張 雷，朱 衛(wèi)，黃 豫，蔣潔君

（昆山市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 昆山 215300）

氣血是人體維系正常生命活動(dòng)的根本，現(xiàn)代人常因飲食作息不規(guī)律、思慮勞神過度或久病不愈導(dǎo)致氣血生化失調(diào)，出現(xiàn)氣血兩傷的癥狀，主要表現(xiàn)為疲勞乏力、心悸氣短、盜汗失眠、面色淡白或萎黃[1]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣能生血，血能載氣，進(jìn)而氣推血行，令人體氣血充盈，機(jī)能恢復(fù)平和[2]。當(dāng)歸補(bǔ)血湯以黃芪和當(dāng)歸組方，是益氣生血的經(jīng)典名方。有研究[3]發(fā)現(xiàn)該方對(duì)糖尿病腎病、心腦血管疾病、肝臟疾病、免疫系統(tǒng)疾病等有多種共同作用靶點(diǎn)，但詳細(xì)機(jī)制尚不清晰。大棗作為氣血雙補(bǔ)的藥食兩用之物，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，兼具調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞和造血作用[4]；此外，大棗還能保護(hù)肝臟、增強(qiáng)體力[5]，可通過抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放發(fā)揮抗炎潛能[6]。當(dāng)歸芪棗精為我院臨床應(yīng)用多年的品種，由當(dāng)歸補(bǔ)血湯增加大棗而成，用于治療各類氣血兩虛證，但還缺乏作用機(jī)制的具體闡述，也未見有大棗發(fā)揮協(xié)同增效作用的文獻(xiàn)報(bào)道，有必要對(duì)其科學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行深入研究。

因此，為闡明當(dāng)歸芪棗精的組方合理性和科學(xué)作用機(jī)制，本研究選用腹腔注射環(huán)磷酰胺合并尾部放血的方法來建立氣血兩虛小鼠模型[1]，考察當(dāng)歸芪棗精以及拆方藥味對(duì)氣血兩虛證的干預(yù)作用，以期為開展經(jīng)方應(yīng)用研究提供一個(gè)全新視角[7]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)昆明種雄性小鼠24只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自卡文斯百格（蘇州）模式動(dòng)物研究有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0002；小鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房3 d，環(huán)境溫度控制在（26±2）℃，相對(duì)濕度為40%～70%，12 h/12 h光照晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠采用頸椎脫臼處死，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按動(dòng)物倫理要求進(jìn)行。

1.2 藥物與試劑 當(dāng)歸芪棗精（處方組成：黃芪26 g，當(dāng)歸13 g，大棗10 g）和芪歸組（處方組成：黃芪26 g，當(dāng)歸13 g）藥材經(jīng)昆山市中醫(yī)醫(yī)院吳學(xué)榮主任中藥師鑒定符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，由制劑室煎煮提取而成；注射用環(huán)磷酰胺（批號(hào)：H22026738）購(gòu)自上海華聯(lián)制藥有限公司；IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)：20210814006）、IL-1β ELISA試劑盒（批號(hào)：20210825112）、蘇木精/伊紅染料（批號(hào)：XRL3007）均購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；甲醛（批號(hào)：100100008）、二甲苯（批號(hào)：100234192）、無水乙醇（批號(hào)：100092680）、冰醋酸（批號(hào)：A35-500）、甘油（批號(hào)：A16205）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：01139728）購(gòu)自Fermentas公司；SYBR Green PCR試劑盒（批號(hào)：01305540）購(gòu)自Thermo公司。

1.3 主要儀器 XT2000i型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（上海Sysmex醫(yī)用電子有限公司）；TG-16M型低溫冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；352型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司）；AC8型洗板機(jī)（芬蘭Thermo Labsystems公司）；CX4型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；旋渦振蕩器（上海青浦滬西儀器廠）；FA25-D電動(dòng)勻漿機(jī)（上海FLUKO公司）；SQ2125石蠟切片機(jī)、PPTHK-21B攤片機(jī)（湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司）；D5100數(shù)碼相機(jī)（日本NIKON公司）。

1.4 造模與分組 24只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、芪歸組、當(dāng)歸芪棗精組，每組6只。參考文獻(xiàn)[1，8]建模方法，除對(duì)照組外，其余3組小鼠于給藥第1天每鼠尾部放血約0.5 mL，隔日放血1次，連續(xù)放血4次；于給藥第3天每鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，80 mg/kg（相當(dāng)于給藥體積為8 mL/kg），隔日注射1次，連續(xù)注射3次。對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。所有小鼠注射前均需禁食不禁水12 h。根據(jù)行為學(xué)及形態(tài)學(xué)相應(yīng)的測(cè)試指標(biāo)，若模型組大鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)、胸腺皮質(zhì)厚度、皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），則說明造模成功。

