫隙連接通道抑制劑CBX可以緩解大鼠急性痛[7]，但Cx43半通道在急性痛中是否發(fā)揮作用仍未知。因此，本研究擬在急性切口痛大鼠通過鞘內(nèi)給予特異性Cx43半通道抑制劑Gap19觀察Cx43半通道對大鼠急性切口痛的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(120～140)g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2018-0002提供。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵循美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的動物實(shí)驗(yàn)指南，且通過廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑Gap19購于美國TopScience公司；GFAP鼠單克隆抗體(MAB360)購于美國Millipore 公司；Cx43兔多克隆抗體 (ab11370)，熒光二抗(ab150113，ab150080)購于美國Abcam公司；TNF-α兔多克隆抗體(17590-1-AP)，山羊抗兔二抗(SA00001-2)，山羊抗鼠二抗(SA00001-15)購于武漢三鷹；大鼠TNF-α ELISA試劑盒(RTA00)購于美國R&D公司；大鼠IL-1β ELISA試劑盒(1310122)，大鼠IL-6 ELISA試劑盒(1310602)購于達(dá)科為公司。

1.1.3主要儀器 電泳儀(BIO-RAD，美國)，倒置熒光共聚焦顯微鏡(Leica DM4100，德國)，冰凍切片機(jī)(Leica DM1600，德國)，臺式低溫離心機(jī)(Eppendorf，德國)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 取雄性SD大鼠60只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組20只，C組：對照-生理鹽水組；I組：切口痛-生理鹽水組；Gap19組：切口痛+Gap19組。I組和Gap19組均制備趾部急性切口痛模型；C組、I組均于造模手術(shù)前30 min鞘內(nèi)注射生理鹽水10 μL，Gap19組則于術(shù)前30 min鞘內(nèi)注射Gap19 10 μL(10 g·L-1)。

1.2.2大鼠趾部切口模型 急性切口痛大鼠模型參考Brennan等[8]的方法制備。采用5%異氟烷誘導(dǎo)大鼠，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，2%～3%異氟烷維持麻醉，將大鼠固定于恒溫動物手術(shù)臺，固定左后肢，消毒。自大鼠左后跟約0.5 cm處，向遠(yuǎn)端做一縱行切口，長約1 cm；眼科鑷鈍性分離肌肉筋膜組織并挑起足底肌肉，再行一次縱向切割(注意不損傷附近血管神經(jīng))，紗球輕壓止血后用5-0尼龍線縫合肌肉皮膚并消毒。術(shù)后大鼠干凈單籠飼養(yǎng)，保暖，待大鼠蘇醒后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。模型的制備由熟悉模型操作的同一人完成。

1.2.3行為學(xué)測定 在造模前1 d、造模后2 h、6 h、24 h、48 h、3 d、7 d隨機(jī)抽取6只大鼠進(jìn)行機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(mechanical paw withdrawal threshold，MPWT)測定。測定開始前30 min，將大鼠置于金屬網(wǎng)上的有機(jī)透明玻璃盒內(nèi)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，隨后使用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的纖維絲(Von Frey纖維絲)，采用“up and down”法，用8根不同力度的纖維絲(1.4、2、4、6、8、10、15、26 g)刺激大鼠腓側(cè)即外側(cè)皮膚直至纖維絲彎成S形，保持5～8 s并觀察是否出現(xiàn)縮足、舔足等陽性反應(yīng)。每次刺激間隔30 s。給予大鼠的疼痛刺激從中等力度6 g開始，當(dāng)該力度無法引起上述陽性反應(yīng)時(shí)，30 s后采用大一級力度的纖維絲繼續(xù)予以疼痛刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則間隔30 s后采用小一級力度的纖維絲，如此反復(fù)直到出現(xiàn)第一次騎跨，即陽性和陰性(或陰性和陽性)反應(yīng)交替時(shí)，再連續(xù)測量4次。根據(jù)Dixon[9]的方法將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為50%PWT[50%PWT(g)=10Xf+κδ，其中Xf=log(f)，δ為各纖維絲力度取log后的均差]。

