張 艷，尚春光，張亞楠，劉西建

（山東中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，山東 濟南 250355）

“失眠第一方”半夏秫米湯由半夏。秫米組成。半夏辛溫，燥濕化痰安神，是臨床治療失眠常用藥[1]。秫米，張錫純云“秫米即蘆稷之米（俗名高粱）”，臨床亦有不少醫(yī)家認為是高粱[2]?！吨腥A本草》曰：“高粱，甘澀溫，健脾止瀉，化痰安神?！痹街卸幱昧勘壤秊?∶2，現(xiàn)代臨床常用此方加味治療各型失眠，效果良好。前期實驗研究[3]證實了該方的鎮(zhèn)靜、催眠作用。原方所用半夏實為生半夏[4]，臨床不少醫(yī)家認為不會引起不良反應[5]，但礙于生半夏之毒，臨床亦有許多醫(yī)家改用法半夏[6-7]。鑒于半夏不同炮制品的半夏秫米湯毒性研究尚未見報道，本研究就生半夏與法半夏組成的半夏秫米湯的急性毒性進行探討，以期為臨床應用和實驗研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2個月齡SPF級健康昆明小鼠120只，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，購于濟南市朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證編號：N0.37009200014164。實驗動物使用許可證號：SYXK（魯）2017-0022，動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度為20～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗周期，自由攝食、飲水。本研究方案符合國家實驗動物倫理的相關指導原則[8]，通過山東中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準號：SDUTCM20201216001。

1.2 藥物與試劑 生半夏、法半夏飲片均購自鄭州瑞龍制藥股份有限公司，高粱購自山東鶴來香食品有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學中藥鑒定室的劉紅燕教授鑒定，生半夏、法半夏均為天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.干燥的塊莖，高粱乃禾本科植物高粱Sorghum vulgare Pers種仁。

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）試劑盒（批號：200706KE4）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號：200706KE3）、肌酐（creatinine，CrE）試劑盒（批號：200706KE6）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號：200706KE5）均購自江蘇晶美生物科技有限公司；石蠟（批號：YA0013）、伊紅（批號：E8090）、蘇木素（批號：G1140）均購自solarbio公司；無水乙醇（批號：10009218）、碳酸鋰（批號：20022818）、冰醋酸（批號：10000218）均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器 WT11001R型電子天平（江蘇省常州市萬得天平儀器廠）；GNP-908型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；352型酶標分析儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS）；BC-2800vet型全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；TKD-TSF型自動組織脫水機、TKD-TK型攤片烤片機（湖北康強醫(yī)療器械有限公司）；TB-718L型生物組織包埋機（泰維科技實業(yè)股份有限公司）；RM2235型石蠟切片機、DM1000型白光顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）。

1.4 半夏秫米湯的制備 生半夏秫米湯與法半夏秫米湯方中的半夏與高粱用量均按1∶2稱取，加8倍體積冷水浸泡1 h，加熱煮沸后煎煮1 h，減壓低溫50 ℃濃縮，濃縮至生藥濃度為3 g/mL水煎液，置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動物分組 將120只小鼠按隨機數(shù)字表法分為生半夏秫米湯組、法半夏秫米湯組、空白組，每組40只，均雌雄各半。

1.6 實驗給藥 根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》（編號：[Z]GPT2-1），采用最大給藥量試驗，24 h內(nèi)3次灌胃給藥。給藥前12 h及給藥期間禁食不禁水，以藥物最大生藥濃度3 g/mL水煎液，小鼠最大給藥體積為0.4 mL/10 g灌胃給藥，24 h內(nèi)給藥3次，每次間隔3 h?？瞻捉M小鼠灌胃給予等量生理鹽水。

