楊若璇，唐凱偉，朱成林，陳娟，刀筱芳，唐俊妮

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041）

沙門氏菌（Salmonella）是世界范圍內(nèi)引起食品公共安全問題的主要食源性致病菌之一，被列為牛乳及其制品中微生物檢測的主要對(duì)象之一[1]。牛乳品質(zhì)的好壞與否取決于奶牛養(yǎng)殖場的環(huán)境以及牛乳生產(chǎn)加工各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生狀況[2]。沙門氏菌會(huì)引起奶牛腹瀉[3]，減低奶牛產(chǎn)奶量，導(dǎo)致牛乳品質(zhì)降低，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[4]。為了防止奶牛感染致病菌，在養(yǎng)殖期間使用抗生素、消毒劑，甚至濫用抗生素成了主要的防控手段[5,6]。每年我國在養(yǎng)殖場中都會(huì)過量使用抗生素，導(dǎo)致我國抗生素的使用量在全球的占比很高[7]。這也導(dǎo)致養(yǎng)殖場中耐藥細(xì)菌的廣泛存在[8]。奶牛養(yǎng)殖業(yè)目前呈現(xiàn)出規(guī)模化的發(fā)展，導(dǎo)致奶牛養(yǎng)殖密度變大，病原微生物傳播途徑縮短，有效的消毒殺菌是奶牛養(yǎng)殖場防控致病性微生物的重要保障[9]。Shaibu 等[10]通過對(duì)屠宰場被屠宰的牛以及加工環(huán)境標(biāo)本中的沙門氏菌進(jìn)行抗菌譜測定，發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)3～5 種抗生素產(chǎn)生抗性，表現(xiàn)為多重耐藥。趙俊利等[11]針對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛源致病性沙門氏菌的耐藥特性及基因分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛源致病性沙門氏菌對(duì)甲氧芐啶及磺胺甲基異唑的耐藥率最高（97.4%），對(duì)多數(shù)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖甙類、氯霉素類及四環(huán)素類藥物的耐藥性也較為嚴(yán)重（耐藥率為40%～80%），菌株的多重耐藥率為94.7%，提示臨床抗菌藥物不合理使用可能是該地區(qū)奶牛源沙門氏菌耐藥性產(chǎn)生的主要原因。消毒劑是目前食源性致病菌防控的有效手段[12]，廣泛用于控制食品生產(chǎn)設(shè)施和環(huán)境中的微生物污染[13]。但是，消毒劑的廣泛使用同樣引起人們對(duì)其可能參與抗生素耐藥性發(fā)展的擔(dān)憂，特別是對(duì)抗生素共同耐藥的關(guān)注[14]。李幗寧等[15]揭示了社區(qū)環(huán)境中分離鑒定的沙門氏菌以B 群鼠傷寒沙門菌為主要菌型，其耐消毒劑基因攜帶率較高，并且以qacEΔ1基因?yàn)橹饕獢y帶類型，菌株對(duì)消毒劑和抗生素抗性具有協(xié)同效應(yīng)。沙門氏菌可從畜禽動(dòng)物宿主中獲得耐藥性，通過食物鏈引起人類感染[16]。只有科學(xué)管理和合理使用抗生素，才能有效控制人畜共患沙門氏菌病，保障食品安全和人類健康[17]。因此，調(diào)查奶牛場沙門氏菌分離株的流行特征和抗性分析，可為奶牛場沙門氏菌的防控以及抗生素、消毒劑的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和實(shí)驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所需主要培養(yǎng)基及試劑見表1。陽性對(duì)照菌株為沙門氏菌H9812（SalmonellaH9812），由本實(shí)驗(yàn)室保存。

表1 主要培養(yǎng)基及試劑Table 1 Main media and reagents

1.2 主要儀器

本試驗(yàn)所需主要儀器見表2。

表2 主要儀器Table 2 Main instruments

1.3 樣品采集

2020 年7 月至11 月，分五個(gè)批次從成都市某規(guī)?；膛龅沫h(huán)境、產(chǎn)奶過程各環(huán)節(jié)、以及奶牛糞樣中共采集700 份樣品。其中，奶牛場環(huán)境樣品78 份，健康奶牛糞樣88 份，健康奶牛乳頭89 份，健康奶牛奶樣48 份，擠奶器89 份，腹瀉奶牛糞樣118 份，腹瀉奶牛環(huán)境97 份，腹瀉奶牛乳頭49 份，乳房炎奶牛糞樣44 份。

