趙瀚微，陳文閣

（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

糖尿病腎臟?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病導致的微血管并發(fā)癥，也是一種高糖引發(fā)的炎性疾病，可累及腎小管、腎小球、腎間質、血管等多種腎臟結構，造成腎小球萎縮硬化、腎間質病變等腎組織損傷，最終可演化為腎衰竭，是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1-2]。高血糖可通過引起氧化應激和炎癥反應導致腎毒性[3-4]。整合素連接激酶（Integrinlinked kinase，ILK）是連接細胞外基質與細胞內(nèi)信號的一種支架蛋白，參與介導腎損傷過程。敲除ILK基因可減輕腎組織損傷，延緩腎臟疾病進展[5]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是ILK下游調控因子，可被ILK正向調控而顯著降低自身磷酸化水平，進而有效抑制高血糖引發(fā)的腎臟炎癥，改善DN小鼠腎功能[6-7]。因而，ILK/MAPK有望成為DN的潛在治療靶點。大黃素是中藥大黃含有的一種天然蒽醌衍生物，有較強的抗炎活性，可顯著抑制炎癥相關因子產(chǎn)生，減輕DN大鼠蛋白尿排泄、腎小管間質損傷等腎損傷癥狀[8-9]，但ILK/MAPK是否是其藥理機制之一，目前尚不清楚。本研究擬通過建立DN大鼠模型，對此進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞 6周齡SPF級雄性SD大鼠76只，體質量180～230 g，購自上海靈暢生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0003。分籠飼養(yǎng)在本院動物中心動物房內(nèi)，通風良好，相對濕度：50%～55%，溫度：22～26 ℃，照明：12 h/12 h明暗交替，噪聲≤80 dB。本實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學實驗動物倫理管理委員會批準。

人腎小管上皮細胞HK-2（貨號：MJ-1324）購自上海名勁生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 鹽酸二甲雙胍片（國藥準字H20023371，批號：20200110）購自中美上海施貴寶制藥有限公司；大黃素（純度≥98%，批號：20190721）、Opti-MEM培養(yǎng)基（批號：1438121）、HE染色試劑盒（批號：136612）、大鼠白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）ELISA試劑盒（批號：14623）、脂質體2000（批號：17832）均購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA試劑盒（批號：173290）購自上海木欒科技有限公司；ILK過表達質粒、ILK空載質粒購自上海吉瑪基因有限公司；鏈脲佐菌素（批號：20219823）購自上海明萱生物科技有限公司；兔源ILK抗體（批號：163921-28）、兔源β-actin抗體（批號：165271-84）、兔源p38 MAPK抗體（批號：182538-29）、兔源p-p38 MAPK抗體（批號：182792-93）均購自美國Abcam公司；無水D-葡萄糖（批號：1273927）、DMEM培養(yǎng)基（批號：1281622）、BCA蛋白質定量檢測試劑盒（批號：1735239）、特級胎牛血清（批號：1736283）、CCK-8試劑盒（批號：1827253）、RIPA裂解液（批號：12712588）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 主要儀器 BIOSEN C_Line型血糖儀（北京德?？悼瀑Q(mào)有限公司）；酶標儀（珀金埃爾默企業(yè)管理有限公司）；BS-280型全自動生化分析儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；DSX100型光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；CM1860 UV型冷凍切片機（德國Leica公司）；Tanon 4600型全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；VE 186型轉移電泳槽（上海天能科技有限公司）；EPS300型電泳儀（上海天能科技有限公司）；VE 180型微型垂直電泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.4 動物實驗造模與分組 76只SD雄性大鼠中取64只按參照文獻[10]制備DN模型：以0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液溶解鏈脲佐菌素，配成6 mg/mL的儲備液，以60 mg/kg的劑量于大鼠腹腔注射，72 h后測量大鼠空腹血糖。血糖>16.7 mmol/L時，提示模型建立成功，其中60只造模成功，造模成功率93.8%（60/64）。將造模成功的DN大鼠采用隨機數(shù)字表法分為模型組、二甲雙胍組、大黃素低劑量組、大黃素中劑量組、大黃素高劑量組，每組12只。另取12只大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，作為假手術組。

1.5 動物實驗給藥及標本采集 將鹽酸二甲雙胍片研碎，用生理鹽水配置成14 mg/mL的二甲雙胍溶液[11]，大黃素用生理鹽水配置成1、2.5、5 mg/mL的大黃素溶液[12]。二甲雙胍組和大黃素低、中、高劑量組大鼠均以10 mL/kg的劑量灌胃給藥，模型組和假手術組灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，共給藥21 d。

