羅來慶，林海明，焦宇知，丁玉勇，張浩東，張 峰

（1.江蘇省食品藥品職業(yè)技術學院 酒店學院，江蘇 淮安 223003；2.江蘇省漣水中等專業(yè)學校，江蘇 淮安 223003）

葡萄酒的釀造是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）將糖轉化為酒精以及多種微生物協(xié)同參與的過程[1]，酵母菌自身發(fā)酵特性和代謝途徑的不同，同時也會造成葡萄酒具有品質[2]和風味[3]的不同。目前，商業(yè)釀酒酵母的使用最為廣泛，既具有良好的發(fā)酵特性又能夠提升葡萄酒的口感與品質，但其會造成葡萄酒一些關鍵香氣的丟失[4]。而有些非釀酒酵母（non-S.cerevisiae，NSC）能夠賦予葡萄酒更加復雜的香氣[5]并且具有較好的發(fā)酵性能。香氣物質是評價葡萄酒品質和風味的重要指標，葡萄原料、釀酒酵母和釀造工藝是決定香氣物質的關鍵因素[6-7]。因此使用非釀酒酵母對葡萄酒進行增香釀造和改善葡萄酒品質的研究越來越多。如畢赤酵母被證明在葡萄酒增香釀造提高花果香氣中具有極大應用潛力，其具有高產(chǎn)乙酸乙酯和乙酸異丁酯等酯類特性[8]，祝霞等[9]利用戴爾有孢圓酵母（Torulaspora debrueckii）和SC混合發(fā)酵葡萄酒，可明顯提升貴人香低醇白葡萄酒的香氣品質；BELY M等[10-11]利用戴爾有孢圓酵母與SC按20∶1混合發(fā)酵使葡萄酒中的揮發(fā)酸酸度和乙醛含量降低了50%～60%。因此，選擇優(yōu)質的非釀酒酵母對葡萄酒的增香釀造具有重要的意義。

試驗以前期研究從新疆天山北麓產(chǎn)區(qū)釀酒葡萄表皮分離篩選得到的3株優(yōu)質野生非釀酒酵母菌為基礎，探究非釀酒酵母菌的增香釀造潛力，用3株非釀酒酵母與商業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒，通過頂空固相萃取-氣相色譜質譜聯(lián)用（headspace solid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術檢測酒樣的揮發(fā)性香氣成分，結合主成分分析（principal component analysis，PCA）及氣味活度值（ordor activity value，OAV）對酒樣的主要揮發(fā)性香氣成分進行比較，以期開發(fā)具有增香釀造潛力的非釀酒酵母，為釀造具有本地特色的葡萄酒提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠（Cabernet Sauvignon）釀酒葡萄：2021年10月采自新疆西域明珠葡萄酒有限公司葡萄園，葡萄可溶性固形物質量分數(shù)21.32%，可滴定酸質量濃度為7.21 g/L，pH 3.6，采后置于4 ℃冷庫中保藏。

AWRI 796型活性釀酒酵母（S.cerevisiae）：澳大利亞Mauribrew公司；果膠酶（≥500 U/mg）、偏重亞硫酸鉀（分析純）：法國LALLEMAND公司；2-辛醇（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

畢赤克魯維酵母（P.kluyveri）HSX-5、長孢洛德酵母（L.elongisporus）MNS-6、戴爾有孢圓酵母（T.debrueckii）YQX-8，30%無菌甘油-80 ℃保藏。

1.2 儀器與設備

75 μm CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司；HP-INNOWax毛細管色譜柱（30 mm×0.25 mm×0.5 μm）、7890B-5977A型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；C-MAG HS 4型磁力攪拌器：德國IKA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的活化

釀酒酵母活化：按照商業(yè)酵母使用說明活化，并調整菌濃度為1×106CFU/mL；非釀酒酵母活化[12]：通過6%無菌葡萄糖溶液28 ℃培養(yǎng)24 h擴大培養(yǎng)兩次，第3次使用糖度為8%的葡萄汁溶液接種第2次擴培發(fā)酵液，28 ℃培養(yǎng)24 h后調整菌體濃度為1×106CFU/mL。

