成家宏，孟毅，喬明亮

（河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002）

腦卒中是繼心臟病和癌癥之后的第三大死亡原因[1]，其中缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占所有腦卒中病例的85%以上。目前IS有效療法為組織纖溶酶原激活劑和血管內(nèi)血栓切除術(shù)[2]，但因缺血半暗帶（ischemic penumbra，IP）時(shí)間窗和繼發(fā)性缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷，患者可接受率較低[3]。在IS引起的缺血、缺氧和營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激條件下，IP神經(jīng)元的自噬過程被激活。研究認(rèn)為，自噬對(duì)IP神經(jīng)元存活至關(guān)重要[4]，提示自噬可能是治療IS的重要靶點(diǎn)。IS神經(jīng)元損傷與氧供需失衡有關(guān)。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）是IS缺氧的關(guān)鍵反應(yīng)物之一，mTOR是調(diào)節(jié)自噬經(jīng)典信號(hào)通路的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧狀態(tài)下，HIF-1α可負(fù)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）并誘導(dǎo)自噬[5]。異鉤藤堿（isorhynchophylline，IRN）是一種從鉤藤中提取的四環(huán)羥吲哚生物堿，具有抗炎、抗凋亡、抗神經(jīng)毒性、調(diào)節(jié)自噬等作用[6]。但目前關(guān)于IRN對(duì)腦損傷尤其是對(duì)IS腦損傷的影響及可能作用機(jī)制方面的報(bào)道較少，故本實(shí)驗(yàn)擬利用線栓法致大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）以構(gòu)建IS模型，并以依達(dá)拉奉作為陽性對(duì)照，探討IRN對(duì)IS模型大鼠I/R腦損傷和神經(jīng)元自噬的影響，分析其可能作用機(jī)制是否與HIF1α/mTOR通路有關(guān)，以期為IRN臨床應(yīng)用及IS臨床治療提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠75只，體質(zhì)量（200±20）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0013。實(shí)驗(yàn)前大鼠于24 ℃恒溫、50%恒濕環(huán)境下，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，12 h光-暗交替，自由獲得飲水、飼料。本研究動(dòng)物處置符合“3R”原則，經(jīng)河南省中醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：HNZY-2020078。

1.2 藥品與試劑 IRN（純度≥98%，批號(hào)：6859-01-4）購自成都儀睿生物科技有限公司；依達(dá)拉奉（純度≥99%，批號(hào)：89-25-8）購自美國Sigma公司；TTC染色試劑盒（批號(hào)：298-96-4）購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC3B）（批號(hào)：ab63817）、HIF-1α單克隆抗體（批號(hào)：ab179483）、mTOR單克隆抗體（批號(hào)：ab134903）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）單克隆抗體（批號(hào)：ab137133）、自噬相關(guān)蛋白Beclin1單克隆抗體（批號(hào)：ab207612）、自噬降解底物P62蛋白（autophagy degradation substrate p62 protein，p62）單克隆抗體（批號(hào)：ab91526）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 Oxylab LDF型激光多普勒血流儀（北京拜安吉科技有限公司）；PerkinElmer EnVision型多功能酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）。

1.4 分組與給藥 75只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、IRN低劑量組、IRN高劑量組、依達(dá)拉奉組，每組15只。其中IRN低劑量組、IRN高劑量組大鼠腹腔注射給藥劑量分別為20、40 mg/（kg·d）[7]；依達(dá)拉奉組大鼠腹腔注射給藥劑量為3 mg/（kg·d）[8]；假手術(shù)組及模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。

1.5 IS大鼠模型構(gòu)建 末次給藥后，禁食不禁水12 h，除假手術(shù)組外，其他各組利用腔內(nèi)MCAO誘導(dǎo)制備IS模型大鼠[9]，具體操作：腹腔注射水合氯醛（0.4 g/kg）麻醉大鼠，將其放于溫控加熱墊上操作以保持正常體溫。頸部中線切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，將一根帶硅膠珠尖端的4/0單絲尼龍經(jīng)頸外動(dòng)脈插入右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血液供應(yīng)，激光多普勒血流儀監(jiān)測右側(cè)大腦中動(dòng)脈的血流量，見血流量下降并低于基線30%即成功缺血，缺血2 h后撤回單絲進(jìn)行血液再灌注。假手術(shù)組大鼠未中斷血液供應(yīng)，其他手術(shù)操作同上。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 血液再灌注24 h后，由實(shí)驗(yàn)不知情研究人員評(píng)估各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分[10]：正常，對(duì)稱運(yùn)動(dòng)，無任何異常體征計(jì)0分；提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢屈曲計(jì)1分；大鼠步態(tài)不穩(wěn)，向腦損傷一側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分；無法支撐身體而右側(cè)躺臥計(jì)3分；意識(shí)水平降低，無自發(fā)性活動(dòng)計(jì)4分；死亡計(jì)5分。