1.4 細(xì)菌分離、鑒定與血清型鑒別

參照國標(biāo)GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué) 沙門氏菌檢驗(yàn)》方法進(jìn)行樣品分離鑒定。使用水浴法提取沙門氏菌的DNA 模板[18]，以沙門氏菌的特異性invA基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體引物序列為：上游引物：CCCTTTGCGAATAACATCC；下游引物：ATTACTTGTGCCGAAGAGCC[18]。PCR 反應(yīng)體系20 μL：包含Taq 1.1×T3 Super PCR Mix 17 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性20 s；56 ℃退火10 s；72 ℃延伸30 s；共35 個(gè)循環(huán)，72 延伸2 min。沙門氏菌的血清型參照沙門氏菌屬診斷血清說明書進(jìn)行操作，鑒定結(jié)果參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.4-2010《沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行判斷。

1.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)參考美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards in Stitute，CLSI）推薦的Kirby-Bauer 紙片擴(kuò)散法，結(jié)果按照CLSI 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[19]。藥敏紙片購置于賽默飛公司，抗生素類型與使用劑量見表3。

表3 抗生素藥物及其使用劑量Table 3 The antibiotic drugs and their dosages

1.6 耐藥基因、毒力基因、抗消毒劑基因檢測

DNA 模板制備同1.4，采用PCR 擴(kuò)增27 種耐藥基因，13 種毒力基因，5 種抗消毒劑基因，其引物序列、擴(kuò)增片段長度及退火溫度見表4，PCR 反應(yīng)體系同1.4。

表4 耐藥基因、毒力基因、抗消毒劑基因引物序列信息Table 4 Primer sequence information of drug resistance genes,virulence genes and antidisinfectant gene

續(xù)表4

1.7 對(duì)不同消毒劑MIC 值的測定

根據(jù)消毒劑化學(xué)結(jié)構(gòu)以及作用機(jī)理特征，參考CLSI 推薦方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)法測定不同消毒劑對(duì)沙門氏菌MIC 值[19]，采用二倍稀釋法，將9 種消毒劑（表5），以消毒劑廠家推薦噴霧使用濃度為中間值，分別向上、向下稀釋梯度濃度，將其混合溶解于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種100 μL 制備好的菌懸液，每株菌做3 個(gè)重復(fù)，根據(jù)沙門氏菌的生長情況，確定不同種類消毒劑抑制受試沙門氏菌生長的最低濃度，即為MIC 值。

表5 9 種消毒劑成分以及使用濃度Table 5 The ingredients of 9 disinfectants and concentration

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 軟件初步進(jìn)行整理分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 軟件，作圖采用GraphPad Prism 8（v8.0.2.263）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定及血清型分布

通過選擇性培養(yǎng)基以及沙門氏菌特異基因invA檢測，從成都地區(qū)規(guī)模化奶牛場環(huán)境中各環(huán)節(jié)及牛乳在生產(chǎn)過程中采集700 份樣品，共分離鑒定出16 株沙門氏菌（2.29%，16/700）。從奶牛場環(huán)境1 株（1.28%，1/78）；健康奶牛糞樣1 株（1.14%，1/88）；腹瀉奶牛糞樣6 株（5.08%，6/118）；腹瀉奶牛環(huán)境5 株（5.15%，5/97）；腹瀉奶牛乳頭2 株（4.08%，2/49）；乳房炎奶牛糞樣1 株（2.27%，1/44），結(jié)果顯示該奶牛場采奶環(huán)節(jié)中沙門氏菌的污染范圍較為廣泛。馮蘭等[23]對(duì)四川省阿壩州紅原縣采集腹瀉牦牛樣品，16 份樣品共計(jì)分離出16 株沙門氏菌，沙門氏菌檢出率達(dá)到100%。說明密集的養(yǎng)殖場環(huán)境可致使病原菌在奶牛場之間的傳播風(fēng)險(xiǎn)更高，感染率高且造成的影響和危害更為嚴(yán)重[24]。奶牛養(yǎng)殖業(yè)是我國畜牧養(yǎng)殖重要的產(chǎn)業(yè)之一，其中，細(xì)菌性腹瀉中的沙門氏菌是嚴(yán)重危害養(yǎng)殖場中畜禽健康的一類致病菌，且在奶牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)以及牛乳生產(chǎn)過程中也經(jīng)常會(huì)發(fā)生食源性微生物的污染進(jìn)而引起人的傳染。