末次給藥后，用代謝籠收集大鼠24 h尿液，麻醉處死后，解剖取出大鼠腎臟，以手術剪剪下約0.4 g腎組織，剪成小方塊后，加入RIPA裂解液勻漿，4 ℃離心后，將上清吸出，分組標記后保存在-80 ℃冰箱。

1.6 動物實驗觀察指標

1.6.1 24 h尿蛋白含量、血清肌酐（Serum creatinine，Scr）水平 在末次灌胃治療后，馬上用代謝籠收集大鼠24 h尿液，然后過量麻醉處死大鼠，自腹主動脈采血，4 ℃離心后吸出上清液，通過全自動生化分析儀測量出24 h尿蛋白定量及血清Scr水平。剩余血清分組標記后保存在-80 ℃冰箱。

1.6.2 大鼠腎組織病理形態(tài)改變 大鼠腎組織經(jīng)包埋后，放入液氮中凍成塊，用冷凍切片機對其做連續(xù)病理切片，復溫后浸沒入預冷的丙酮中固定，取出以試劑盒做HE染色、漂洗、脫水、透明后封片，使用光學顯微鏡觀察腎組織病理形態(tài)變化，并任意采集5個視野圖片。

1.6.3 大鼠血清IL-17、iNOS水平 取出保存于-80 ℃冰箱的大鼠血清，提前放入4 ℃冰箱中緩慢解凍，然后以用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測血清中IL-17、iNOS水平，具體步驟按照說明書進行操作。

1.6.4 大鼠腎組織ILK/MAPK通路相關蛋白表達 提前取出上述保存在-80 ℃冰箱的腎組織蛋白樣品液以冰水浴緩慢解凍，使用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將各組蛋白濃度調至相等，加入適量上樣緩沖液煮沸，5 min后蛋白變性，取出快速離心后混勻。各組取20 μL蛋白樣品加入SDS-PAGE濃縮凝膠樣品孔中，120 V恒壓電泳75 min，40 mA穩(wěn)流濕轉60 min，以5%脫脂牛奶封閉膜上蛋白非特異位點，裁下ILK、β-actin、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白所在的膜，以相應兔源一抗（1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（1∶2 000稀釋），常溫孵育2 h，洗膜，增強化學發(fā)光顯色，拍照，運用Image-J軟件定量蛋白條帶灰度，做統(tǒng)計分析后得到各組蛋白相對表達量。

1.7 細胞實驗造模與分組 快速復蘇人腎小管上皮細胞HK-2，以DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清）混勻后，接種在培養(yǎng)瓶，無菌培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)12 h后，隨機分為對照組、模型組、大黃素組、ILK過表達質粒組、ILK空載質粒組、大黃素+ILK過表達質粒組。

1.8 細胞實驗給藥 對照組不做處理，其余各組均以30 mmol/L的葡萄糖[13]誘導建立高糖損傷細胞模型，造模同時參照說明書，以脂質體2000分組轉染質粒，同時以10 μmol/L大黃素處理大黃素[14]組、大黃素+ILK過表達質粒組細胞，各組細胞均處理24 h。

1.9 細胞實驗觀察指標

1.9.1 測定細胞活力 將人腎小管上皮細胞HK-2傳代后接種在96孔板，細胞貼壁生長12 h后，隨機分為對照組、模型組、大黃素組、ILK過表達質粒組、ILK空載質粒組、大黃素+ILK過表達質粒組，每組6個孔，按“1.8”中方法分組處理人腎小管上皮細胞HK-2，另選6個孔不接種細胞，作為空白組，24 h后棄去培養(yǎng)基，加入含適量CCK-8試劑的新培養(yǎng)基，無菌培養(yǎng)1 h后，測出各孔吸光度，計算出各組細胞活力。細胞活力（%）=（實驗組吸光度-空白組吸光度）/（對照組吸光度-空白組吸光度）×100%。

1.9.2 細胞上清中IL-17、iNOS水平 傳代HK-2細胞接種在24孔板，貼壁生長12 h后，隨機分為對照組、模型組、大黃素組、ILK過表達質粒組、ILK空載質粒組、大黃素+ILK過表達質粒組，按照“1.8”中方法分組處理24 h后，收集各組細胞沉淀及細胞培養(yǎng)基，離心取上清液，然后用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測IL-17、iNOS水平，具體步驟按照說明書進行操作。