1.5 藥物制備及實(shí)驗(yàn)給藥 按處方配比，分別稱取當(dāng)歸芪棗精組（當(dāng)歸、黃芪和大棗）、芪歸組（當(dāng)歸、黃芪）藥物，加入8倍量水浸泡30 min，回流提取2 h，再加入6倍量水，回流提取1 h，過濾后合并藥液，以生藥量計(jì)，當(dāng)歸芪棗精組及芪歸組濃縮至質(zhì)量濃度分別為0.49、0.39 g/mL。對(duì)照組與模型組小鼠給予10 mL/kg生理鹽水灌胃；按照人和小鼠間體表面積折算的等效劑量比計(jì)算，芪歸組、當(dāng)歸芪棗精組的藥物劑量分別為5.07、6.37 g/（kg·d），連續(xù)7 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)[1]末次給藥后，各組小鼠尾部捆縛自身體質(zhì)量6%的不銹鋼絲，置于溫度（30±3）℃、深度40 cm水中，以鼠頭部10 s內(nèi)無法浮出水面為標(biāo)準(zhǔn)，記為其游泳終止時(shí)間，記錄入水至游泳終止的時(shí)長(zhǎng)，作為抗疲勞的體能指標(biāo)。

1.6.2 血常規(guī)和IL-6、IL-1β水平 末次給藥后，禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量。剪尾取血50 μL置于EDTA-3K抗凝管中，充分搖勻后于全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀中進(jìn)行分析，檢測(cè)WBC、RBC、PLT及HGB；取眼眶血靜置15 min，3 000 r/min離心20 min后，取血清，參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行IL-6、IL-1β的含量檢測(cè)。

1.6.3 胸腺皮質(zhì)厚度和皮質(zhì)細(xì)胞數(shù) 末次給藥24 h后，處死小鼠，取小鼠胸腺組織，用生理鹽水沖洗完整的胸腺，去除筋膜和脂肪組織，在顯微鏡下用測(cè)微尺測(cè)定胸腺皮質(zhì)厚度，并于最寬處和最窄處計(jì)算壓在測(cè)微尺基線上的細(xì)胞數(shù)，每只小鼠測(cè)5處，求平均值。

1.6.4 胸腺組織學(xué)觀察 末次給藥24 h后，脫頸椎處死小鼠并摘取胸腺，待樣本用福爾馬林溶液浸泡48 h后，用乙醇梯度脫水，經(jīng)二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、脫蠟流程后，再采取蘇木素染色、氨水溶液水化、伊紅復(fù)染、乙醇脫水和二甲苯透明，最后以中性樹膠封片，待干燥后在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，并進(jìn)行圖像采集分析[9]。

1.6.5 骨髓組織GM-CSF mRNA、EPO mRNA表達(dá)情況 取小鼠右側(cè)完整股骨，除凈軟組織，用2號(hào)注射器吸取3%的醋酸溶液5 mL，從股骨兩側(cè)反復(fù)沖洗，收集骨髓，勻漿30 s后加入700 μL Trizol裂解細(xì)胞，經(jīng)吹打混勻提取骨髓細(xì)胞總RNA，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹10]。分別按照逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作，在熒光定量PCR儀上反應(yīng)。反應(yīng)體系：SYBRGreen Mix（×2）5 μL，Primer F（10 μmol/L）0.1 μL，Primer R（10 μmol/L）0.1 μL，cDNA 2 μL，加水補(bǔ)齊至11 μL。引物序列見表1，以β-actin（GADPH）作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火及延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，結(jié)束后95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s做熔解曲線分析[11]。最后，對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分析。（見表1）

表1 PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)[12]，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)明顯縮短（P＜0.01）；與模型組比較，當(dāng)歸芪棗精組小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)明顯延長(zhǎng)（P＜0.05）；芪歸組小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)比較（）

表2 各組小鼠負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05

2.2 各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血液中WBC、RBC、PLT及HGB均明顯降低（P＜0.01），提示造模成功。與模型組比較，當(dāng)歸芪棗精組小鼠血液中WBC、RBC、PLT及HGB均明顯升高（P＜0.01)，芪歸組小鼠血液中PLT明顯升高（P＜0.05）；當(dāng)歸芪棗精組小鼠血液中WBC、RBC高于芪歸組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較（）