1.6.2 TTC染色測定腦梗死面積 麻醉大鼠并脫頸處死，取7只大鼠腦組織并稱重（濕質(zhì)量），作2 mm冠狀冷凍切片，于37 ℃的2% TTC染液中孵育30 min，4%多聚甲醛4 ℃固定6 h。正常組織區(qū)域?yàn)榧t色，缺血梗死區(qū)因無線粒體酶活性而呈白色。采用Image J圖像分析軟件計(jì)算腦梗死面積，梗死面積百分比=白色面積/總面積×100%。

1.6.3 腦組織水含量測定 TTC染色后的腦切片于110 ℃干燥48 h，稱重（干質(zhì)量）。腦組織水含量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.6.4 HE染色檢測大鼠腦組織病理變化 取剩余8只大鼠部分腦組織，常規(guī)石蠟包埋制備5 μm厚度腦切片。二甲苯脫蠟，乙醇脫水，蘇木精染色2 min，伊紅染色1 min，常規(guī)脫水，透明，中性樹脂封片。400倍鏡下觀察并記錄各組大鼠腦組織切片病理情況。神經(jīng)元細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的紅色。

1.6.5 TUNEL染色檢測腦組織細(xì)胞凋亡 按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書，取上述石蠟切片，加入生物素標(biāo)記液37 ℃反應(yīng)1 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗3次，加入Streptavidin-HRP工作液室溫孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色，脫水透明，封片觀察。400倍鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞，陽性凋亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)在顯微鏡下呈褐色。凋亡指數(shù)（%）=凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6.6 Western blotting法檢測HIF-1α/mTOR通路相關(guān)因子蛋白表達(dá) 分離的缺血側(cè)腦組織加入適量裂解液，勻漿裂解，后經(jīng)4 ℃12 000 r/min離心10 min，取上清，測定蛋白濃度后加熱變性，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。各組蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（壓縮膠60 V 25 min，分離膠120V 70min），后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（轉(zhuǎn)膜條件200mA 120min），PVDF膜于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，后于一抗內(nèi)（HIF-1α、Beclin1均以1∶1 000稀釋；mTOR、p62均以1:8 000稀釋；p-mTOR以1∶5 000稀釋；LC3B以1∶2 000稀釋）4 ℃孵育過夜。次日洗膜，后于辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗（以1∶8 000稀釋）內(nèi)室溫孵育1 h，TBST洗膜3～6次后，ECL顯影，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照記錄。利用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ、Beclin1、p62與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達(dá)拉奉組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與IRN低劑量組比較，bP＜0.05；與IRN高劑量組比較，cP＜0.05

2.2 各組大鼠腦梗死情況比較 假手術(shù)組大鼠腦組織呈紅色均染，未見梗死；模型組、IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦組織可見明顯梗死灶。與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦梗死面積百分比均明顯減小（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦梗死面積百分比均明顯減?。≒＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達(dá)拉奉組大鼠腦梗死面積百分比明顯減?。≒＜0.05）。（見圖1、表2）

表2 各組大鼠腦梗死情況比較（）

表2 各組大鼠腦梗死情況比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與IRN低劑量組比較，bP＜0.05；與IRN高劑量組比較，cP＜0.05

2.3 各組大鼠腦組織水含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織水含量明顯增多（P＜0.05）；與模型組比較，IRN低、高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦組織水含量均明顯減少（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦組織水含量均明顯減少（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達(dá)拉奉組大鼠腦組織水含量明顯減少（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠腦組織水含量比較（）

表3 各組大鼠腦組織水含量比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與IRN低劑量組比較，cP＜0.05；與IRN高劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察 假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，形狀規(guī)則，核仁清晰，未見水腫及炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠神經(jīng)元出現(xiàn)明顯核仁固縮，排列散亂且有空泡，形狀不規(guī)則；與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦組織神經(jīng)元固縮逐漸減輕，形態(tài)逐漸規(guī)則，排列逐漸緊密。（見圖2）

2.5 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元呈淡藍(lán)色，排列有序，結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠可見大量棕色凋亡細(xì)胞，細(xì)胞固縮，排列無序；與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦組織陽性凋亡細(xì)胞逐漸減少，形態(tài)逐漸改善。與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組凋亡指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組、依達(dá)拉奉組凋亡指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達(dá)拉奉組凋亡指數(shù)均明顯降低（P＜0.05）。（見圖3、表4）

表4 各組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（）

表4 各組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與IRN低劑量組比較，bP＜0.05；與IRN高劑量組比較，cP＜0.05

2.6 各組大鼠腦組織HIF1α/mTOR通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)情況 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，IRN低劑量組、IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦組織中HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；與IRN低劑量組比較，IRN高劑量組及依達(dá)拉奉組大鼠腦組織HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）；與IRN高劑量組比較，依達(dá)拉奉組大鼠腦組織HIF-1α、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），p-mTOR、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（P＜0.05）。5組大鼠腦組織mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表5、圖4）