1.9.3 細胞ILK/MAPK通路相關蛋白表達 于上述收集的各組細胞中加入RIPA裂解液，提取出總蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將各組蛋白濃度調至相等，加入適量上樣緩沖液煮沸，5 min后蛋白變性，取出快速離心后混勻，各組取20 μL蛋白樣品加入SDS-PAGE濃縮凝膠樣品孔中，電泳（120 V恒壓，75 min），濕轉（40 mA穩(wěn)流，60 min），以5%脫脂牛奶封閉膜上蛋白非特異位點，裁下ILK、β-actin、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白所在的膜，以相應兔源一抗（1∶1 000稀釋）4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗（1∶2 000），常溫孵育2 h，洗膜，增強化學發(fā)光顯色，拍照，運用Image-J軟件定量蛋白條帶灰度，做統(tǒng)計分析后得到各組蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，通過Bonferroni法進行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠24 h尿蛋白定量和血清Scr水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白定量和血清Scr水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠24 h尿蛋白定量和血清Scr水平均明顯降低（P＜0.05），且大黃素各劑量組呈劑量依賴性。大黃素高劑量組大鼠24 h尿蛋白定量和血清Scr水平與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠24 h 尿蛋白定量和血清Scr 水平比較（）

表1 各組大鼠24 h 尿蛋白定量和血清Scr 水平比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與大黃素低劑量組比較，cP＜0.05；與大黃素中劑量組比較，dP＜0.05

2.2 各組大鼠腎組織病理改變情況 假手術組大鼠腎組織無病理損傷，形態(tài)完好；模型組大鼠腎組織呈現(xiàn)明顯病理損傷，具體表現(xiàn)為系膜增生，腎小球體積增大，間質水腫充血，有明顯炎癥淋巴細胞浸潤；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組大鼠腎組織病理損傷均有不同程度減輕，且大黃素劑量越高，病理損傷減輕程度越大；大黃素高劑量組與二甲雙胍組大鼠腎組織腎小球形態(tài)結構正常，腎皮質與腎髓質組織邊界清，未見明顯炎癥反應。（見圖1）

圖1 各組大鼠腎組織病理切片圖（HE，×400）

2.3 各組大鼠血清IL-17、iNOS水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清IL-17、iNOS水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠血清IL-17、iNOS水平均明顯降低（P＜0.05），且大黃素各劑量組呈劑量依賴性；大黃素高劑量組大鼠血清IL-17、iNOS水平與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清IL-17、iNOS 水平比較（）

表2 各組大鼠血清IL-17、iNOS 水平比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與大黃素低劑量組比較，cP＜0.05；與大黃素中劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組大鼠腎組織ILK/MAPK通路相關蛋白相對表達量比較 與假手術組比較，模型組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），且大黃素各劑量組呈劑量依賴性；大黃素高劑量組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖2、表3）

圖2 各組大鼠腎組織ILK/MAPK 通路相關蛋白表達免疫印跡圖

表3 各組大鼠腎組織ILK/MAPK 通路相關蛋白相對表達量比較（）

表3 各組大鼠腎組織ILK/MAPK 通路相關蛋白相對表達量比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與大黃素低劑量組比較，cP＜0.05；與大黃素中劑量組比較，dP＜0.05

2.5 各組細胞活力比較 與對照組比較，模型組HK-2細胞活力明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素組HK-2細胞活力明顯升高（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞活力明顯降低（P＜0.05）；與ILK空載質粒組比較，大黃素組HK-2細胞活力明顯升高（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞活力明顯降低（P＜0.05）；與大黃素+ILK過表達質粒組比較，大黃素組HK-2細胞活力明顯升高（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞活力明顯降低（P＜0.05）；大黃素+ILK過表達質粒組HK-2細胞活力與ILK空載質粒組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見表4）

表4 各組HK-2 細胞活力比較（，n=6）

表4 各組HK-2 細胞活力比較（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與大黃素+ILK過表達質粒組比較，cP＜0.05；與ILK空載質粒組比較，dP＜0.05

2.6 各組細胞IL-17、iNOS水平比較 與對照組比較，模型組HK-2細胞IL-17、iNOS水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素組HK-2細胞IL-17、iNOS水平均明顯降低（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞IL-17、iNOS水平均明顯升高（P＜0.05）；與ILK空載質粒組比較，大黃素組HK-2細胞IL-17、iNOS水平均明顯降低（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞IL-17、iNOS水平均明顯升高（P＜0.05）；與大黃素+ILK過表達質粒組比較，大黃素組HK-2細胞IL-17、iNOS水平均明顯降低（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞IL-17、iNOS水平均明顯升高（P＜0.05）；大黃素+ILK過表達質粒組HK-2細胞IL-17、iNOS水平與ILK空載質粒組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見表5）

