方向麗

（池州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)中心，安徽池州 247000）

茶葉為多年生木本植物，產(chǎn)茶區(qū)遍布15個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)），在南緯45°與北緯38°之間都可以種植。茶樹喜溫喜濕，適宜生長溫度為18～25℃，需要年降水量1 500 mm左右且分布均勻。一般朝晚有霧、相對(duì)濕度85%左右的地區(qū)，比較適宜茶樹生長。茶葉春、夏、秋季均可采摘，主要集中在春季。茶葉采摘季節(jié)多，病蟲害具有多、廣、復(fù)雜等特點(diǎn)。茶葉病害主要有茶餅病、茶炭疽病、茶赤星病等，蟲害主要有茶小綠葉蟬、葉蟬類害蟲、黑刺粉虱、茶蚜、象甲類等。如果不及時(shí)防治病蟲害，茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)大幅下降[1]。目前，茶樹病蟲害防治仍以化學(xué)防治為主。茶農(nóng)生態(tài)意識(shí)薄弱，未按相關(guān)規(guī)范合理用藥，導(dǎo)致茶葉中仍然存在農(nóng)藥殘留。90%以上農(nóng)藥殘留來自茶葉種植階段，種植階段農(nóng)藥使用種類繁多。農(nóng)藥用量和茶葉采摘期的差異使農(nóng)藥殘留量波動(dòng)范圍較廣，因而對(duì)檢測(cè)方法的線性范圍要求更寬。加工工藝方面，綠茶為不發(fā)酵茶，烏龍茶為輕發(fā)酵茶，紅茶和普洱茶為全發(fā)酵茶。加工過程特別是萎凋階段工藝不同使各類茶葉的內(nèi)含物質(zhì)差異較大。茶葉加工對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的影響主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：經(jīng)過加工后的茶葉組織間隙更小，對(duì)提取溶劑的滲透率要求高；加工后的茶葉水分大幅下降，糖類、茶多酚、氨基酸、咖啡堿等濃度上升，增加了后期去除干擾成分的難度；農(nóng)藥與部分茶葉內(nèi)含物質(zhì)可能存在相互作用。同時(shí)，一些茶葉內(nèi)含物質(zhì)對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)也有影響，如糖類、茶多酚、氨基酸等高沸點(diǎn)、難揮發(fā)的化合物在高溫下會(huì)污染進(jìn)樣口、錐孔等。一些茶葉提取物不僅會(huì)使高效液相色譜法檢查農(nóng)藥殘留出現(xiàn)干擾峰，增加定性、定量難度，還會(huì)增加高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的離子抑制效應(yīng)。檢測(cè)方法方面，目前茶葉農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法有氣相色譜法（GC）[2]、高效液相色譜法（HPLC）[3]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）[4]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[5-9]。氣相色譜法對(duì)于揮發(fā)性差、極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定的有機(jī)物檢測(cè)存在一定局限性[6]，高效液相色譜法難達(dá)到農(nóng)殘檢測(cè)要求的檢出限，氣相色譜法、高效液相色譜法可能會(huì)出現(xiàn)假陽性誤判，需要質(zhì)譜（MS）進(jìn)一步確認(rèn)[4]?；谝陨?，本研究選取15種茶葉種植中可能使用的農(nóng)藥，克服了茶葉提取物對(duì)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的離子抑制效應(yīng)，建立了一種準(zhǔn)確、可靠的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑。一般試劑包括乙酸（分析純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、蒸餾水、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、石墨化碳黑（GCB）、無水乙酸鈉、無水硫酸鎂；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括甲胺磷（CAS：10265-92-6）、滅多威（CAS：16752-77-5）、乙酰甲胺磷（CAS：30560-19-1）、多菌靈（CAS：10605-21-7）、甲萘威（CAS：63-25-2）、氧樂果（CAS：1113-02-6）、啶蟲脒（CAS：135410-20-7）、樂果（CAS：60-51-5）、滅線磷（CAS：13194-48-4）、吡蟲啉（CAS：138261-41-3）、噻蟲嗪（CAS：153719-23-4）、除蟲脲（CAS：35367-38-5）、三唑磷（CAS：24017-47-8）、丙溴磷（CAS：41198-08-7）、苯醚甲環(huán)唑（CAS：119446-68-3）等15種農(nóng)藥（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，1 000 mg/L）。

1.1.2 試驗(yàn)材料。試驗(yàn)材料包括0.5 mm玻璃均質(zhì)子，20～200、100～1 000 μL 移液槍，15、50 mL CNW 塑料具塞離心管，一次性5 mL注射器，0.22 μm微孔親水PTFE濾膜，2 mL進(jìn)樣瓶。

