王清龍，陳園園，劉延波，5，劉洪亮，王永華，朱金曉，張曉靜，潘春梅*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 理學(xué)部，河南 鄭州 450046；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州 450046；3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；4.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；5.河南仰韶酒業(yè)有限公司 博士后科研工作站，河南 三門峽 472400；6.河南蔡洪坊酒業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463500）

阿魏酸，又名4-羥基-3-甲氧基肉桂酸（C10H10O4），易溶于極性溶劑[1]，是由阿魏酸酯酶（ferulic acid esterases，F(xiàn)AEs）水解酯鍵產(chǎn)生的酚酸類物質(zhì)[2]，普遍存在于禾本科植物（如麥麩、高粱皮、豌豆皮、作物秸稈等）中[3-4]，通常以酯鍵、縮醛鍵等與大分子物質(zhì)構(gòu)成交聯(lián)的致密成分，保持細(xì)胞的機(jī)械完整性[5-8]，具有疏散血小板、清除自由基、提高免疫力、預(yù)防阿爾茲海默癥等功效[9-10]，是藥品、食品等行業(yè)領(lǐng)域的重要原料[11-13]。水解阿魏酸的方法有多種，其中微生物酶解法具有低成本、安全環(huán)保、高效率等的優(yōu)點(diǎn)，因此，篩選能夠產(chǎn)生阿魏酸酯酶的菌株，發(fā)酵釋放阿魏酸是最經(jīng)濟(jì)適用的方式[14-15]。

“有美酒必備佳曲”、“曲為酒之骨”[16]，濃香型大曲是以高梁為主要原料，混合大麥、小麥，并配以一定比例的豌豆粉碎成顆粒狀[17-18]，加水拌料制成磚塊狀的曲坯，在可控的溫度和濕度環(huán)境下培養(yǎng)而成的中高溫大曲[19]。大曲富含有許多微生物和酶類[20]，在白酒生產(chǎn)過程中具有糖化和生香作用[21]；此外，白酒中風(fēng)味化合物的形成也是源于酒曲中微生物的發(fā)酵作用[22]。目前，我國(guó)各種名優(yōu)白酒大都使用傳統(tǒng)的大曲法固態(tài)發(fā)酵釀造[23]。近年來，增加白酒中健康成分的含量，提高白酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是中國(guó)白酒釀造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[24]，因此，眾多白酒研究人員致力于分離篩選更多功能性菌株。目前，有關(guān)產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的篩選主要是從土壤或者腐質(zhì)樣品中篩選，而在白酒相關(guān)中的研究較少且酶活力較低[25-26]。

該研究采用透明圈法從濃香型白酒大曲中篩選高產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，并以阿魏酸酯酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高白酒中阿魏酸的含量，提高白酒品質(zhì)，為白酒增添更多功能性的健康因子。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒大曲：河南蔡洪坊酒業(yè)有限公司；麩皮：鄭州某超市。

1.1.2 試劑

硫酸銨、硫酸鎂、FeCl3、檸檬酸、檸檬酸鈉（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（色譜純）、瓊脂粉（生化試劑）：上海麥克林生化科技有限公司；阿魏酸、阿魏酸乙酯（均為分析純）：賽國(guó)生物科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基[25]：NaCl0.3g/L，K2HPO40.3g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，（NH4）2SO41.3 g/L，瓊脂粉18 g/L，10%阿魏酸乙酯溶液（溶于N,N-二甲基甲酰胺）15 mL/L，pH 7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基[25]：NaCl 0.1 g/L，蛋白胨0.1 g/L，酵母粉0.05g/L，瓊脂粉0.18g/L，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基[25]：酵母粉1 g/L，KH2PO40.37 g/L，（NH4）2SO41.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，CaCl2·2H2O 0.07 g/L，F(xiàn)eCl30.02 g/L，10%阿魏酸乙酯溶液（溶于N,N-二甲基甲酰胺）5 mL/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272BS型恒溫培養(yǎng)箱、DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；DGL-50B立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海力辰儀器有限公司；3-18KS型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；FUB紫外可見分光光度計(jì)：上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；GelDoc-IT2 315凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的分離及篩選

將釀酒大曲粉碎，稱取20 g加入含180 mL無菌水的三角瓶，于28 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)40 min，室溫靜置3 min，取上清液按10倍梯度系列稀釋至10-7，取50 μL稀釋的菌懸液涂布于初篩培養(yǎng)基上，28 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

初篩：挑取具有透明圈的菌株劃線于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次分離、純化，得到單菌落[27]。

復(fù)篩：將初篩得到的菌株接種于產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min條件下72 h，測(cè)定發(fā)酵液中阿魏酸酯酶酶活力，篩選酶活力最大的菌株為目標(biāo)菌種，保藏備用[28]。