表5 各組HK-2 細胞IL-17、iNOS 水平比較（，n=6）

表5 各組HK-2 細胞IL-17、iNOS 水平比較（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與大黃素+ILK過表達質粒組比較，cP＜0.05；與ILK空載質粒組比較，dP＜0.05

2.7 各組細胞ILK/MAPK通路相關蛋白相對表達量比較 與對照組比較，模型組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，大黃素組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與ILK空載質粒組比較，大黃素組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與大黃素+ILK過表達質粒組比較，大黃素組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），ILK過表達質粒組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；大黃素+ILK過表達質粒組HK-2細胞p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量與ILK空載質粒組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見圖3、表6）

圖3 各組HK-2 細胞ILK/MAPK 通路相關蛋白表達免疫印跡圖

表6 各組HK-2 細胞ILK/MAPK 通路相關蛋白相對表達量比較（，n=6）

表6 各組HK-2 細胞ILK/MAPK 通路相關蛋白相對表達量比較（，n=6）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與大黃素+ILK過表達質粒組比較，cP＜0.05；與ILK空載質粒組比較，dP＜0.05

3 討論

糖尿病是我國的第一大代謝性疾病，而DN作為其主要的并發(fā)癥之一，可引發(fā)患者進行性腎功能不全，隨病情進展會造成終末期腎病，導致患者死亡[15-17]。DN發(fā)病機制涉及多方面的病理生理過程，目前普遍認為，炎癥、氧化應激是其關鍵病理機制，其中，減輕炎癥在DN治療方法中具有良好前景[18-19]。本研究通過腹腔注射60 mg/kg的鏈脲佐菌素誘導構建DN大鼠模型，結果顯示大鼠在注射鏈脲佐菌素后，24 h尿蛋白定量、血清Scr、IL-17、iNOS水平均明顯升高，表明鏈脲佐菌素可誘導炎性介質大量表達，引發(fā)劇烈炎癥反應，造成其腎組織發(fā)生明顯的病理損傷改變，具體表現(xiàn)為系膜增生，腎小球體積增大，間質水腫充血，有明顯炎癥淋巴細胞浸潤，提示DN模型建立成功。

大黃素分離自蓼科植物虎杖和掌葉大黃的根莖，具有天然抗炎、抗氧化活性，可減輕高血糖導致的腎組織炎性損傷，改善DN小鼠蛋白尿癥狀，緩解腎組織病理損傷，起到腎功能保護作用[20-21]。本研究以低、中、高劑量大黃素治療DN大鼠，可減少血清Scr、IL-17、iNOS的產(chǎn)生，降低其尿蛋白排泄量，減輕腎組織病理損傷，進一步證實了大黃素對DN的治療作用。但其藥理機制目前尚未有明確闡釋。有研究發(fā)現(xiàn)，ILK參與介導腎臟疾病的發(fā)生及進展過程，下調ILK基因表達可改善腎組織損傷[5]。另外，ILK通過促進p38 MAPK磷酸化而引起炎癥反應的發(fā)生發(fā)展[22]，抑制其磷酸化可顯著改善DN小鼠腎臟炎癥產(chǎn)生及進展[7]。因而推測，ILK/MAPK可能是大黃素治療DN的藥理機制之一。本研究動物實驗結果顯示，DN大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、ILK蛋白相對表達量明顯升高，大黃素可阻止上述變化，改善DN大鼠腎損傷癥狀。本研究細胞實驗結果顯示，大黃素可下調ILK蛋白表達，降低p38 MAPK磷酸化水平，減少高糖誘導的炎癥因子生成，抑制炎癥及腎小管上皮細胞HK-2凋亡，從細胞水平上證明了大黃素對DN的防治功效。另外，轉染ILK過表達質粒，上調HK-2細胞ILK表達，可減弱大黃素的上述功效，逆轉其對高糖誘導的HK-2細胞的保護作用，表明大黃素不僅可通過減輕炎癥而改善DN大鼠腎損傷，還可通過抑制ILK/MAPK信號，降低促炎因子表達水平，減輕炎癥，緩解高糖引發(fā)的腎小管上皮細胞凋亡損傷。

綜上所述，大黃素可下調ILK表達，減弱p38 MAPK磷酸化，減少炎性介質生成，阻礙炎癥發(fā)生及進展，減輕高糖引發(fā)的腎小管上皮細胞凋亡及腎組織損傷，修復腎功能。其中，抑制ILK/MAPK信號傳導可能是其發(fā)揮上述藥理功效的分子機制之一。本研究為大黃素的臨床推廣應用提供了新的參考，但本研究中關于其作用機制的研究還存在一定不足，后續(xù)會通過動物回歸實驗進行深入探討。