盧煒樂(lè)

（中山市黃圃鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，廣東中山 528429）

土沉香作為一種瑞香科，沉香屬喬木，是我國(guó)生產(chǎn)沉香的唯一植物資源。現(xiàn)有土沉香大多分布于我國(guó)廣東、廣西、海南、福建等區(qū)域內(nèi)的低海拔山地、丘陵地區(qū)[1]。不過(guò)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的持續(xù)發(fā)展，我國(guó)沉香植物的正常生長(zhǎng)也受到一定影響。如今土沉香已經(jīng)被列入《國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物名錄》以及《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》，屬于易危類(lèi)植物。因此，對(duì)沉香余生組織培養(yǎng)進(jìn)行研究分析，進(jìn)而為土沉香資源進(jìn)行保護(hù)、保存提高技術(shù)支持，將有著重要的研究意義[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的土沉香材料均來(lái)自于廣東省中山市、江門(mén)市的土沉香當(dāng)年生嫩枝。采集的材料在帶回實(shí)驗(yàn)室后均需要置于盛有洗潔精溶液的燒杯中進(jìn)行攪拌處理，具體攪拌時(shí)間應(yīng)控制在5min 左右，之后用清水對(duì)攪拌處理后的材料進(jìn)行沖洗處理，確保材料完全清洗干凈后，將材料置于無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行保存，以待后續(xù)試驗(yàn)使用。在試驗(yàn)開(kāi)始后，在無(wú)菌環(huán)境下用70%的酒精對(duì)材料消毒處理30s 以上。然后置于濃度為0.2%的升汞溶液中進(jìn)行滅菌處理，滅菌時(shí)間控制在8min 左右。最后，用無(wú)菌水沖洗材料，沖洗次數(shù)通常為5～6 次。沖洗完成后分別取嫩枝材料中的葉片和莖段進(jìn)行土沉香誘導(dǎo)愈傷組織試驗(yàn)，其中葉片大小標(biāo)準(zhǔn)為0.5cm×0.5cm；莖段長(zhǎng)度為準(zhǔn)為0.5cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)土沉香愈傷組織培養(yǎng)及不定芽分化的影響。以MS 為基本培養(yǎng)基，添加30g/L 蔗糖、8g/L 瓊脂、0.1g/L 肌醇，并將培養(yǎng)基pH 值控制在5.8～6.0 區(qū)間內(nèi)。然后設(shè)計(jì)加入不同濃度的2,4-D、NAA、BAP 單劑及其組合共10 個(gè)處理（詳見(jiàn)表1），完成培養(yǎng)基封裝后，在1.1kg/cm2的壓力環(huán)境下，以121℃對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，具體處理時(shí)間應(yīng)控制在15min 左右，用于土沉香誘導(dǎo)愈傷組織。每個(gè)處理接種2 瓶培養(yǎng)瓶，并在每個(gè)培養(yǎng)瓶中置于8 片標(biāo)準(zhǔn)葉片或8 個(gè)莖段，重復(fù)3 次。完成后的10d，培養(yǎng)瓶中的部分葉片或者莖段外植體的傷端開(kāi)始生產(chǎn)愈傷組織，30d 后，培養(yǎng)瓶中的葉片或莖段外植體均形成愈傷組織。此時(shí)對(duì)培養(yǎng)瓶中的愈傷組織培養(yǎng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

1.2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)土沉香芽增殖的影響。根據(jù)土沉香愈傷組織培養(yǎng)及不定芽分化的效果，采用莖段外植體愈傷組織所分化出的不定芽進(jìn)行增殖試驗(yàn)。試驗(yàn)共設(shè)不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素8 個(gè)處理（詳見(jiàn)表2），經(jīng)過(guò)7d 的培養(yǎng)后，芽體基部均開(kāi)始出現(xiàn)膨脹，并于20d 后整體芽體均已完全膨脹，,繼續(xù)對(duì)芽體進(jìn)行培養(yǎng)，于50d 后對(duì)所有芽體的增殖情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)生根誘導(dǎo)的影響。對(duì)土沉香莖段外植體愈傷組織叢生芽進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，待叢生芽高度長(zhǎng)至1.5cm～2.5cm，并且具有3～4 片小葉時(shí)，將分株后的單株移入到12 個(gè)含有不同濃度的NAA 或者IBA 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，并于30d 后統(tǒng)計(jì)單株的生根率。

1.3 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)中培養(yǎng)環(huán)境溫度控制在25±2℃，在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中采用暗培養(yǎng)方式，其他階段則以日光燈作為光源進(jìn)行光下培養(yǎng)，此過(guò)程中每天將光照時(shí)間控制在12h，具體光照強(qiáng)度控制在15～25μmol/m2/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)愈傷組織培養(yǎng)的影響

