唐 超，肖 琦，付 鵬

（1.重慶安全技術(shù)職業(yè)學(xué)院 安全監(jiān)督管理系，重慶 404020；2.重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404100）

酵素是指以一種或多種原料經(jīng)過(guò)發(fā)酵而得到的具有某種生理功能的產(chǎn)品[1-2]，常見的水果、蔬菜均可作為酵素發(fā)酵的原料。目前市場(chǎng)上大量的酵素食品被開發(fā)，如桑葚酵素、蔓越莓酵素、水果酵素、蔬菜酵素等[3-4]，在民眾關(guān)注此類產(chǎn)品各種功效時(shí)，也應(yīng)關(guān)注此類產(chǎn)品的質(zhì)量安全。據(jù)報(bào)道，桑葚、蔓越莓等易感染螨蟲的農(nóng)產(chǎn)品中被檢測(cè)出有敵螨普殘留，此外多種蔬菜中也存在敵螨普殘留的風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。敵螨普是一種允許在蔬菜、水果生長(zhǎng)過(guò)程中使用的殺菌殺螨劑[8-9]，但是具有一定的發(fā)育毒性，可致胎兒畸形，特別是近年來(lái)，濫用農(nóng)藥引發(fā)的植物源性食品質(zhì)量安全事故引起消費(fèi)者越來(lái)越多的關(guān)注[10]。在國(guó)標(biāo)GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中僅規(guī)定敵螨普在部分蔬菜、水果中有最大殘留限量，但是缺少相對(duì)應(yīng)的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法。針對(duì)以一種或者多種水果、蔬菜為主要原料制成的各類酵素產(chǎn)品，對(duì)敵螨普等相關(guān)農(nóng)藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估也很難開展[11-12]，因此有必要開發(fā)一種快速、實(shí)用的檢測(cè)其中敵螨普殘留的方法。

目前，對(duì)于食品中敵螨普檢測(cè)方法主要?dú)庀嗌V法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]。氣相色譜法雖然穩(wěn)定性較好，但是產(chǎn)品中含有發(fā)酵產(chǎn)生的酚類、有機(jī)酸等組分，高溫氣化后易對(duì)待測(cè)組分產(chǎn)生干擾，造成定量不準(zhǔn)確；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、目標(biāo)物的選擇性較好，但是對(duì)儀器和人員有較高要求，檢測(cè)成本較高。加壓毛細(xì)管電色譜（pressurized capillary electrochromatography，pCEC）技術(shù)是一種結(jié)合毛細(xì)管電泳的高柱效性和高效液相色譜的高選擇性兩者優(yōu)點(diǎn)的新型電動(dòng)微分離技術(shù)[16-17]，此方法的雙重分離機(jī)理適用于復(fù)雜樣品基質(zhì)中目標(biāo)物的分離檢測(cè)。本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化加壓毛細(xì)管電色譜的各項(xiàng)檢測(cè)條件以及前處理過(guò)程，建立了一種快速、簡(jiǎn)便的pCEC法分析酵素中敵螨普含量，為快速檢測(cè)酵素中敵螨普殘留量提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵螨普（純度98.5%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國(guó)Merck公司；磷酸鉀（分析純）：國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2100型加壓毛細(xì)管電色譜系統(tǒng)：美國(guó)賽默飛公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司；親水親油平衡（hydrophilelipophile balance，HLB）小柱、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）小柱和多壁碳納米管（multi walled carbon nanotubes，MWCNTS）小柱（3 mg）：美國(guó)Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 儀器條件

色譜柱為C18毛細(xì)管填充柱（100 μm×45 cm，3 μm）；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.3.2 流動(dòng)相體系的優(yōu)化

流動(dòng)相中有機(jī)相的種類、有機(jī)相的比例、鹽溶液的濃度以及pH值等因素都會(huì)影響到目標(biāo)物在加壓毛細(xì)管電色譜中的分離效果[18-20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相體系中不同的因素有機(jī)相的種類（甲醇、乙腈）、有機(jī)相的比例（10%、15%、20%）、磷酸鉀緩沖鹽溶液的濃度（10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L）及pH值（4.0、4.7、6.0、7.0）進(jìn)行比較，分別考察以上不同因素對(duì)敵螨普保留時(shí)間和分離度的影響。

