陳凱玲 ，張煒彬，毛麗娟，曹佳穎，韓 紅 ，毛 楓，王文平

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院超聲科，上海 200032；

2.上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，上海 200032

原發(fā)性肝癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第6位，死亡率居癌癥相關(guān)死亡的第2位，全世界每年約80萬人死于肝癌［1］。外科手術(shù)是原發(fā)性肝癌首選的治療方案，但約70%的患者術(shù)后5年內(nèi)復(fù)發(fā)，而復(fù)發(fā)性肝癌的治療是臨床工作中亟待解決的問題［2］。動物實驗對于新型藥物和新技術(shù)的研發(fā)具有重要價值，目前研究中應(yīng)用的動物模型主要有皮下移植瘤、肝內(nèi)原位種植瘤及化學(xué)誘導(dǎo)的模型，而構(gòu)建肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)模型的研究較少［3］。兔肝VX2原位移植瘤是目前廣泛使用的較大動物模型［4］。相較于皮下移植瘤模型，肝VX2原位種植瘤的血供和生長特征與人原發(fā)性肝癌相似度更高；而且相較于裸鼠載體，兔可進(jìn)行肝動脈、門靜脈插管，便于經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）相關(guān)研究。本研究通過不同方法構(gòu)建肝VX2原位種植瘤術(shù)后模型，以期為肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)研究提供有效的動物載體。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級新西蘭大白兔16只（購于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動物實驗中心并飼養(yǎng)于動物房），雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.4 kg，健康狀況良好。VX2瘤株由上海市腫瘤研究所提供。本研究經(jīng)醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（編號2019-071）。

1.2 肝臟VX2原位移植瘤模型的構(gòu)建

37 ℃水浴復(fù)蘇VX2腫瘤組織，生理鹽水漂洗后剪成1 mm3瘤塊備用，隨機取1只實驗兔經(jīng)耳緣靜脈按5 mL/kg劑量注射10%水合氯醛（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）麻醉后，用20 G注射器針頭將瘤塊接種于后腿肌間隙制成種兔。2周后腫瘤長至1～2 cm時空氣栓塞法處死種兔，無菌條件下取出瘤塊，選取瘤體周邊生長旺盛的魚肉樣組織，生理鹽水漂洗后用眼科剪剪至大小約1 mm3備用。

15只實驗兔使用10%水合氯醛（5 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，腹部備皮、5%聚維酮碘溶液消毒、鋪巾，沿劍突下腹中線切開約2 cm，暴露肝左葉，直視下用20 G針頭在肝臟組織中分離深約l cm的竇道，將1塊修剪好的瘤塊植入竇道內(nèi)，填塞約1 mm3明膠海綿后用無菌棉簽按壓止血后將肝臟還納入腹腔，然后逐層縫合，關(guān)閉腹腔，制成荷瘤兔。麻醉蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)，術(shù)后每天肌注40萬單位青霉素，連續(xù)注射3 d。

1.3 肝原位種植瘤術(shù)后模型的構(gòu)建及實驗分組

移植后7 d行超聲檢查顯示15只荷瘤兔肝臟均成瘤，隨機分為3組：R0切除組，以葉間切跡為標(biāo)準(zhǔn)行肝左葉部分切除術(shù)，手術(shù)部位無滲血后于肝切口旁同一肝葉行內(nèi)隧道法植入約1 mm3瘤塊，方法同上，然后將肝臟還納入腹腔后逐層關(guān)腹；R1切除組，以瘤體邊緣為界行肝左葉瘤體切除術(shù)，明膠海綿按壓止血后還納肝臟，逐層關(guān)閉腹腔；R2切除，瘤體部分切除術(shù)，直視下切除約1/2腫瘤組織后明膠海綿按壓止血，然后還納肝臟，逐層關(guān)閉腹腔。記錄3組實驗兔手術(shù)時間，麻醉蘇醒后放回籠中飼養(yǎng)，術(shù)后每天肌注40萬單位青霉素，連續(xù)注射3 d。

1.4 超聲檢查

VX2腫瘤原位移植后第7天，術(shù)后第7、14、21天行超聲檢查。采用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的Mindray Reason 8超聲診斷儀，使用頻率為7～11 MHz的線陣探頭L11-3U，在超聲造影（contrast-enhanced ultrasound，CEUS）模式下經(jīng)耳緣靜脈彈丸注射意大利Bracco公司生產(chǎn)的聲諾維（SonoVue）0.6 mL，隨后推注2 mL生理鹽水沖管。

常規(guī)超聲觀察肝臟VX2腫瘤生長及血供情況，包括病灶數(shù)目、大小、內(nèi)部回聲（低回聲、等回聲、高回聲）、回聲均勻性（均勻、不均勻）、邊界（清晰、不清晰）、形態(tài)（規(guī)則、不規(guī)則）、鈣化（點狀、短線狀、無）；彩色多普勒血流成像（color Doppler flow imaging，CDFI）顯示血流信號的分布（周邊、內(nèi)部、周邊及內(nèi)部、無）和形態(tài)（點狀、短線狀、無）；在CEUS模式下觀察腫瘤的增強模式。