1.3.2 赤霞珠干紅葡萄酒的制備

選取新鮮的赤霞珠葡萄，除梗、去雜質壞果，破碎，取1.2 L葡萄醪置于2 L玻璃瓶中，添加100 mg/L偏重亞硫酸鉀，2 h后按照10 mg/L加入果膠酶并20 ℃浸漬24 h。處理后按照葡萄醪體積的5%（V/V）接種菌株HSX-5、菌株YQX-8、菌株MNS-6，發(fā)酵48 h后按照5∶1比例接入釀酒酵母（SC），在25 ℃條件下進行酒精發(fā)酵，以釀酒酵母單菌發(fā)酵作為空白對照。在酒精發(fā)酵時，每天測溫度和比重，當比重為0.993～0.996時，進行皮渣分離。皮渣分離后監(jiān)控酒樣中還原糖含量，待還原糖含量低于3 g/L時加入100 mg/L偏重亞硫酸鉀終止發(fā)酵，收集葡萄汁于4 ℃進行蘋果酸-乳酸發(fā)酵30 d，得到赤霞珠干紅葡萄酒。每個酒樣分為三部分，在15 ℃條件下裝瓶保存待分析。

1.3.3 理化指標測定

葡萄酒酒度、殘?zhí)?、總酸等理化指標參照國標GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[13]測定。

1.3.4 揮發(fā)性香氣物質的測定

揮發(fā)性香氣成分測定采用SPME-GC-MS法，具體參考余歡等[14]的方法。

揮發(fā)性香氣物質的提?。喝?0mL葡萄酒樣品置于20mL頂空瓶中，加入5 μL 100 μg/mL的2-辛醇后加入磁力轉子并密封頂空瓶，將老化后的75 μmCAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45 ℃吸附45 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，啟動GC-MS儀器進行分析。

GC-MS分析主要參考PLESSAS S等[15]方法。氣相色譜條件：采用恒定流量模式，起始柱溫40 ℃，以5 ℃/min升至90 ℃；再以10 ℃/min升至230 ℃，保留7 min。載氣為純度99.99%的氦氣（He），流量0.8 mL/min，汽化室溫度230 ℃。質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV，接口溫度為250 ℃，離子源溫度為200 ℃，燈絲發(fā)射電流為100 μA，檢測器電壓1 kV。

定性定量方法：通過比較質譜與美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）15質譜數(shù)據(jù)庫結合文獻比對來鑒定化合物質，保留正、反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結果。揮發(fā)性物質的定量[13]采用內標法，以2-辛醇作為內標，其計算公式如下：

式中：CX為待測組分質量濃度，μg/L；M1為各組分的峰面積；M2為內標物的峰面積；V1為內標物質量濃度，μg/L。

同時通過香氣濃度除以其閾值計算各香氣化合物的氣味活度值（OAV），OAV越大香氣化合物對風味的貢獻越大。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0進行香氣物質組間顯著性差異分析（Duncan檢驗，P＜0.05），使用Origin Pro 2019軟件進行PCA主成分分析，Microsoft Office 2016進行揮發(fā)性香氣數(shù)據(jù)的整理。

2 結果與分析

2.1 赤霞珠干紅葡萄酒理化指標

不同菌株發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒樣品發(fā)酵結束后的理化指標測定結果見表1。由表1可知，4個酒樣的酒精度在12%vol左右，殘?zhí)蔷陀? mg/L，發(fā)酵比較徹底，沒有酸敗現(xiàn)象。與對照組SC相比混合發(fā)酵酒樣總酸質量濃度上升，但揮發(fā)酸質量濃度均降低，這與BELY M等[10]研究結果一致。pH值均在3.4左右，葡萄酒具有較好的穩(wěn)定性以及感官品質。不同菌株發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒酒樣理化指標均符合國家標準GB/T 15037—2006《葡萄酒》[16]，適用于后續(xù)對其香氣成分的測定。

表1 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣品理化指標檢測結果Table 1 Determination results of physical and chemical indexes of dry red wine samples fermented by different yeast strains

2.2 赤霞珠干紅葡萄酒揮發(fā)性香氣成分

由表2可知，在不同菌株發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒酒樣中共檢出56種揮發(fā)性香氣物質，其中SC酒樣37種，PK1酒樣41種，PK2酒樣44種，PK3酒樣39種，包括16種酯類、19種醇類、9種醛類、7種酸類、2種酮類和3種萜烯類。各混合發(fā)酵酒樣組間除酸類物質之外，其他香氣物質組成和含量之間均存在顯著差異（P＜0.05），既有新生成的物質，也有損失的物質，非釀酒酵母對葡萄酒酯類和醇類物質改善最為顯著。