1.3.3 電壓強(qiáng)度的選擇

加壓毛細(xì)管電色譜中施加電壓強(qiáng)度的不同會(huì)直接改變電滲流作用力的大小及方向，導(dǎo)致目標(biāo)物在加壓毛細(xì)管電色譜中不同的分離效果。本實(shí)驗(yàn)分別施加-6 kV、-4 kV、-2 kV、0、+2 kV、+4 kV負(fù)向或正向電壓，分別比較在以上不同電壓下敵螨普在加壓毛細(xì)管電色譜中的分離能力和分離速度。

1.3.4 前處理方式的選擇

酵素基質(zhì)中干擾物較多，為了提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度，分別對(duì)試驗(yàn)中提取液的種類、固相萃取柱類型進(jìn)行選擇優(yōu)化[21-23]。其中提取液分別比較了20%乙腈水溶液、20%乙醇水溶液、20%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）、20%乙腈水溶液（含0.1%氨水）和0.1%氨水溶液，考察對(duì)樣品中除雜質(zhì)效果以及目標(biāo)化合物回收率的影響；固相萃取選擇保留機(jī)理不同的3種固相萃取柱HLB柱、GCB柱和MWCNTS柱，考察對(duì)提取液中去除干擾物和富集目標(biāo)組分的影響。

試驗(yàn)具體步驟為稱取2.0 g樣品至25 mL刻度具塞管中，加入提取液定容至刻度線后超聲20 min，過(guò)濾后取上清液進(jìn)行固相萃取。3款固相萃取柱HLB柱、GCB柱和MWCNTS柱依據(jù)各自的固相萃取步驟進(jìn)行后，收集濾液過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

稱取適量敵螨普標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解配制成100.0μg/mL的儲(chǔ)備液，臨用前以流動(dòng)相配制成質(zhì)量濃度分別為1.0ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100.0 ng/mL、200.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中檢出限（limit of detection，LOD）以信噪比（S/N）=3計(jì)算，定量限（limit of quantitation，LOQ）以信噪比（S/N）=10計(jì)算，并對(duì)方法的加標(biāo)回收率、精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相體系的優(yōu)化

2.1.1 有機(jī)相種類的選擇

由圖1可知，流動(dòng)相中有機(jī)相的不同主要是影響到敵螨普的出峰時(shí)間及色譜峰的峰形。當(dāng)有機(jī)相為甲醇時(shí)，樣品中的干擾物會(huì)對(duì)敵螨普的色譜峰存在一定的干擾，且出峰時(shí)間較長(zhǎng)；而有機(jī)相為乙腈時(shí)，敵螨普的色譜峰分離度較好，出峰時(shí)間也合適，因此選擇乙腈作為流動(dòng)相體系的有機(jī)相。

圖1 甲醇和乙腈對(duì)敵螨普分離效果的影響Fig.1 Effect of methanol and acetonitrile on separation of dipteroparasin

2.1.2 乙腈比例的選擇

流動(dòng)相體系中乙腈比例會(huì)影響流動(dòng)相體系的極性，從而影響目標(biāo)組分的色譜保留行為[24-26]。實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較流動(dòng)相中乙腈的不同比例（10%、15%、20%），考察其對(duì)敵螨普分離效果的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)流動(dòng)相中乙腈比例為10%時(shí)，流動(dòng)相體系的極性相對(duì)較大，敵螨普的出峰時(shí)間較晚，且與樣品中的雜質(zhì)分離度較差；而在乙腈比例為20%時(shí)，流動(dòng)相體系的洗脫能力較強(qiáng)，敵螨普出峰時(shí)間提前，但與雜質(zhì)峰不能完全分離；樣品中的敵螨普組分在流動(dòng)相中乙腈比例為15%時(shí)，分離度最好，能與雜質(zhì)峰分開，不受干擾。所以選擇15%的乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相比例。

圖2 不同乙腈比例對(duì)敵螨普分離效果的影響Fig.2 Effect of different acetonitrile ratio on separation of dipteroparasin

2.1.3 磷酸鉀緩沖液濃度選擇

在乙腈-磷酸鉀緩沖液（15∶85，V/V）的流動(dòng)相體系中，考察了磷酸鉀緩沖液濃度（10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L）對(duì)敵螨普分離效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 緩沖液濃度對(duì)敵螨普分離效果的影響Fig.3 Effect of buffer concentration on separation of dipteroparasin