1.5 取材與病理學(xué)檢查

實驗結(jié)束后空氣栓塞法處死實驗兔，打開腹腔，觀察各實驗兔腹腔、網(wǎng)膜、肺、腎、脾有無轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。切取肝臟VX2腫瘤，書頁狀切開，觀察腫瘤的數(shù)目、顏色、形態(tài)等特征；并對其他臟器組織取材，浸泡在4%的中性多聚甲醛溶液中固定后石蠟包埋，行H-E染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0分析軟件，計量資料以中位數(shù)M（P25，P75）表示，組間比較用Kruskal-Wallis秩和檢驗。計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用Fisher精確概率檢驗，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)性檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 模型構(gòu)建的情況

肝左葉VX2腫瘤種植后第7天，超聲檢查15只實驗兔肝臟成瘤，成瘤率100%。術(shù)后復(fù)發(fā)模型中，R0切除組（n=5）手術(shù)時間為25（23～30）s，R1切除組（n=5）手術(shù)時間為22（19～26）s，R2切除組（n=5）手術(shù)時間為23（22～25）s，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。R0切除組中1只實驗兔術(shù)后第2天死亡，開腹后見腹腔積血及凝血塊，考慮術(shù)后出血，余14只實驗兔存活至實驗結(jié)束。

2.2 不同時間點術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)VX2腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移情況

術(shù)后第7、14、21天行常規(guī)超聲及CEUS檢查，3組腫瘤隨著時間而增大，且R2切除組腫瘤大于R0切除組及R1切除組，腫瘤形態(tài)不規(guī)則，呈融合狀，但R0切除組和R1切除組腫瘤大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。R2切除組肝內(nèi)多發(fā)腫瘤（5/5，100%）、肺轉(zhuǎn)移（5/5，100%）及肝門處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（4/5，80%）的比例高于R0切除組和R1切除組。3組術(shù)后復(fù)發(fā)肝VX2腫瘤不同時間點生長及轉(zhuǎn)移的情況見表1。R0、R1、R2切除組常規(guī)超聲、CEUS及術(shù)后病理學(xué)情況分別見圖1～3。

表1 3組術(shù)后復(fù)發(fā)肝VX2腫瘤不同時間點生長及轉(zhuǎn)移的情況

圖1 R0切除組實驗兔CEUS圖像及病理學(xué)表現(xiàn)

圖2 R1切除組實驗兔CEUS及大體標(biāo)本圖像

圖3 R2切除組實驗兔CEUS及大體標(biāo)本圖像

2.3 不同時間點術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)VX2腫瘤的常規(guī)超聲特征

常規(guī)超聲上所有肝內(nèi)復(fù)發(fā)VX2腫瘤均呈低回聲，在第7、14、21天，腫瘤內(nèi)部回聲不均勻（50.0%、92.9%、100.0%，P=0.03）、鈣化（50.0%、85.7%、71.4%，P=0.001）的比例逐漸增高，而且腫瘤內(nèi)部回聲不均勻與時間呈顯著相關(guān)（r=-0.518）。術(shù)后復(fù)發(fā)肝VX2腫瘤常規(guī)超聲及CEUS分析見表2。

表2 術(shù)后復(fù)發(fā)肝VX2腫瘤常規(guī)超聲及CEUS分析 n（%）

2.4 不同時間點術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)VX2腫瘤的CEUS特征

經(jīng)耳緣靜脈注射造影劑后，所有VX2腫瘤表現(xiàn)為快速高回聲增強，第7天42.9%（6/14）的腫瘤呈整體增強；第14天及第21天，分別有64.3%（9/14）和28.6%（4/14）的腫瘤表現(xiàn)為整體不均勻增強，35.7%（5/14）和71.4%（10/14）的腫瘤呈環(huán)狀增強（P=0.000），增強方式與時間呈顯著相關(guān)性（r=0.632）。

VX2腫瘤開始高回聲增強時間及低回聲增強時間周圍早于肝實質(zhì)，呈“快進(jìn)快出”的增強模式，但腫瘤及肝實質(zhì)增強時間與時間無明顯相關(guān)性（r分別為0.007、0.092、-0.135）。不同時間術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)VX2腫瘤的CEUS特征見表3。