由表1 可知BAP 對(duì)土沉香生成愈傷組織的影響相對(duì)較大，具體表現(xiàn)為所有添加有BAP 的培養(yǎng)基在接種后均會(huì)一定程度上影響土沉香愈傷組織的形成及培養(yǎng)，并且隨著培養(yǎng)基中BAP 濃度的持續(xù)增加，土沉香愈傷組織的培養(yǎng)效率也越低，甚至在完全采用BAP 進(jìn)行土沉香外植體愈傷組織培養(yǎng)時(shí)會(huì)直接導(dǎo)致外植體未形成愈傷組織。若僅采用NAA 或者2,4-D 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素進(jìn)行土沉香外植體愈傷組織培養(yǎng)，則會(huì)導(dǎo)致外植體愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中的誘導(dǎo)率不足，尤其是在僅采用2,4-D 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的情況下，葉片和莖段2 種土沉香外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率僅有52.5%和57.2%。結(jié)合不同外植體對(duì)愈傷生長(zhǎng)速度來(lái)看，雖然所采用的外植體分別為土沉香的莖段和葉片，實(shí)際形態(tài)及結(jié)構(gòu)均存在較大差異，但不同外植體對(duì)土沉香愈傷組織誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)速度的影響較不明顯[5]。在深入研究后可以發(fā)現(xiàn)，莖段外植體所分化形成的愈傷組織較為稀松，而葉片外植體所分化形成的愈傷組織則較為硬密，試驗(yàn)結(jié)果表明，0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA 的組合生長(zhǎng)率，對(duì)愈傷組織的分化最快。

表1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)土沉香莖段和葉片外植體愈傷組織的產(chǎn)生及芽分化情況影響

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)芽分化的影響

由表1 可知，在所有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素中，濃度為1.0mg/L BAP+0.5mg/L NAA 組合使用后的土沉香外植體愈傷組織不定芽分化率最高，莖段外植體和葉片外植體的不定芽分化率分別為69.3%和47.7%，但是也存在生長(zhǎng)速度極慢的缺點(diǎn)，考慮生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織的作用，分化率越高越好，因此土沉香不定芽分化最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素組合為1.0mg/L BAP+0.5mg/L NAA。

2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)芽增殖的影響

由表2 可知，相對(duì)來(lái)說(shuō)，不含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的培養(yǎng)基內(nèi)的不定芽增殖系數(shù)最低，說(shuō)明不采用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素雖然可以實(shí)現(xiàn)芽增殖效果，但整體增長(zhǎng)效率較低，不符合當(dāng)前土沉香愈傷組織培養(yǎng)需求。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)芽增殖的影響

在培養(yǎng)基僅含有BAP 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的情況下，隨著培養(yǎng)基中BAP 濃度的持續(xù)增加，新芽體數(shù)量在增加，但不定芽的增殖系數(shù)卻在持續(xù)下降，說(shuō)明雖然較高濃度的BAP 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素有利于不定芽的增殖生長(zhǎng)。

在BAP 和NAA 組合型生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素方面，較高濃度的NAA 和BAP 也會(huì)抑制不定芽的增殖生長(zhǎng)。此種情況再次驗(yàn)證生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素濃度過(guò)高不利于不定芽的增長(zhǎng)生長(zhǎng)，所以在進(jìn)行不定芽增殖培育過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的實(shí)際濃度。綜合來(lái)看，芽增殖最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素為0.05mg/L BAP。

2.4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

由表3 可知，NAA 和IBA 兩類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素中，NAA有著較強(qiáng)的生根率促進(jìn)效果，且隨著濃度的升高土沉香生根率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，NAA 濃度超過(guò)0.02mg/L 以后，濃度越高，抑制單株生根效果越強(qiáng)。而不采用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素或者是采用IBA 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素均無(wú)法促使單株生根。因此，為保障單株的生根率，應(yīng)優(yōu)先采用NAA 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，且以0.02mg/L NAA 生根培養(yǎng)效果最佳。

表3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)生根誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)果與討論

研究結(jié)果表明，濃度為0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA的組合生長(zhǎng)率，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率100%，分化最快。濃度分別為1.0mg/LBAP+0.5mg/LNAA 的組合型生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)不定芽分化的分化率最高，顏色也為淺綠，應(yīng)優(yōu)先采用此種組合進(jìn)行不定芽培養(yǎng)。相較于采用BAP 和NAA 組合型生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，僅采用單一的BAP 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素更有利于不定芽的增殖生長(zhǎng)。因此，在土沉香莖段外植體愈傷組織不定芽增殖培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)優(yōu)先采用濃度為0.05mg/L 的BAP 作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素。

相較于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素直接生根誘導(dǎo)來(lái)說(shuō)，間接生根誘導(dǎo)的生根率更快。同時(shí)，間接生根誘導(dǎo)中，NAA 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的濃度控制在1.0mg/L。

通過(guò)誘導(dǎo)土沉香愈傷組織培養(yǎng)，并針對(duì)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)土沉香莖段和葉片外植體愈傷組織的產(chǎn)生及芽分化的影響進(jìn)行分析。結(jié)果與中國(guó)華南研究所土沉香愈傷組織培養(yǎng)及植株再生研究，不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)莖段和外植體愈傷組織分化的研究濃度為0.1mg/L BAP+0.5mg/L NAA 的組合生長(zhǎng)率，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率100%，分化最快。濃度分別為1.0mg/LBAP+0.5mg/LNAA 的組合型生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素對(duì)不定芽分化的分化率最高，僅采用單一的BAP 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素更有利于不定芽的增殖生長(zhǎng)，NAA 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素的濃度控制在1.0mg/L 最好，試驗(yàn)方向和結(jié)果一致。