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、p62 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表5 各組大鼠腦組織HIF-1α、mTOR、p-mTOR、LC3、Beclin1、p62 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與IRN低劑量組比較，cP＜0.05；與IRN高劑量組比較，dP＜0.05

3 討 論

IS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，大腦某一區(qū)域血液循環(huán)發(fā)生障礙時(shí)，可導(dǎo)致腦組織缺氧及葡萄糖供應(yīng)不足，引起谷氨酸相關(guān)的興奮性毒性、炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等一系列病理反應(yīng)，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞死亡途徑，影響神經(jīng)行為功能[11]。

腦缺血的主要臨床表現(xiàn)為局灶性腦缺血，如短暫或永久性MCAO，因與IS非常相似而常用于探討IS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物研究[12]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)短暫閉塞大腦中動(dòng)脈后再灌注，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯升高，腦梗死面積百分比明顯增大，腦組織水含量明顯增多，神經(jīng)元出現(xiàn)明顯核仁固縮，排列散亂且有空泡，凋亡細(xì)胞指數(shù)明顯升高，提示MCAO可致嚴(yán)重I/R損傷，成功構(gòu)建IS模型大鼠。神經(jīng)元形態(tài)異常及高死亡率為I/R損傷標(biāo)志，腦組織水含量可評(píng)估腦水腫程度。腦水腫可導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，是IS治療關(guān)鍵[13]。依達(dá)拉奉是一種抗氧化劑和氧自由基清除劑，具有抗炎、增加血流量、減少神經(jīng)損傷及改善神經(jīng)功能等作用，常用作治療腦卒中[14]。有研究表明，IRN可減輕I/R損傷大鼠腦梗死程度，降低腦缺血側(cè)神經(jīng)元死亡率及腦含水量[15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)低、高劑量IRN及依達(dá)拉奉治療后，IS模型大鼠腦組織病理損傷情況明顯改善，神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死程度均明顯降低，腦組織水含量明顯減少，凋亡細(xì)胞指數(shù)明顯降低，提示IRN具有改善IS模型大鼠腦損傷的作用。

自噬在IS神經(jīng)元死亡調(diào)控中起雙重作用[16]。適度自噬可通過消除受損的組織及蛋白質(zhì)來拯救受損細(xì)胞，而過度自噬可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物降解，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，最終損傷組織器官。LC3為自噬體的特異性標(biāo)志物；p62可以作為自噬通量的衡量標(biāo)準(zhǔn)，被認(rèn)為與自噬降解呈負(fù)相關(guān)。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（LC3-Ⅰ）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型（LC3-Ⅱ）。當(dāng)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá)水平降低時(shí)，p62在細(xì)胞中積聚，自噬受阻，可導(dǎo)致自噬活性降低[17]。Beclin1是自噬的關(guān)鍵參與者，被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)自噬體合成與成熟[18]。研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中恢復(fù)期神經(jīng)元自噬水平較高[19]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，提示自噬發(fā)生和自噬活性較強(qiáng)；而經(jīng)低、高劑量IRN及依達(dá)拉奉治療后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1及p62表達(dá)情況發(fā)生逆轉(zhuǎn)，提示IRN可抑制IS大鼠神經(jīng)元自噬體形成，降低自噬活性。

IS缺血狀態(tài)可誘導(dǎo)HIF-1轉(zhuǎn)錄，HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異源二聚體，其活性由HIF-1α決定。常氧條件下，HIF-1α被蛋白酶體降解；缺氧條件下，蛋白酶體可抑制HIF-1α降解，穩(wěn)定HIF-1α與分子伴侶的結(jié)合進(jìn)而增加HIF-1活性。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α信號(hào)通路可以促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的自噬[20]，自噬受mTOR信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控，能量缺乏可導(dǎo)致mTOR活性失活從而導(dǎo)致自噬增加[21]。mTOR可通過調(diào)節(jié)HIF-1α影響凋亡與自噬，缺氧狀態(tài)下HIF-1α可反向調(diào)節(jié)mTOR，HIF-1α過表達(dá)通常伴隨mTOR途徑的抑制[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，mTOR磷酸化水平明顯降低，提示IS大鼠在腦卒中氧糖剝奪情況下，可出現(xiàn)HIF-1α響應(yīng)及mTOR失活而促進(jìn)自噬發(fā)生。經(jīng)IRN低劑量組、IRN高劑量及依達(dá)拉奉治療后，HIF-1α及mTOR磷酸化水平被逆轉(zhuǎn)，提示HIF-1α降解和mTOR激活可促進(jìn)IS模型大鼠腦組織損傷的恢復(fù)。

綜上所述，IRN可通過減輕IS模型大鼠神經(jīng)功能缺損及腦水腫，減少腦梗死并降低神經(jīng)元凋亡水平，改善腦組織病理損傷，其作用機(jī)制可能與抑制HIF1α表達(dá)、激活mTOR信號(hào)進(jìn)而抑制IS模型大鼠神經(jīng)元過度自噬有關(guān)。