表3 不同時間點術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)VX2腫瘤的CEUS特征

3 討 論

TACE、射頻消融術(shù)、分子靶向治療是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的主要治療方法，但效果不盡滿意，患者術(shù)后5年總生存率僅30%～40%［5］。近年來，載藥微球等新型栓塞材料、熱消融的增效方法、免疫治療及多種治療方案的聯(lián)合應(yīng)用等研究［6-7］一直是腫瘤治療領(lǐng)域的熱點，急需適宜的動物模型評價其有效性及安全性。肝癌的荷瘤動物載體通常使用小鼠和兔，小鼠體型較小、血管細(xì)，不適用于TACE、手術(shù)等治療方法的研究，而兔體型較大適于經(jīng)肝動脈治療的實驗研究。而且兔VX2腫瘤血供豐富，生長周期短，模型構(gòu)建方法簡便易行，是目前TACE相關(guān)研究較為廣泛的肝癌實驗?zāi)Ｐ停?］。既往兔VX2腫瘤的研究［9］主要關(guān)注腫瘤的移植部位、肝原位移植瘤的移植方法等，而肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)模型的研究較少。

復(fù)發(fā)性肝癌與原發(fā)性肝癌臨床特征存在一定差異，復(fù)發(fā)性肝癌數(shù)目較多、手術(shù)切除導(dǎo)致解剖結(jié)構(gòu)的變化影響后續(xù)治療而且對肝臟儲備功能造成損傷［10］。因而肝臟原位移植瘤模型在腫瘤的血管生成、侵襲性及對藥物治療的敏感性方面與肝癌切除術(shù)后模型有所不同，術(shù)后復(fù)發(fā)模型較原位移植瘤模型在評估腫瘤藥物及微創(chuàng)治療效果方面更加具有優(yōu)勢［11］。而且，既往研究［12］中常用的裸鼠等免疫缺陷動物的肝癌移植瘤模型由于免疫功能的缺失既不符合人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展的模式又容易發(fā)生感染，本實驗使用的新西蘭大白兔彌補了此項不足。

超聲是肝臟腫瘤的首選檢查方式，VX2腫瘤表現(xiàn)為低回聲，邊界欠清，隨著腫瘤增大，出現(xiàn)內(nèi)部回聲不均勻，點狀及短線狀鈣化，與劉婭等［9］研究結(jié)果相似。我們還觀察了CEUS不同時期VX2腫瘤的生長狀態(tài)和血供情況，VX2腫瘤主要由肝動脈供血，在CEUS表現(xiàn)為“快進(jìn)快出”的增強模式，與人類惡性腫瘤相似［13］。VX2腫瘤較小時主要表現(xiàn)為整體均勻增強，隨著腫瘤增大而表現(xiàn)為整體不均勻增強和環(huán)狀增強，可能與腫瘤中央壞死、向周邊浸潤性生長有關(guān)［14］。常規(guī)超聲結(jié)合CEUS檢查從大小和血供等角度顯示VX2腫瘤的生長狀況，一方面為評估腫瘤的生長特征提供更多的信息，另一方面為研究時開始干預(yù)時間的選擇提供合理的依據(jù)，腫瘤過小不便于影像學(xué)診斷研究，而腫瘤內(nèi)部壞死較多時影響實驗治療后的療效評估。

本研究構(gòu)建的3種模型均出現(xiàn)肝內(nèi)術(shù)后復(fù)發(fā)VX2腫瘤。R2切除組的實驗兔肝內(nèi)復(fù)發(fā)腫瘤生長速度較快，腫瘤的數(shù)目多于R0和R1切除組，而且R2切除組的術(shù)后復(fù)發(fā)腫瘤呈融合狀，形態(tài)不規(guī)則，較早出現(xiàn)中央壞死。肝外轉(zhuǎn)移方面，R2切除組實驗兔肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、肝門處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目也多于R0和R1切除組，具有較強的局部侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點，適合進(jìn)展期肝癌綜合治療及計算機體層成像（computed tomography，CT）/磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）或正電子發(fā)射體層成像（positron emission tomography，PET）/CT等影像學(xué)相關(guān)研究，而不適用于超聲診斷的實驗研究［15］。

R0切除組荷瘤兔需要較高的無菌條件和一定的外科手術(shù)技能，實驗兔術(shù)后創(chuàng)口大量出血等并發(fā)癥發(fā)生率較高。而R1切除組手術(shù)操作相對簡便，造模成功率高，腫瘤在肝內(nèi)以單發(fā)為主，也出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，適合肝臟惡性腫瘤的超聲及其他影像學(xué)研究，便于TACE、射頻消融術(shù)等局部治療或靶向治療等全身治療，是研究肝癌手術(shù)后復(fù)發(fā)較理想的模型。

本研究有一定的局限性，超聲檢查在評價多發(fā)病變方面存在不足，后續(xù)我們將會使用CT/MRI等影像學(xué)檢查方法檢測VX2腫瘤的生長特征；而且實驗中研究的樣本量較小，在以后的研究中會逐步擴大實驗規(guī)模并進(jìn)行改進(jìn)。

綜上所述，本研究建立了兔VX2肝癌術(shù)后模型，為后期研究提供可靠的動物荷瘤載體。