表2 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣品的揮發(fā)性香氣成分測定結果Table 2 Determination results of volatile aroma compounds in dry red wine samples fermented by different yeast strains

續(xù)表

2.2.1 非釀酒酵母對葡萄酒香氣成分的影響

釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中通過自身代謝生成酒精的同時會產(chǎn)生甘油和高級醇等副產(chǎn)物[21]，其中高級醇對葡萄酒的風味具有重要作用，當質量濃度＞400 mg/L時，會使葡萄酒具有強烈的刺鼻味，而當質量濃度＜300 mg/L時，可以使葡萄酒的香氣更具復雜性[22]。由圖1和表2可知，在各混合發(fā)酵葡萄酒樣品中共檢出19種醇類物質，總質量濃度均＜300 mg/L，相較于單菌發(fā)酵的SC酒樣，混合發(fā)酵酒樣中的高級醇含量均顯著增加（P＜0.05），主要是異戊醇和2-苯乙醇含量的顯著增加（P＜0.05）。其中異戊醇含量從44.25mg/L（SC酒樣）上升至58.21mg/L（PK1酒樣）、54.80mg/L（PK2酒樣）和57.02 mg/L（PK3酒樣），分別上升32%、24%和29%，且其OAV＞1，是葡萄酒的主要香氣物質。適量的異戊醇可以增加葡萄酒的醇厚感。2-苯乙醇可以賦予葡萄酒玫瑰和蜂蜜氣味[23]，同時也是威代爾冰葡萄酒的特征香氣[24]，通常相較于釀酒酵母，非釀酒酵母具有更強的產(chǎn)2-苯乙醇能力。研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵樣品的2-苯乙醇含量均高于單菌發(fā)酵酒樣SC，其中PK3酒樣中2-苯乙醇質量濃度最高（4 367.91 μg/L），說明長孢洛德酵母更具產(chǎn)2-苯乙醇能力。在檢測到的其他醇類物質中，PK1酒樣新生成了月桂醇、2-癸烯-1-醇，PK2酒樣新生成了2,3-丁二醇、3-乙基-2-戊醇、正癸醇，PK3酒樣2,3-丁二醇、正癸醇、1,3-丁二醇，在一定程度上使葡萄酒風味更具復雜性。

圖1 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣中各類別揮發(fā)性香氣物質含量比較Fig.1 Comparison of contents of various types of volatile aroma compounds in dry red wine samples fermented by different yeast strains

酯類物質對葡萄酒的花果香氣具有主要貢獻[22]。在葡萄酒樣品中共檢出16種酯類物質，其中SC酒樣（12種）、PK1酒樣（12種）、PK2酒樣（15種）、PK3酒樣（13種），相較于SC酒樣（17.73 mg/L），PK1酒樣（22.68 mg/L）和PK2酒樣（20.92 mg/L）混合發(fā)酵酒樣酯類物質總含量均顯著升高（P＜0.05）。主要表現(xiàn)為辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯含量的上升以及物質組成的差異，其中辛酸乙酯具有白蘭地的香氣，己酸乙酯具有草莓、菠蘿香氣，乙酸乙酯可賦予葡萄酒微帶果香的酒香氣味。同時PK1新生成了乙酸異丁酯和乙酸異戊酯，PK2新生成了乙酸異丁酯、乙酸異戊酯和水楊酸甲酯，PK3新生成了丙酮酸乙酯，乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的OAV均＞1，是PK1和PK2酒樣的主要香氣，增強了葡萄酒的香蕉等水果香氣。在檢出的16種酯類物質中共有8種物質OAV＞1，為葡萄酒的主要貢獻香氣，其含量在混合發(fā)酵酒樣中表現(xiàn)為上升，增強了葡萄酒花果類香氣強度。

葡萄酒中的酸類物質主要來源于葡萄果實和酒精發(fā)酵代謝，其中脂肪酸是主要的酸類物質，當脂肪酸氣味活度值＜1時，可以增加葡萄酒風味復雜性[25]。由表2可知，在酒樣中共檢測出7種酸類物質，其中SC酒樣5種，PK1酒樣7種，PK2和PK3酒樣6種，從酸類物質總含量角度單菌發(fā)酵和混合發(fā)酵差異不顯著，但混合發(fā)酵也具有一定的降酸作用。但相較于SC酒樣，混合發(fā)酵酒樣新生成了丙酮酸和硬脂酸，多樣的酸類物質是有利于葡萄酒的平衡。在檢出的酸類物質中，只有辛酸的OAV＞1，是葡萄酒的的主要酸類香氣物質，會給葡萄酒帶來酸敗的味道，而PK1酒樣降低了辛酸的含量，對葡萄酒風味具有積極的作用。