1.2.4Western blot蛋白印跡分析 各組隨機(jī)抽取4只大鼠，稱體質(zhì)量，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，劑量為50 mg·kg-1，頸椎脫臼處理后快速剝離出L4～6節(jié)段脊髓組織，在立體顯微鏡下分離出脊髓背角，稱質(zhì)量裂解后冰上靜置20 min，隨后離心10 min(4 ℃ 12 000 r·min-1)，收集上清液，應(yīng)用BCA法測定各蛋白樣品濃度，隨后加入緩沖液配置成同一濃度，99 ℃金屬浴10 min后得到蛋白樣品。上樣電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶(2.5 g/50 mL)室溫封閉1 h，分別加入兔來源Cx43(1 ∶8 000，abcam ab11370)、鼠來源 GFAP(1 ∶2 000，18 Millipore MAB360)、兔來源TNF-α(1 ∶1 000，proteintech 17590-1-AP)和鼠來源β-actin (1 ∶20 000，proteintech 66009-1-Ig)，4 ℃過夜；洗去多余一抗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔(1 ∶1 0000，proteintech SA00001-2)和山羊抗鼠(1 ∶2 000，CST 7076)于室溫孵育1 h。暗室內(nèi)用ECL全自動凝膠成像儀(勤翔)顯像，采用ImageJ軟件計(jì)算灰度值。

1.2.5免疫熒光染色 各組于術(shù)后6 h和7 d隨機(jī)選取3只大鼠，麻醉后暴露心臟，從心尖穿刺將20ml注射針頭插管到達(dá)升主動脈，依次灌注預(yù)冷后的PBS溶液和4%多聚甲醛，切開背部皮膚，暴露脊柱，并切取脊髓L4～6節(jié)段，小心剝除硬脊膜等膜樣組織，獲得脊髓組織，浸入4%多聚甲醛進(jìn)行后固定，然后依次浸入10%、20%、30%蔗糖溶液于4 ℃進(jìn)行濃度梯度脫水。冰凍切片，每片厚30 μm。熒光染色(漂片法):PBST 洗片3次，每次5 min。加入10%山羊血清/0.3%TritonX-100室溫輕搖2 h，進(jìn)行封閉及破膜。棄去封閉液，加入一抗GFAP(1 ∶800，Millipore MAB360)、Cx43(1 ∶500，abcam ab11370)4 ℃孵育過夜。PBST 洗片 3次，每次5 min，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗鼠IgG (1 ∶800，abcam ab150113)，Alexa Fluor 594 標(biāo)記山羊抗兔IgG (1 ∶800，abcam ab150080)，室溫輕搖2h，進(jìn)行熒光雙標(biāo)染色，注意避光；PBST洗片3次，每次5min，滴加 DAPI及防猝滅劑(abcam，ab104139)，室溫靜置 5min，蓋上蓋玻片。置于倒置熒光顯微鏡觀察并拍攝圖像。使用Image J軟件分析測量各組大鼠脊髓背角組織切片在相同倍數(shù)視野下紅色熒光(代表Cx43)陽性信號及綠色熒光(代表GFAP)陽性信號平均熒光強(qiáng)度Mean gray value。

1.2.6ELISA檢測炎癥因子含量 隨機(jī)選取各組術(shù)后6 h的3只大鼠，麻醉后暴露脊柱，于立體顯微鏡下快速剝離脊髓L4～6節(jié)段背角組織，稱質(zhì)量后按1 ∶9加入預(yù)冷PBS，冰上研磨勻漿，4 ℃ 12 000 r·min-1，離心10 min，吸取上清，使用大鼠TNF-α ELISA Kit(RD，RTA00)、大鼠IL-1β ELISA Kit(達(dá)科為，1310122)及大鼠IL-6 ELISA kit(達(dá)科為，1310602)，試劑恢復(fù)至室溫，按照各試劑盒說明書，96孔板內(nèi)每孔加入50 μL稀釋液，隨后分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品、樣品，混勻，貼封口膜，室溫孵育2 h。棄去孔中液體，洗板5次，隨后每孔加入100 μL耦聯(lián)物，室溫孵育2 h。再次棄去孔中液體，洗板5次，每孔加入100 μL顯色劑，室溫避光孵育30 min。隨后每孔加入100 μL終止液，在30 min內(nèi)盡快讀數(shù)，設(shè)置波長為450 nm，矯正波長為540 nm或570 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品OD值讀數(shù)代入曲線，分別得到L4-6脊髓背角組織中TNF-α、IL-1β及IL-6的濃度。

2 結(jié)果

2.1 Cx43在急性切口痛大鼠脊髓背角的表達(dá)Western blot觀察急性切口痛大鼠6 h、3 d和7 d的脊髓背角Cx43蛋白及星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP蛋白的表達(dá)情況。Fig 1結(jié)果顯示，與C組相比，I組大鼠脊髓背角Cx43和GFAP的表達(dá)在術(shù)后6 h明顯增加，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而術(shù)后3 d和7 d脊髓背角Cx43和GFAP的表達(dá)逐漸減少，其變化與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Cx43特異性半通道抑制劑對急性切口痛大鼠急性疼痛的影響通過鞘內(nèi)應(yīng)用Cx43半通道特異性抑制劑Gap19，觀察脊髓背角Cx43半通道在大鼠趾部切口痛中的作用。各組大鼠的術(shù)前基礎(chǔ)MPWT