1.7 觀察指標

1.7.1 一般情況 第1天密切觀察小鼠每次給藥后1 h情況，觀察動物皮毛、飲食、進水、運動、眼瞼指征、呼吸、分泌物和排泄物等，之后每天觀察1次，連續(xù)14 d。記錄動物出現(xiàn)中毒反應的開始時間、中毒癥狀、嚴重程度及持續(xù)時間等。

1.7.2 體質(zhì)量 每組小鼠給藥前稱體質(zhì)量，給藥后第14天對剩余20只小鼠稱體質(zhì)量。

1.7.3 死亡情況 觀察并記錄各組小鼠死亡情況，記錄死亡時間、瀕死前反應。對出現(xiàn)瀕死及死亡的小鼠，立即進行大體解剖，肉眼觀察腦、肺臟、心臟、胃、肝臟、脾臟、腎臟等主要臟器的體積、顏色、質(zhì)地的變化。

1.7.4 ELISA法檢測血清ALT、AST、CrE、BUN含量 實驗第2天，各組隨機抽取20只小鼠（雌雄各半），摘眼球取血，ELISA法檢測血清ALT、AST、CrE、BUN含量。第14天，將剩余的各組全部小鼠按上述方法檢測。

1.7.5 全自動血液細胞分析儀檢測血常規(guī) 按照“1.7.4”方法取血后，分別于實驗第2天、第14天檢測血漿中白細胞計數(shù)（WBC）、淋巴細胞計數(shù)（Lymph）、淋巴細胞百分比（Lymph%）、單核細胞計數(shù)（Mon）、單核細胞百分比（Mon%）、中性粒細胞計數(shù)（Neu）、中性粒細胞百分比（Neu%）、血紅蛋白含量（HGB）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、平均紅細胞體積（MCV）、紅細胞壓積（HCT）、平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、紅細胞分布寬度（RDW）、血小板計數(shù)（PLT）、血小板分布寬度（PDW）、血小板壓積（PCT）、平均血小板體積（MPV），共計18個項目。

1.7.6 臟器觀察及組織病理學檢測 實驗第2天，將取血后的小鼠脫頸椎處死，先進行大體解剖，肉眼觀察胸腔、腹腔是否存在積液、是否光滑；觀察主要臟器及腺體體積、色澤、質(zhì)地的變化；然后取出腦、肺臟、心臟、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟、胃，用4%多聚甲醛固定、沖洗后，進行脫水石蠟包埋，切片、展片、烤片、HE染色；顯微鏡下觀察上述器官組織實質(zhì)細胞有無變性、壞死，間質(zhì)有無水腫、充血、炎癥細胞浸潤，有無纖維組織增生等。14 d觀察期結束后，將每組剩余小鼠按照上述同樣方法進行觀察與檢測。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般觀察 給藥后1 h及給藥后14 d期間，空白組、生半夏秫米湯組、法半夏秫米湯組小鼠的精神狀態(tài)、行為、皮毛、眼瞼指征、呼吸、分泌物、排泄物等均未發(fā)現(xiàn)異常變化。

2.2 死亡情況 實驗期間無小鼠死亡。

2.3 各組小鼠體質(zhì)量比較 給藥前，空白組、生半夏秫米湯組、法半夏秫米湯組小鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；實驗第14天，3組小鼠體質(zhì)量均較給藥前有所增長，但3組小鼠間體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖1）

圖1 各組小鼠體質(zhì)量比較（）

2.4 各組小鼠血清ALT、AST、CrE、BUN含量比較 實驗第2天，與空白組比較，生半夏秫米湯組、法半夏秫米湯組小鼠血清ALT、AST、CrE、BUN含量均明顯升高（P＜0.01）；與生半夏秫米湯組比較，法半夏秫米湯組小鼠血清AST含量明顯升高（P＜0.01），ALT含量明顯降低（P＜0.01）；法半夏秫米湯組小鼠血清CrE、BUN含量與生半夏秫米湯組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見圖2）