進(jìn)一步，采用沙門氏菌屬診斷血清試劑盒從分離菌株中鑒定出4 種血清型，包括腸炎沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌，詳見表6。其中甲型副傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢血清（n=6，37.50%）、腸炎沙門氏菌（n=6，37.50%），其次，鼠傷寒沙門氏菌（n=3，18.75%）、嬰兒沙門氏菌（n=1，6.25%）。在中國，沙門氏菌流行的血清型眾多[25]。張樹棟等[26]發(fā)現(xiàn)牛源沙門氏菌的血清型多為鼠傷寒沙門氏菌或者都柏林沙門氏菌，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果大致相似，血清型的差異可能是由于地理區(qū)域、季節(jié)和采樣方法的不同導(dǎo)致，也表明奶牛場中沙門氏菌容易在各種環(huán)境中交叉污染。

表6 沙門氏菌血清型分布情況Table 6 Distribution of Salmonella serotypes

2.2 藥敏試驗(yàn)

16 株沙門氏菌對(duì)20 種常見抗生素的耐藥表型如表7所示，分離菌株對(duì)桿菌肽和利福平的耐藥性最高，為100.00%（16/16），其次是氨芐西林，檢出率為93.75%（15/16），對(duì)亞胺培南、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星和頭孢他啶這6 種藥物的耐藥率均為0。此外，分離菌株還對(duì)多種抗生素表現(xiàn)為中介，如對(duì)鏈霉素（75.00%）、慶大霉素（62.50%）、阿米卡星（62.50%）等。本研究結(jié)果與何名揚(yáng)等[27]及加春生等[28]的研究結(jié)果相似，包東武等[29]研究指出在對(duì)沙門氏菌及各類細(xì)菌傳染性疾病進(jìn)行治療過程中，需要謹(jǐn)慎性用藥。因?yàn)榘匆?guī)定使用抗生素能夠有效降低沙門氏菌耐藥性的產(chǎn)生[30]。該奶牛場在針對(duì)治療沙門氏菌引起的患病奶牛時(shí)，建議使用氟喹諾酮類抗生素藥物。

表7 沙門氏菌分離株對(duì)20 種抗生素的藥敏結(jié)果Table 7 The results of susceptibility of Salmonella isolates to 20 antibiotics

從表8 可以看出16 株沙門氏菌分離菌株的耐藥表型均為多重耐藥性，分離菌株對(duì)3 種以上抗生素表現(xiàn)為耐藥。優(yōu)勢多重耐藥譜為：桿菌肽（B）、氨芐西林（AMP）、利福平（RFP），說明該奶牛場沙門氏菌分離菌株存在多重耐藥現(xiàn)象。

表8 分離菌株多重耐藥譜Table 8 Multidrug resistance profiles of Salmonella isolates

2.3 抗生素耐藥基因檢測結(jié)果

27 種耐藥基因檢測到24 種，檢出率最高的是tetB（93.75%），其次是aaC4（75.00%），未檢測到qnrC、aaC3和tetG耐藥基因。檢測結(jié)果如圖1。四環(huán)素類耐藥基因中，tetB基因的攜帶率高達(dá)93.75%，分析原因可能跟早期使用四環(huán)素類抗生素有關(guān)。16 株沙門氏菌分離菌株中有一半以上的分離菌株攜帶磺胺類耐藥基因，經(jīng)詢問磺胺類藥物也是該奶牛場主要的治療用藥。氯霉素類耐藥基因中stcM攜帶率為50.00%，cmlA攜帶率為12.50%。分離菌株中攜帶率較低的是鏈霉素類strB基因，僅1 株分離菌株攜帶。通過分析耐藥基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)與張文宇[30]、馮蘭[31]等研究結(jié)果存在一定差異，表明不同地區(qū)、不同時(shí)間采樣的沙門氏菌耐藥性存在不同。