表3 各組小鼠血常規(guī)指標(biāo)比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與芪歸組比較，dP＜0.05

2.3 各組小鼠血清IL-6、IL-1β水平比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-6、IL-1β水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，芪歸組、當(dāng)歸芪棗精組小鼠血清IL-6、IL-1β水平均明顯升高（P＜0.01），且當(dāng)歸芪棗精組小鼠血清IL-6、IL-1β水平明顯高于芪歸組（P＜0.01或P＜0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠血清IL-6、IL-1β 水平比較（）

表4 各組小鼠血清IL-6、IL-1β 水平比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與芪歸組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

2.4 各組小鼠胸腺組織病理學(xué)變化情況 對(duì)照組小鼠胸腺組織皮質(zhì)、髓質(zhì)分界明顯，皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞排列整齊，髓質(zhì)區(qū)可見胸腺小體；模型組小鼠胸腺組織皮質(zhì)變薄，淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少、結(jié)構(gòu)間隙變大，有的細(xì)胞胞漿內(nèi)甚至有空泡存在，表明氣血兩虛小鼠模型造模成功[13]；當(dāng)歸芪棗精組小鼠胸腺組織皮質(zhì)、髓質(zhì)分界較為清晰，空泡現(xiàn)象得到扭轉(zhuǎn)，細(xì)胞密度有所增加；芪歸組小鼠胸腺組織病變結(jié)構(gòu)雖有一定改善，但皮質(zhì)、髓質(zhì)分界仍較模糊，細(xì)胞間隙仍未愈合完全[14]。（見圖1）

圖1 各組小鼠胸腺組織病理切片圖（HE，×200）

與對(duì)照組比較，模型組小鼠胸腺皮質(zhì)厚度、皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，芪歸組、當(dāng)歸芪棗精組小鼠胸腺皮質(zhì)厚度、皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)均明顯增加（P＜0.01），且當(dāng)歸芪棗精組小鼠胸腺皮質(zhì)厚度、皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)明顯高于芪歸組（P＜0.01）。（見表5）

表5 各組小鼠小鼠胸腺皮質(zhì)厚度、皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較（）

表5 各組小鼠小鼠胸腺皮質(zhì)厚度、皮質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與芪歸組比較，cP＜0.01

2.5 各組小鼠骨髓組織GM-CSF mRNA、EPO mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠骨髓組織GM-CSF mRNA、EPO mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，當(dāng)歸芪棗精組小鼠骨髓組織GM-CSF mRNA、EPO mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.01），且當(dāng)歸芪棗精組骨髓組織GM-CSF mRNA、EPO mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于芪歸組（P＜0.05）。（見表6、圖2）

圖2 PCR 擴(kuò)增曲線

表6 各組小鼠骨髓組織中GM-CSF mRNA、EPO mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

表6 各組小鼠骨髓組織中GM-CSF mRNA、EPO mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01；與芪歸組比較，cP＜0.05

3 討論

氣血是人體正常運(yùn)行的根本，氣虛則血虧，血虛則氣散，兩者相輔相成，臨床上發(fā)生病變時(shí)多演變?yōu)闅庋獌商?，故治療時(shí)常治以補(bǔ)血益氣之法，取“氣能生血，血能載氣”之理。氣血兩虛證可能會(huì)出現(xiàn)在不同的疾病中，根據(jù)中醫(yī)“異病同治”的辨證論治原則，在治療時(shí)都可以采用補(bǔ)益氣血的方法，但方劑配伍卻各有側(cè)重。當(dāng)歸、黃芪為常用中藥[15]，這體現(xiàn)了養(yǎng)血、補(bǔ)氣的基本治則，而大棗則兼具兩者之功，三者配伍是否有協(xié)同增效作用值得探討。故本研究采用放血聯(lián)合注射環(huán)磷酰胺的方法成功建立氣血兩虛證小鼠模型，用拆方手段來考察大棗對(duì)于當(dāng)歸芪棗精的作用，探究其是否有助于提升氣血、促進(jìn)造血功能和改善微循環(huán)等藥理作用[1]。