Fig 1 Expression of connexin43 and GFAP in astrocytes of rat spinal cord dorsal horn after incision

間的差值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與術(shù)前相比，模型組和鞘內(nèi)應(yīng)用Cx43特異性抑制劑Gap19組大鼠在切口建立后2 h、6 h、24 h、3 d的MPWT明顯降低(P<0.01)，術(shù)后7d的MPWT與術(shù)前相比無改變。與模型組相比，應(yīng)用特異性抑制劑Gap19后大鼠的MPWT在術(shù)后2、6、24 h明顯增加，但術(shù)后3 d和7 d，鞘內(nèi)應(yīng)用Gap19并未改變大鼠的縮足反應(yīng)閾值(P<0.01)，見Tab 1。

2.3 術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)Cx43特異性半通道抑制劑對大鼠脊髓背角Cx43表達(dá)的影響急性切口痛術(shù)后6 h，F(xiàn)ig 2免疫熒光結(jié)果顯示，相較于C組GFAP平均熒光強(qiáng)度為49.196±2.347，I組大鼠脊髓背角GFAP表達(dá)明顯增加，平均熒光強(qiáng)度上升至66.893±4.256，兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C組Cx43為39.831±8.093，I組上升至70.134±2.764%，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Tab 1 Change of MPWT at different time points in each

Fig 2 Effect of Gap19 on expression of Cx43 and GFAP in astrocytes of rat spinal cord dorsal horn 6 h

與I組相比,鞘內(nèi)應(yīng)用Cx43半通道抑制劑Gap19能夠明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白GFAP的表達(dá)，減少至56.412 ± 3.123，同時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞上Cx43的表達(dá)也明顯下降至51.816±8.809，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

在術(shù)后7 d的免疫熒光結(jié)果中，C組GFAP和Cx43的平均熒光強(qiáng)度分別為126.477 ± 6.120和104.563 ± 3.883。I組熒光GFAP和Cx43分別為147.764±11.396和97.059±4.003，兩組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鞘內(nèi)應(yīng)用Cx43半通道抑制劑Gap19熒光后GFAP和Cx43分別為140.737±7.242和107.550±4.655，與I組相比，鞘內(nèi)應(yīng)用Cx43半通道抑制劑Gap19對GFAP和Cx43的熒光表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 Cx43半通道特異性抑制劑抑制脊髓炎癥因子的表達(dá)切口痛大鼠于術(shù)后6 h取脊髓背角組織進(jìn)行ELISA檢測炎癥因子表達(dá)。Fig 3結(jié)果表明，與C組相比，I組大鼠脊髓背角炎癥因子IL-1β,IL-6以及TNF-α的表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與I組相比，鞘內(nèi)應(yīng)用Cx43半通道特異性抑制劑能明顯抑制3種炎癥因子的表達(dá)(P<0.05)。

Fig 3 Effect of Gap19 on expression of Cx43 and GFAP in astrocytes of rat spinal cord dorsal horn on 7 d after incision

3 討論

術(shù)后疼痛是指在承受手術(shù)應(yīng)激后外科患者表現(xiàn)的一種生理、心理及行為改變等綜合反應(yīng)。術(shù)后急性疼痛控制不佳將使患者承受巨大的痛苦，嚴(yán)重時(shí)將引起一系列器官功能受損，同時(shí)也將延長住院時(shí)間，增加社會負(fù)擔(dān)[10]。本研究采用經(jīng)典的Brennan建立的大鼠趾部切口急性痛模型，術(shù)后大鼠表現(xiàn)為自發(fā)痛和痛覺過敏，不同程度的舔足或抬足行為，其與臨床上的術(shù)后疼痛相似。本研究表明，大鼠切口建立后的2 h、6 h、24 h、3 d的機(jī)械縮足反應(yīng)閾值明顯降低，以2 h和6 h表現(xiàn)最為顯著，而術(shù)后7 d的機(jī)械縮足閾值回復(fù)到正常水平。這與他人以及我們之前的研究結(jié)果相吻合[6]。

Fig 4 Effect of Gap19 on expression of inflammation factors in rat spinal cord dorsal horn 6 h after incision