圖2 實驗第2 天各組小鼠血清ALT、AST、CrE、BUN 含量比較（，n=20）

實驗第14天，與空白組比較，生半夏秫米湯組、法半夏秫米湯組小鼠血清ALT、AST、CrE、BUN含量均明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；與生半夏秫米湯組比較，法半夏秫米湯組小鼠血清ALT、AST、CrE、BUN含量均明顯升高（P＜0.01）。（見圖3）

圖3 實驗第14 天各組小鼠血清ALT、AST、CrE、BUN 含量比較（，n=20）

2.5 各組小鼠血常規(guī)比較 實驗第2天，與空白組比較，生半夏秫米湯組小鼠HCT明顯升高（P＜0.05），3組小鼠間其余17項指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見圖4）

圖4 實驗第2 天各組小鼠血常規(guī)比較（，n=20）

實驗第14天，與空白組比較，法半夏秫米湯組小鼠RDW明顯升高（P＜0.05），3組小鼠間其余17項指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（見圖5）

圖5 實驗第14 天各組小鼠血常規(guī)比較（，n=20）

2.6 臟器觀察及組織病理學檢查 實驗第2天及第14天各組小鼠胸腔、腹腔漿膜光滑、無積液，各重要臟器體積、色澤、質(zhì)地均未見異常。

病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，各組小鼠胸腺均未見異常變化，皮質(zhì)、髓質(zhì)的比例正常，皮質(zhì)區(qū)可見淋巴細胞均勻分布，髓質(zhì)區(qū)未見異常變化；脾臟的組織結構正常，被膜無增厚而完整，脾竇未見擴張，脾小體未見異常改變，紅白髓比例正常；心臟組織結構未見異常變化，可見排列整齊的心肌纖維，卵圓形核居中，間質(zhì)內(nèi)血管未見擴張或狹窄的異常變化，未見炎癥細胞浸潤；肺臟組織結構未見與藥物有關的異常變化，各級支氣管結構無異常，肺泡腔未見擴張或縮小的異常改變，未見炎癥細胞浸潤，間質(zhì)血管未見擴張或狹窄；腦組織學檢查無異常，未見異常形態(tài)的神經(jīng)細胞，未見到小膠質(zhì)細胞的增生及血管擴張，間質(zhì)均勻；胃組織檢查未見異常變化，胃黏膜無明顯變化，胃黏膜腺管排列整齊，呈單柱狀，壁細胞、主細胞界限清楚，固有層內(nèi)胃腺體排列緊密整齊，未見炎癥細胞，黏膜下層無水腫。

實驗第2天，生半夏秫米湯組與法半夏秫米湯組小鼠均可見匯管區(qū)周圍的肝細胞細胞核圓而居中，無明顯腫脹；中央靜脈周圍肝細胞體積增大，染色變淺，疏松腫脹，肝細胞索排列紊亂；法半夏秫米湯組小鼠除上述變化外，還可見點狀壞死灶。實驗第14天，生半夏秫米湯組與法半夏秫米湯組小鼠均可見肝小葉結構不清，肝血竇擴張充血，大部分肝細胞疏松腫脹，呈現(xiàn)明顯的細胞水腫；生半夏秫米湯組小鼠部分肝細胞核溶解消失，出現(xiàn)點狀壞死灶，可見體積較大、染色深、雙核、再生的肝細胞；法半夏秫米湯組小鼠則多數(shù)肝細胞核溶解消失。（見圖6）