本研究表明，當(dāng)歸芪棗精能顯著改善氣血兩虛小鼠胸腺的病理形態(tài)，能有效緩解胸腺皮質(zhì)變薄，使細(xì)胞間隙緊密，顯著增加淋巴細(xì)胞數(shù)量。為考量小鼠抗疲勞能力，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用經(jīng)典的負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)來直觀反映小鼠肌肉運(yùn)動(dòng)能力，結(jié)果顯示當(dāng)歸芪棗精可延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間，發(fā)揮了抗疲勞作用，起到了補(bǔ)氣的效果[16]。作為一種多能造血干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，IL-1β能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放集落刺激因子，促進(jìn)骨髓原始造血細(xì)胞集落增殖，還與其誘生的細(xì)胞因子協(xié)同刺激促成血細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)IL-1β能通過加速細(xì)胞循環(huán)促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞的生存，對(duì)機(jī)體造血起正調(diào)節(jié)作用，其含量的動(dòng)態(tài)變化直接反映了骨髓造血功能的強(qiáng)弱[17]。細(xì)胞因子IL-6則由IL-1β誘生，能發(fā)揮多重免疫調(diào)節(jié)功能[18]。病理早期IL-6分泌量的增加會(huì)激發(fā)多種炎癥因子的瀑布式釋放，由此形成的炎癥反應(yīng)會(huì)損傷組織細(xì)胞，但此后IL-6則充當(dāng)起系統(tǒng)性宿主防御反應(yīng)的協(xié)調(diào)員，通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化、聚集起到增強(qiáng)免疫的作用[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸芪棗精通過同步上調(diào)小鼠血清中IL-1β和IL-6的表達(dá)，協(xié)同促進(jìn)機(jī)體造血，還可有效發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，且當(dāng)歸芪棗精組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于芪歸組。

骨髓是血液生成的主要場(chǎng)所，外周血中RBC、WBC、PLT、HGB等客觀指標(biāo)則能間接反映其造血狀態(tài)。GM-CSF具有廣譜效應(yīng)，這種多肽生長(zhǎng)因子對(duì)早期造血祖細(xì)胞增殖具有廣泛促進(jìn)活性，但有賴于骨髓基質(zhì)細(xì)胞提供分泌場(chǎng)所；EPO則是一種激素糖蛋白，能特異性作用于紅系祖細(xì)胞進(jìn)而刺激骨髓造血，可與GM-CSF產(chǎn)生協(xié)同作用，可增加紅細(xì)胞、多能干細(xì)胞集落的形成。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立放血和CTX誘導(dǎo)的氣血兩虛小鼠模型，檢測(cè)骨髓部位的GM-CSF mRNA、EPO mRNA表達(dá)，以探討造血機(jī)能的變化。研究結(jié)果顯示，CTX損害了小鼠骨髓的造血機(jī)能，導(dǎo)致RBC、WBC、PLT和HGB含量的顯著減少，抑制了GM-CSF mRNA、EPO mRNA的表達(dá)，出現(xiàn)了貧血癥狀。結(jié)果顯示，當(dāng)歸芪棗精明顯改善了氣血兩虛模型小鼠的血象，且能全面提高RBC、WBC、PLT和HGB含量，促進(jìn)GM-CSF mRNA、EPO mRNA的表達(dá)，具有改善血虛的作用，但芪歸組療效明顯低于當(dāng)歸芪棗精組，僅PLT指標(biāo)有所上升?？梢?，當(dāng)歸芪棗精可以促進(jìn)受到抑制的小鼠骨髓造血祖細(xì)胞的增殖，使GM-CSF、EPO表達(dá)明顯上調(diào)[20]，提示其可能通過多途徑、多靶點(diǎn)刺激機(jī)體多種造血生長(zhǎng)因子分泌，進(jìn)而促進(jìn)骨髓造血功能損傷的恢復(fù)，從而發(fā)揮其“補(bǔ)血”功效[21]。此外，與芪歸組比較，當(dāng)歸芪棗精的提升作用更為顯著。

綜上所述，當(dāng)歸芪棗精對(duì)氣血兩虛的改善作用可能是通過修復(fù)受損胸腺，增加淋巴細(xì)胞的數(shù)量，上調(diào)血清中IL-6、IL-1β的表達(dá)，從而增強(qiáng)小鼠免疫能力，促進(jìn)體力恢復(fù)；當(dāng)歸芪棗精還可有效改善血象，增強(qiáng)小鼠骨髓中EPO mRNA、GM-CSF mRNA的表達(dá)；這可能是其促進(jìn)造血，發(fā)揮補(bǔ)血功效的機(jī)制之一[22]。當(dāng)歸芪棗精對(duì)小鼠氣血兩虛體征的改善，為進(jìn)一步闡明當(dāng)歸芪棗精的多途徑、多靶點(diǎn)作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。