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，主要表達(dá)的細(xì)胞縫隙連接蛋白是Cx43[11]。近來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅對神經(jīng)元起著支持及營養(yǎng)作用，同時(shí)還參與細(xì)胞間生物信號傳遞功能。大量研究表明，脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞與中樞痛覺過敏的產(chǎn)生和維持密切相關(guān)[12]。通過脊髓損傷模型發(fā)現(xiàn) Cx43/Cx30 雙基因敲除后大鼠的機(jī)械性痛閾和溫度敏感閾值明顯提高，而Cx30單基因敲除的大鼠痛閾未見明顯變化，因此認(rèn)為Cx43而非 Cx30參與了中樞神經(jīng)損傷導(dǎo)致的慢性神經(jīng)病理性疼痛[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷性病理性疼痛、炎性痛和癌痛等慢性疼痛中都伴隨有脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)的改變，而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43組成的通道功能能明顯抑制痛覺過敏的發(fā)生[14]。在急性切口痛中,我們之前的研究曾首次報(bào)道Cx43的表達(dá)在24 h內(nèi)增加明顯[6]，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確在術(shù)后3d和7 d脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和Cx43的表達(dá)無變化。另有研究也發(fā)現(xiàn)，切口痛大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞在24 h內(nèi)激活，GFAP表達(dá)量增多，而小膠質(zhì)細(xì)胞活化在術(shù)后3 d才明顯增加[15]。結(jié)合前人研究，我們推測急性疼痛中外周傷害信號導(dǎo)致脊髓神經(jīng)元敏化，繼而星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx增多并活化，進(jìn)一步促進(jìn)脊髓神經(jīng)元興奮性發(fā)生改變。

Gap19是來源于Cx43胞漿端的模擬九肽，能夠通過與Cx43蛋白C末端結(jié)合，從而阻止Cx43蛋白分子內(nèi)胞漿端與C末端的交互作用。Gap26和Gap29等Cx43半通道抑制劑,在抑制半通道的同時(shí)會抑制GJ，而Gap19在抑制Cx43半通道功能時(shí)并不影響GJ功能，是一種公認(rèn)的針對Cx43半通道的特異性抑制劑，廣泛應(yīng)用于多種疾病發(fā)生的病理生理機(jī)制研究[16]。本研究采用鞘內(nèi)給藥法，Gap19的給藥劑量參考他人的研究中的常用劑量[16]。我們的結(jié)果顯示，在大鼠急性切口痛模型中特異性抑制Cx43組成的半通道能明顯減輕大鼠術(shù)后24 h內(nèi)的大鼠痛覺過敏，而對術(shù)后3 d和7 d大鼠痛覺無影響。我們還發(fā)現(xiàn)，Gap19能明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白GFAP和Cx43的表達(dá)。因此，這提示我們脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43在大鼠趾部切口急性痛中的作用與其半通道功能有關(guān)。研究表明，Cx43組成的半通道可直接釋放ATP、谷氨酸、前列腺素等信號分子從而產(chǎn)生作用[11]。在慢性疼痛中，Chen等[5]還發(fā)現(xiàn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43組成的半通道可通過釋放細(xì)胞因子，參與炎癥因子介導(dǎo)的神經(jīng)元敏化。研究表明在包括慢性疼痛在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生機(jī)制中發(fā)現(xiàn)炎癥因子在介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元相互作用中具有至關(guān)重要的作用[10]。最近研究者發(fā)現(xiàn)，化療藥物紫杉醇引起膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子TNF-α是其導(dǎo)致急性痛的可能機(jī)制[17]，而且IL-1β在其發(fā)生機(jī)制中也扮演重要的角色[18]。本研究在急性切口痛大鼠脊髓中發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6以及TNF-α促炎因子的表達(dá)明顯增多，而應(yīng)用Gap19能明顯減少3種炎癥因子的表達(dá)。盡管炎癥因子在急性切口痛中發(fā)揮作用的機(jī)體機(jī)制尚待進(jìn)一步明確，但我們的研究結(jié)果說明星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43半通道可能通過調(diào)控炎癥介質(zhì)參與大鼠急性切口痛的發(fā)生。

綜上所述，鞘內(nèi)半通道抑制劑可明顯抑制脊髓背角Cx43表達(dá)和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎癥因子釋放，同時(shí)顯著提高切口痛大鼠的痛閾。這些研究結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43可能通過調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥微環(huán)境參與術(shù)后早期急性疼痛的發(fā)生。盡管Cx43半通道參與急性切口痛大鼠痛覺過敏的深入機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，但這些研究結(jié)果將為探尋術(shù)后急性痛新的治療靶點(diǎn)提供新的線索。