葡萄酒中的醛類物質主要來源于酒精發(fā)酵過程氨基酸在酶的作用下產(chǎn)生的醛。由表2可知，在4個酒樣中共檢出9種醛類物質，相較于SC酒樣（46.84 μg/L），PK1（122.54 μg/L）和PK2（96.00 μg/L）中的醛類物質顯著提升（P＜0.05），其中壬醛和葵醛的OAV＞1，是主要的醛類香氣物質，在PK1和PK2中的含量均顯著提升（P＜0.05），增加了葡萄酒的脂蠟香和甜橙香氣。在其他香氣物質中，共檢出3種萜烯類和2種酮類，其中PK2酒樣新生成了2-辛酮，增加了葡萄酒蘋果香氣；在PK1和PK2酒樣中檢出β-大馬士酮，能夠貢獻葡萄酒中的甜香、花香和蜂蜜香[26]。PK2酒樣香茅醇含量顯著提升，賦予葡萄酒新鮮玫瑰類香氣。同時PK1和PK3酒樣新生成了橙花醇，增加了葡萄酒中的玫瑰和橙花的香氣。

2.2.2 主要香氣成分主成分分析

為了進一步比較非釀酒酵母菌對葡萄酒香氣的影響，選取OAV＞0.1的22種香氣化合物進行主成分分析，結果見圖2。由圖2可知，兩個主成分PC1和PC2的方差貢獻率分別為55.1%和26.7%，累計方差貢獻率為81.8%。4個酒樣在載荷圖中分別位于四個象限中且距離較遠，說明酒樣之間存在顯著差異。

圖2 不同菌株發(fā)酵干紅葡萄酒樣品中OAV＞0.1的香氣化合物主成分分析結果Fig.2 Results of principal component analysis of aroma compounds with OAV＞0.1 in dry red wine samples fermented by different yeast strains

釀酒酵母單菌發(fā)酵酒樣SC主要貢獻香氣有庚酸乙酯、正己醇、辛酸和香茅醇；混合發(fā)酵PK1酒樣主要貢獻香氣為辛酸乙酯、葵酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、壬酸乙酯、2-苯乙醇和壬醛；PK2酒樣主要貢獻香氣為丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、1-辛醇、1-壬醇、異丁酸、葵醛和β-大馬士酮；PK3酒樣主要貢獻香氣為異丁醇和異戊醇。其中PK1和PK2混合發(fā)酵酒樣的OAV較高，對葡萄酒的風味更具有積極正面的影響。

3 結論

通過對3株自選優(yōu)質非釀酒酵母與商業(yè)釀酒酵母混合發(fā)酵赤霞珠葡萄酒的揮發(fā)性香氣物質進行檢測分析，共檢出56種揮發(fā)性香氣物質，其中包括16種酯類、19種醇類、9種醛類、7種酸類、2種酮類和3種萜烯類。與商業(yè)酵母單菌發(fā)酵相比，畢赤克魯維酵母HSX-5和戴爾有孢圓酵母YQX-8能夠顯著增加葡萄酒酯類香氣物質（P＜0.05），主要是辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯，增強葡萄酒花果類香氣；混合發(fā)酵酒樣中的醇類物質均高于釀酒酵母單菌發(fā)酵，表現(xiàn)為2-苯乙醇和異戊醇等高級醇含量的上升，賦予葡萄酒厚重的口感和玫瑰類香氣。同時混合發(fā)酵各組均產(chǎn)生了新物質，增加了葡萄酒風味體系的豐度。主成分分析結果表明，4個酒樣間存在顯著差異，其中畢赤克魯維酵母HSX-5和戴爾有孢圓酵母YQX-8發(fā)酵酒樣主要貢獻香氣種類較多且氣味活度值較高，對葡萄酒香氣的影響顯著。結果表明，菌株HSX-5和YQX-8更具有增香釀造潛力，后續(xù)工作可進一步探索促進香氣的機理以及和釀酒酵母的協(xié)同作用機理。