由圖3可知，當(dāng)磷酸鉀緩沖液濃度為20 mmol/L時(shí)，樣品中敵螨普目標(biāo)峰與相鄰雜質(zhì)峰重疊，這是由于電泳中高焦耳熱的影響，樣品中敵螨普目標(biāo)峰增寬嚴(yán)重，柱效下降。當(dāng)磷酸鉀緩沖液濃度為10 mmol/L或者15 mmol/L時(shí)，敵螨普目標(biāo)峰都能與相鄰雜質(zhì)峰分開，但后者的分離度更好一些，所以選擇15 mmol/L磷酸鉀溶液作為流動(dòng)相緩沖液。

2.1.4 磷酸鉀緩沖液pH值的選擇

在確定流動(dòng)相條件下，分別考察不同pH值的磷酸鉀緩沖液pH（pH4.0、pH 4.7、pH 6.0、pH 7.0）對(duì)敵螨普分離效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 緩沖液pH值對(duì)敵螨普分離效果的影響Fig.4 Effect of buffer pH on separation of dipteroparasin

由圖4可知，磷酸鉀緩沖液的pH值主要是對(duì)敵螨普與干擾物的分離度影響較顯著。當(dāng)緩沖溶液pH值為7.0或者6.0時(shí)，敵螨普與相鄰干擾物的雜質(zhì)峰分離度較低，影響定量的準(zhǔn)確性；而在緩沖溶液pH值為4.0和4.7時(shí)，樣品的電泳譜圖中敵螨普的目標(biāo)峰分離較好，出峰時(shí)間適宜，并且緩沖溶液直接配制后的pH值即為4.7，無(wú)需進(jìn)一步調(diào)節(jié)，節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間，所以選擇4.7作為磷酸鉀緩沖溶液pH值。

2.2 分離電壓的選擇

在采用乙腈-15 mmol/L pH 4.7磷酸鉀緩沖液（15∶85，V/V）為流動(dòng)相，分別施加+4 kV、+2 kV、0的正向電壓和-2 kV、-4 kV、-6 kV的負(fù)向電壓，考察分離電壓對(duì)敵螨普分離效果的影響。

由圖5a～圖5c可知，分別施加-6 kV、-4 kV、-2 kV負(fù)向電壓時(shí)，對(duì)樣品中敵螨普的出峰時(shí)間影響較小。這是因?yàn)樵诿?xì)管電泳出口端施加負(fù)向電壓時(shí)，電滲流方向朝向毛細(xì)管入口端，與系統(tǒng)中壓力流方向相反，電滲流作用力與壓力流以及電場(chǎng)力相互作用，使得敵螨普的電泳表觀淌度減小，表現(xiàn)為目標(biāo)組分出峰時(shí)間變化不大。0電壓情況下，敵螨普與雜質(zhì)峰重疊（圖5d）。

圖5 分離電壓對(duì)樣品中敵螨普分離效果的影響Fig.5 Effect of separation voltage on separation of dipteroparasin

由圖5e和5f可知，施加正向電壓時(shí)，在電滲流作用力的推動(dòng)下敵螨普的分離速度明顯加快，同時(shí)色譜峰形變窄。施加電壓為+2 kV時(shí)，敵螨普的出峰時(shí)間為18 min左右，并且與雜質(zhì)峰完全分離；當(dāng)施加電壓為+4 kV時(shí)，敵螨普的出峰時(shí)間變短，但分離度有所降低。綜合考慮出峰時(shí)間、分離度以及靈敏度，選擇+2 kV作為較優(yōu)的施加電壓。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)條件，敵螨普在1.0～200.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍呈線性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敵螨普在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，具體結(jié)果見表1。

表1 敵螨普的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time,standard curve regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of dipteroparasin

2.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的選擇

選用添加目標(biāo)組分?jǐn)瞅盏慕退貫閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，考察不同提取液對(duì)目標(biāo)物組分峰面積及電色譜圖的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同提取溶劑提取后樣品的pCEC譜圖Fig.6 pCEC chromatograms of samples after extraction with different extraction solvents

由圖6可知，5種提取溶劑體現(xiàn)在樣品峰面積上是20%乙腈水溶液的效果最好，其他提取方式的圖譜上的目標(biāo)峰面積較小或者有雜質(zhì)峰干擾，且20%乙腈水溶液方便易得，提取時(shí)不易發(fā)生乳化現(xiàn)象，因此本研究選擇20%乙腈水溶液進(jìn)行提取。