圖6 實驗第2 天及第14 天的肝臟病理學變化圖（HE，×100）

實驗第2天，生半夏秫米湯組小鼠可見腎小球毛細血管擴張充血明顯，腎小管上皮細胞腫脹、部分出現(xiàn)細胞溶解；法半夏秫米湯組小鼠可見腎小管變形，局部高度擴張，腎小管上皮細胞體積增大，染色變淺，出現(xiàn)明顯的細胞水腫，部分腎小管上皮細胞核溶解消失，可見蛋白管型，腎小球毛細血管擴張充血，部分腎小球萎縮。實驗第14天，生半夏秫米湯組小鼠可見腎小管上皮細胞水腫，細胞胞質(zhì)疏松，部分細胞核溶解，細胞脫落，同時管腔變窄消失，管形不規(guī)則；腎小管管腔內(nèi)可見蛋白管型；腎小球毛細血管擴張充血明顯，出現(xiàn)腎小球集中現(xiàn)象。法半夏秫米湯組小鼠腎小管上皮細胞也呈現(xiàn)水腫、壞死，部分細胞胞質(zhì)出現(xiàn)疏松溶解而脫落，管腔狹窄甚至消失，僅保留腎小管輪廓，管形不規(guī)則。腎小管管腔內(nèi)可見細胞或者蛋白管型。腎小球毛細血管擴張充血明顯，出現(xiàn)腎小球集中現(xiàn)象。（見圖7）

圖7 實驗第2 天及第14 天的腎臟病理學變化圖（HE，×100）

3 討論

半夏秫米湯始載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》?！鹅`樞·邪客》云：“目不瞑者，飲以半夏湯一劑，覆杯則臥。”明·張景岳謂：“治久病不寐者神效。”本研究通過研究不同半夏炮制品（生半夏、法半夏）組成的半夏秫米湯的急性毒性，以期為今后的實驗研究及臨床應用提供實驗基礎。

肝、腎是藥物代謝和排泄的器官，同時也是藥物安全性評價的重要器官。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計證實，藥源性肝損傷引起的死亡率居全世界疾病死亡率的第五位，而中藥則是導致肝損害的主要藥物之一，位居第三[9]。因此肝損害是中藥安全性研究的重點之一。而血清ALT和AST是肝損傷程度的重要評價指標[10]。肝細胞膜受損后，細胞內(nèi)的ALT、AST進入血液，則會引起血液中ALT、AST的升高[11]。本研究中生半夏秫米湯呈現(xiàn)一定程度肝損害，實驗第2天生半夏秫米湯組小鼠血清ALT、AST升高，肝組織病理顯示肝細胞受損，與張麗美等[12]的報道相似。實驗第14天，ALT值雖仍處于高水平狀態(tài)，但比第2天含量有所降低，表明肝功能有一定程度恢復，同時肝組織病理學檢查也發(fā)現(xiàn)了再生的肝細胞。由于本研究周期較短，未能觀察到肝功能是否完全恢復，今后可適當延長實驗周期進行相關觀察。法半夏為生半夏用生石灰和甘草炮制后制得，本為減毒，但目前法半夏毒性成分存在去除不徹底和炮制過度的現(xiàn)象，直接影響了法半夏用藥安全[13]，這與本研究認為法半夏秫米湯有肝損害較一致。本研究還認為法半夏秫米湯的損害程度重于生半夏秫米湯，表現(xiàn)為法半夏秫米湯組實驗第2、14天兩次AST值、實驗第14天ALT值明顯高于生半夏秫米湯組；雖然實驗第2天法半夏秫米湯組ALT水平低于生半夏秫米湯組，但肝組織病理形態(tài)學卻顯示點狀壞死灶，而這在生半夏秫米湯組卻未見到，而且實驗第14天的病理表現(xiàn)也重于生半夏秫米湯組。因此，本研究認為兩種半夏秫米湯均通過損害肝細胞導致ALT、AST升高，以法半夏秫米湯損害較重。