圖1 沙門氏菌不同耐藥基因檢測結(jié)果Fig.1 Results of different drug resistance genes in Salmonella

2.4 毒力基因檢測結(jié)果

針對(duì)13 對(duì)毒力基因，檢測結(jié)果顯示，詳見圖2，分離菌株攜帶12 種不同的毒力基因，未檢測到ssaR毒力基因。Dlamini 等[32]從牛糞便和生牛肉樣本中分離出300 株沙門氏菌，27.10%的分離株具有spvC基因，來源不一樣的沙門氏菌攜帶相同的毒力基因時(shí)，所表現(xiàn)出的致病性不同[33]。研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒上攜帶的毒力基因更加具有致病性[34]，如spvC基因在質(zhì)粒上，可發(fā)生轉(zhuǎn)移。此外spvC基因的產(chǎn)物與毒力表型具有一定的相關(guān)性，有利于沙門氏菌在腸外組織細(xì)胞內(nèi)生長[21]。宋雪等[35]研究發(fā)現(xiàn)，毒力基因的攜帶情況與宿主的健康程度相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了毒力基因的攜帶率與致病性呈正相關(guān)[36]，毒力基因檢出率越高，沙門氏菌潛在致病性就越強(qiáng)?？梢源_定該奶牛場奶牛腹瀉的原因與攜帶多種毒力基因的沙門氏菌有關(guān)，這些毒力基因的存在可能會(huì)促進(jìn)沙門氏菌向宿主的入侵，并且奶牛的發(fā)病率相關(guān)。

圖2 沙門氏菌不同毒力基因檢測結(jié)果Fig.2 The results of different virulence genes in Salmonella

2.5 抗消毒劑基因檢測結(jié)果

抗消毒劑基因的檢測結(jié)果如圖3，除qacG未被檢出外，16 株沙門氏菌分離菌中4 種基因均有檢出，其中qacEΔ1基因檢出率最高為56.25%。楊盛智等[37]在研究雞蛋生產(chǎn)鏈中沙門氏菌對(duì)抗生素及消毒劑的耐藥性中也僅檢測出qacEΔ1消毒劑耐藥基因，且發(fā)現(xiàn)所有檢測出qacEΔ1基因的菌株均對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性。本研究結(jié)果與之相似，說明qacEΔ1基因在不同來源、不同環(huán)境中的沙門氏菌分離菌株中的檢出率均較高。

圖3 沙門氏菌抗消毒劑基因檢測結(jié)果Fig.3 The results of different anti-disinfectant genes in Salmonella

2.6 不同消毒劑對(duì)分離出的16 株沙門氏菌MIC 值分析

9種消毒劑對(duì)16株沙門氏菌分離菌株消毒效果MIC值的比較，結(jié)果如表9 所示，除了G 消毒劑，其它8 種消毒劑的最小抑菌濃度均高于廠家推薦使用濃度。

表9 消毒劑廠家推薦使用濃度與試驗(yàn)使用濃度Table 9 Recommended concentration and test concentration of disinfectant manufacturer

分離菌株對(duì)9 種消毒劑敏感程度都較為廣泛，稀釋的濃度梯度跨度也較大。研究發(fā)現(xiàn)，消毒劑成分相同但品牌不同的消毒劑MIC 值也存在差異，分析可能與消毒劑原始濃度有關(guān)，從消毒劑對(duì)受試菌株的抑菌效果可以看出，消毒劑A、C、D、H 在30 min 內(nèi)可以就能夠達(dá)到殺菌率100%；消毒劑B、E、F、G、I 均在60 min 內(nèi)可以達(dá)到100%的殺菌率，詳見圖4。

圖4 9 種消毒劑不同時(shí)間抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of 9 kinds of disinfectants at different times