2.4.2 固相萃取柱的選擇

考慮提取液中還會(huì)含有小分子酸、酚類、糖類等雜質(zhì)成分對(duì)目標(biāo)組分產(chǎn)生干擾，前處理一般會(huì)選擇固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法和分散固相萃?。╭uick-easycheap-effective-rugged-safe，QuEChERS）法進(jìn)行凈化。但是針對(duì)敵螨普農(nóng)藥殘留采用QuEChERS方法時(shí)，需要對(duì)其中GCB、C18和乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）三者的配比進(jìn)行綜合考察優(yōu)化，由于實(shí)際樣品基質(zhì)復(fù)雜多變，單一配比無(wú)法應(yīng)對(duì)所有類型樣品，具有一定局限性。本研究采用更為通用的固相萃取法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別比較了HLB柱、GCB柱和MWCNTS柱的凈化效果，以敵螨普的加標(biāo)回收率為比較依據(jù)，分析這3種固相萃取柱對(duì)目標(biāo)組分凈化效果的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 提取液經(jīng)不同固相萃取小柱處理后回收率的比較Fig.7 Comparison of recovery rates of extracting solution treated with different solid phase extraction columns

由圖7可知，采用HLB小柱效果較好，敵螨普的加標(biāo)回收率最高，且與MWCNTS柱和GCB柱間敵螨普組分的峰面積差異顯著（P＜0.05）。這是由于MWCNTS柱和GCB柱的特異選擇性強(qiáng)，敵螨普不能很好地保留在小柱上；而HLB固相萃取小柱適用范圍廣，適合大多數(shù)化合物的分離，能將敵螨普非常好地保留住，所以使用HLB小柱回收效果最好。本試驗(yàn)采用了新型PRiME HLB固相萃取柱，采用的是樣品提取液通過(guò)型凈化方式，相比以前富集型HLB小柱節(jié)省了時(shí)間，提高了試驗(yàn)效率，故選擇PRiME HLB固相萃取小柱作為前處理的凈化柱。

2.5 加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)

在加標(biāo)回收率試驗(yàn)中，選用桑葚酵素、蘋果酵素、水果酵素、蔬菜酵素4種酵素樣品中添加敵螨普，分別添加3.0μg/kg、10.0 μg/kg、30.0 μg/kg三個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率以及精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表2。

表2 方法的加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 2 Results of standard recovery and precision tests of the method (n=5)

由表2可見，敵螨普的3個(gè)水平的加標(biāo)回收率為85.6%～92.9%，重復(fù)測(cè)定5次的RSD為2.83%～5.12%，表明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法能夠滿足檢測(cè)實(shí)際樣品需要。

2.6 重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)

在上述優(yōu)化后的方法條件下，對(duì)敵螨普標(biāo)準(zhǔn)溶液（20.0 ng/mL）進(jìn)行加壓毛細(xì)管電色譜法檢測(cè)分析，連續(xù)測(cè)定7 d，每天進(jìn)樣5次，測(cè)定敵螨普組分保留時(shí)間和峰面積的日間和日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果顯示，敵螨普保留時(shí)間的日間和日內(nèi)RSD范圍分別為3.2%～6.3%和3.6%～4.7%；峰面積的日間和日內(nèi)RSD范圍分別為3.8%～6.3%和3.5%～4.6%，說(shuō)明該方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好。

2.7 樣品的測(cè)定

在上述優(yōu)化條件下，隨機(jī)抽取了市售10批次的酵素樣品，包含桑葚酵素、蘋果酵素、草莓酵素、玫瑰花酵素、蔓越莓酵素、水果酵素、蔬菜酵素等，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)批次中有檢出，分別為0.06 mg/kg和0.12 mg/kg，其他批次未檢出，參照草莓中限量值為0.5 mg/kg，整體情況良好。

3 結(jié)論

本研究建立了一種加壓毛細(xì)管電色譜法測(cè)定酵素中敵螨普殘留量的方法。該方法前處理以20%乙腈水溶液作為提取溶劑，結(jié)合PRiME HLB小柱凈化，簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，提高了效率。以乙腈-15 mmol/L pH 4.7磷酸鉀緩沖液（15∶85，V/V）為流動(dòng)相，在電壓強(qiáng)度＋2 kV條件下酵素中的敵螨普能得到良好基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。該方法與同類研究方法相比，提高了目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度，降低了檢測(cè)成本，為檢測(cè)酵素中敵螨普殘留量提供一種新的參考方法。