腎臟對于體內(nèi)電解質(zhì)的穩(wěn)態(tài)和細胞外環(huán)境的調(diào)節(jié)有重要作用。腎近端小管上皮細胞富含各種轉(zhuǎn)運蛋白、受體，可活化外源性化合物的代謝酶，是外源性毒物誘發(fā)腎損傷的重要靶點[14]。BUN和CrE分別是體內(nèi)蛋白質(zhì)和肌肉代謝的主要產(chǎn)物，主要通過腎臟排泄。血清BUN、CrE含量高低是腎實質(zhì)受損的重要標志，能夠反映腎小球濾過功能，是腎臟生理功能的重要反映指標，在評價腎功能方面具有重要意義[15-16]。當腎功能下降時，腎小球濾過率降低，排泄減少，血清BUN及CrE含量則會明顯升高。本研究顯示生半夏秫米湯及法半夏秫米湯均有腎損害。實驗第2、14天，兩組小鼠血清BUN、CrE升高，與嚴曉鶯等[12]報道生半夏造成腎損害相符。但本研究結果顯示法半夏秫米湯造成的腎損害較重，實驗第14天法半夏秫米湯組小鼠血清BUN、CrE明顯高于生半夏秫米湯組；病理學顯示法半夏秫米湯組的腎小球、腎小管損害程度較重。這表明兩種半夏秫米湯均通過損害腎小球及腎小管，引起排泄功能下降，從而導致BUN和CrE升高。

王潮奎等[17]研究表明加熱雖能一定程度降低半夏刺激性，但毒性成分草酸鈣針晶、生物堿即使100 ℃加熱3 h，也不能被破壞[18]。本研究中生半夏秫米湯與法半夏秫米湯水煎液之所以表現(xiàn)出一定肝腎毒性，除了半夏加熱后毒性并未完全消除，主要原因還是在于半夏劑量超大，與靳曉琪[19]提出的大劑量半夏會出現(xiàn)肝損害一致，而半夏正?；虻蛣┝繘]有明顯肝腎毒性。如岳蘋等[20]證實小劑量生半夏水煎液2.275 g/kg（相當于成人15 g/d）灌胃小鼠給藥，1次/d，連續(xù)14 d，無毒性反應。嚴曉鶯等[21]研究也表明小劑量（1 g/kg）生半夏水煎液灌胃小鼠后，病理學檢查腎臟無明顯變化。而本研究中半夏秫米湯的小鼠每日最大給藥劑量為360 g/kg，其中生半夏每日給藥劑量為120 g/kg，根據(jù)人鼠劑量換算，約相當于70 kg體質(zhì)量成人933.1 g/d的劑量，是《中華人民共和國藥典》規(guī)定成人最大用量（9 g/d）的103.7倍，遠遠超過臨床實際用量，因而呈現(xiàn)肝腎毒性。但是，本研究認為生半夏秫米湯和法半夏秫米湯毒性較小，較為安全，表現(xiàn)為各組小鼠在給藥后無死亡現(xiàn)象，肉眼未見小鼠主要器官異常改變，小鼠體質(zhì)量均較給藥前增加，且與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。病理學檢查顯示，脾、心、腦及胸腺無異常變化；肺、胃未見藥物相關異常變化。雖然實驗第2天的血常規(guī)中生半夏秫米湯組小鼠HCT升高，實驗第14天法半夏秫米湯組小鼠RDW升高，但是無其他相關指標變化，因而可能與用藥無關。

本研究認為生半夏秫米湯和法半夏秫米湯大劑量用藥能夠損害肝細胞、腎小球、腎小管從而引起肝腎功能下降，具有一定肝腎毒性，以法半夏秫米湯造成的損害較重，但毒性較低。生半夏秫米湯造成的肝損害是否能夠恢復，尚需進行相關研究。為降低毒性，保證安全，臨床使用上述兩方時，不宜使用超大劑量，并需開展臨床實際用量的毒性研究；另外，還需規(guī)范半夏炮制品的加工制作以提高炮制品質(zhì)量；或去除有毒成分，運用現(xiàn)代技術提取無毒的安全有效成分制成現(xiàn)代制劑使用。但鑒于目前對半夏毒性物質(zhì)基礎、安全的用量界限并不明確[9]，因此，函需就半夏及其炮制品開展深入系統(tǒng)的相關研究。