1.1.3 儀器及設(shè)備。具體有Waters Xevo TQ-S Micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配ESI離子源）、高速組織粉碎機(jī)、電子天平（精確度為0.01 g）、渦旋混合器、離心機(jī)、超聲波清洗機(jī)。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)條件

1.2.1 液相色譜條件。色譜柱類型為Waters BEH C18（2.1mm×100mm，1.7μm）；柱溫 40℃；流速 0.4mL/min；進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相A為0.05%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.05%甲酸乙腈，梯度洗脫程序見表1。

表1 超高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件。電離模式為電噴霧，在正離子模式下掃描，毛細(xì)管電壓為3000 V，離子源溫度為350℃，去溶劑氣流量為650 L/h，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）。

1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確吸取0.2 mL各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，置于-20℃冰箱中保存。

1.4 樣品前處理方法

1.4.1 制備。取500g茶樣，用粉碎機(jī)粉碎，過200 μm篩，充分混勻，密封并標(biāo)識(shí)，置于陰涼干燥處保存。

1.4.2 提取。準(zhǔn)確稱取2 g茶葉樣品于50 mL離心管中，加10 mL蒸餾水渦旋混勻，靜置30 min；加入3顆玻璃均質(zhì)子和20 mL含1%乙酸的乙腈溶液，渦旋混勻2 min；放入-20℃冰箱中冷凍10 min；從冰箱取出后，加入含有1 g乙酸鈉、4 g無水硫酸鎂的混合萃取填料，劇烈振搖30 s至充分混勻，8 000 r/min離心5 min，待凈化。

1.4.3 凈化。吸取4 mL經(jīng)1.4.2處理后的上清液于預(yù)先裝有 200 mg PSA、200 mg C18、60 mg GCB、600 mg MgSO4混合凈化填料的15 mL離心管中，劇烈振搖30 s后渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min之后，吸取1.0 mL上清液過0.22 μm濾膜裝進(jìn)樣瓶，待測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 提取方法及流動(dòng)相優(yōu)化。提取溶劑的選擇要考慮溶劑極性、農(nóng)藥特性和溶解性[10]。若茶葉含水量低于10%，在加入提取溶劑前需要加入適量水浸泡，浸泡后再用乙腈提取效率更高[7]?；诖?，本試驗(yàn)中采用2 g茶葉樣品添加10 mL蒸餾水渦旋混勻并靜置30 min。茶葉組織間隙小，對(duì)提取溶劑的提取效率要求高。乙腈滲透率強(qiáng)，與水互溶，鹽析作用下與水分離，能有效提取多種農(nóng)藥且對(duì)色素和油脂提取能力不強(qiáng)，添加少量酸可以減少部分農(nóng)藥的分解和調(diào)節(jié)pH值[8]，因而本研究采用1%乙酸乙腈作為提取溶劑?？紤]茶葉提取物會(huì)增加UPLC-MS/MS離子抑制效應(yīng)，在流動(dòng)相中添加了0.05%甲酸。15種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表2。

表2 15種農(nóng)藥質(zhì)譜分析參數(shù)

2.1.2 凈化條件優(yōu)化。茶葉中含有糖類、茶多酚、咖啡堿、色素、脂肪酸等多種化合物，其中茶多酚類和色素類化合物含量較高[9]，前處理較其他農(nóng)產(chǎn)品復(fù)雜。無水硫酸鎂能吸附提取溶劑中殘留的水分；PSA能吸附茶多酚，去除脂肪酸和有機(jī)酸，但脫色效果一般；C18能吸附糖類，有效去除低極性雜質(zhì)和高級(jí)脂肪酸酯類[5]，但對(duì)茶多酚吸附效果不明顯；GCB能吸附葉綠素、咖啡堿，但對(duì)平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥有吸附作用。在考慮凈化效果和保證回收率的前提下，采用了PSA、C18、GCB、MgSO4的混合凈化填料來去除干擾物。

2.2 方法準(zhǔn)確度及精密度

取1.3配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用茶葉空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，在0.02～0.50 mg/L濃度范圍內(nèi)，各目標(biāo)化合物的濃度值與響應(yīng)峰面積呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。按1.4前處理方法制作0.05、0.10、0.20 mg/kg 3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行。結(jié)果表明，各目標(biāo)化合物的回收率為72.1%～109.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%～9.2%，詳見表3。同時(shí)做樣品空白試驗(yàn)，得出空白基質(zhì)對(duì)15種目標(biāo)化合物無干擾。本方法的準(zhǔn)確度及精密度能夠滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。

表3 15種農(nóng)藥的回收率及精密度（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)茶葉中15種農(nóng)藥殘留。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、凈化效果好、靈敏度高，回收率為72.1%～109.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于10.0%，能夠滿足茶葉中農(nóng)藥殘留檢測(cè)要求。