針對(duì)牛乳加工環(huán)節(jié)和環(huán)境消毒滅菌尤為重要，有效的消毒是奶牛場疫病防控的重要保障。質(zhì)粒型消毒劑抗性基因家族中qac基因最為常見，其編碼的外排泵蛋白可排出雙胍類消毒劑和季銨鹽類消毒劑。李幗寧等[15]揭示沙門氏菌抗消毒劑基因攜帶率較高與多重耐藥菌株消毒劑抗力較高密切相關(guān)。何雪萍等[37]研究認(rèn)為長期使用消毒劑會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物養(yǎng)殖場中沙門氏菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥性增強(qiáng)。針對(duì)該奶牛場的日常環(huán)境、器具消毒，建議多種類消毒劑定期交替規(guī)范使用，可減少致病菌耐藥性的產(chǎn)生。

2.7 不同巴氏殺菌溫度對(duì)沙門氏菌的殺菌效果

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[38]，在不影響牛乳品質(zhì)和風(fēng)味的情況下，選擇低溫保持式殺菌法對(duì)全脂乳和脫脂乳中的沙門氏菌進(jìn)行巴氏殺菌，針對(duì)巴氏殺菌中的低溫保持式殺菌法進(jìn)行了溫度的探究試驗(yàn)。如圖5 所示，全脂鮮牛乳中沙門氏菌菌落數(shù)隨溫度升高而減少，16株沙門氏菌分離菌株64.0 ℃時(shí)可以達(dá)到殺菌率100%。在圖6 中可知，在脫脂乳中沙門氏菌菌落數(shù)也隨著溫度的升高而減少，16 株沙門氏菌分離菌株在63.5 ℃殺菌率能夠達(dá)到100%，在脫脂乳中巴氏殺菌效果顯著。溫度變化對(duì)16 株沙門氏菌分離菌株的影響較大，熱處理強(qiáng)度不同，其殺菌效效果不同。

圖5 全脂乳中不同巴氏殺菌溫度對(duì)16 株沙門氏菌抑菌效果Fig.5 The sterilization effect of different pasteurization temperatures in whole milk on 16 strains of Salmonella

圖6 脫脂乳中不同巴氏殺菌溫度對(duì)16 株沙門氏菌抑菌效果Fig.6 The sterilization effect of different pasteurization temperatures in skimmed milk on 16 Salmonella strains

3 結(jié)論

本研究以奶牛場沙門氏菌分離菌株為研究對(duì)象，從牛乳生產(chǎn)鏈中采集700 份樣品，分離鑒定出16 株沙門氏菌，檢出率為2.29%；血清型鑒定結(jié)果顯示，分離菌株中有4 種血清型，以甲型副傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌為優(yōu)勢血清型，其次是鼠傷寒沙門氏菌；16 株沙門氏菌分離菌株對(duì)桿菌肽和利福平的耐藥性高達(dá)100.00%，其次是氨芐西林為93.75%，對(duì)頭孢他啶、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星和青霉素這6 種藥物敏感，16 株沙門氏菌分離菌株表現(xiàn)出多重耐藥性；共檢測到24 種抗生素耐藥基因，檢出率最高的是tetB（93.75%），其次是aaC4（75.00%）。分離菌株中共檢測到12 種不同的毒力基因，檢出率最高的是sipA毒力基因，檢出率為62.50%（10/16），未檢測到ssaR毒力基因。抗消毒劑基因中，除qacG未被檢出外，其他4 種基因均有檢出，其中qacEΔ1基因檢出率最高為56.25%。16 株沙門氏菌對(duì)9 種不同種類消毒劑的MIC 值基本都高于廠家推薦使用濃度的1～3倍。巴氏殺菌條件，在64.0 ℃、30 min 時(shí)，不管是在全脂乳還是脫脂乳中殺菌率都能達(dá)到100%，建議加強(qiáng)對(duì)奶牛場中沙門氏菌的防控，嚴(yán)格規(guī)范使用抗生素和消毒劑以及加強(qiáng)監(jiān)督管理牛乳生產(chǎn)鏈條中衛(wèi)生質(zhì)量管理。