1.3.2 阿魏酸酯酶酶活力的測(cè)定

取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心15 min，棄沉淀取上清[29-30]。以去淀粉麥麩[31]為底物測(cè)定酶活，以煮沸失活的酶液為空白，每組3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，具體方法參照文獻(xiàn)[32-33]。以阿魏酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制得到阿魏酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.089 4x-0.088 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 0，說明阿魏酸質(zhì)量濃度與吸光度值在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

酶活力定義：在反應(yīng)條件55 ℃、pH值6.0時(shí)，每分鐘水解底物釋放1 μmol阿魏酸所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察菌落的形狀、表面特征，挑取單菌落染色制片，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[34]進(jìn)行生理生化試驗(yàn)。

分子生物學(xué)鑒定[35]：委托生工生物工程（上海）有限公司對(duì)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA11軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：以菌株接種量4%（V/V）、發(fā)酵溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)基初始pH自然、發(fā)酵時(shí)間72 h作為初始發(fā)酵條件[36]，分別探究發(fā)酵溫度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）、接種量（2%、3%、4%、5%、6%）、初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對(duì)菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選出對(duì)目標(biāo)菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活力影響最大的3個(gè)因素接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和初始pH值（C）作為自變量（X），酶活力為響應(yīng)值（Y），采用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)[37]。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS V22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Design-Expert 8.0.6分析響應(yīng)面回歸模型，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)阿魏酸酯酶菌株的篩選結(jié)果

2.1.1 初篩結(jié)果

將大曲樣品稀釋后涂布于初篩培養(yǎng)基上，經(jīng)分離和篩選后，共獲得9株產(chǎn)透明圈的菌株，命名為M1～M9。

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果

測(cè)定初篩得到的9株菌的阿魏酸酯酶酶活力，結(jié)果見表1。由表1可知，菌株M2的阿魏酸酯酶活力最高，為（30.8±0.05）U/L，因此，以菌株M2為目標(biāo)菌株。

表1 初篩菌株阿魏酸酯酶活力測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of ferulic acid esterase activity of the first screening strains

2.2 菌株M2的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株M2的菌落及細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1a可知，菌株M2的單菌落為乳白色，形狀為規(guī)則的圓形，表面光滑，菌落中心凸起，邊緣整齊。由圖1b可知，細(xì)胞呈長(zhǎng)桿狀，細(xì)菌特征明顯，革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）。

圖1 菌株M2的菌落（a）及細(xì)胞（b）形態(tài)特征Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphological characteristics of strain M2

2.2.2 生理生化鑒定

菌株M2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，菌株M2可水解利用淀粉、乳糖、麥芽糖，VP試驗(yàn)、MR試驗(yàn)及明膠試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，H2S試驗(yàn)結(jié)果為陰性。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，初步鑒定菌株M2為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

表2 菌株M2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of physiological and biochemical experiments of strain M2

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株M2的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。由圖2可知，菌株M2與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）在進(jìn)化關(guān)系上具有最近的親緣關(guān)系，結(jié)合菌株M2的菌落形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果，最終鑒定菌株M2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株M2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain M2 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵溫度對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，阿魏酸酯酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，分析原因可能是隨著溫度的升高，菌株的部分理化條件遭到破壞，導(dǎo)致其產(chǎn)酶能力下降[38-39]。當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，酶活力最高，為32.95 U/L，由此確定該菌株產(chǎn)阿魏酸酯酶的最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在36～72 h范圍時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力呈升高趨勢(shì)，可能是由于發(fā)酵初期氧氣充足，菌體繁殖快；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，酶活力最高，為30.80 U/L；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞72 h之后，酶活力呈下降趨勢(shì)，可能是由于培養(yǎng)時(shí)間超過了菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌株開始衰亡，且產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)酶造成不利影響[40]。由此確定該菌株產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.3.3 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響

由圖5可知，在接種量為2%～5%的范圍內(nèi)，隨著接種量的增大，酶活力呈升高趨勢(shì)，可能是由于發(fā)酵初期營(yíng)養(yǎng)充足，菌體生長(zhǎng)狀況良好[41]；當(dāng)接種量為5%時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為32.60 U/L；當(dāng)接種量＞5%之后，酶活力降低，可能是由于菌種之間競(jìng)爭(zhēng)激烈，導(dǎo)致產(chǎn)酶能力減弱[41-42]。由此確定該菌株產(chǎn)酶的最適接種量為5%。

圖5 接種量對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響Fig.5 Effect of inoculum on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.3.4 初始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響

由圖6可知，當(dāng)初始pH值＜5.5之前，阿魏酸酯酶活力呈升高的趨勢(shì)；當(dāng)初始pH值為5.5時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為32.83 U/L；當(dāng)初始pH值＞5.5時(shí)，酶活力呈緩慢遞減趨勢(shì)，說明培養(yǎng)基初始pH值的升高或降低都會(huì)減弱菌株的產(chǎn)酶能力。由此確定該菌株產(chǎn)酶的最佳初始pH值為5.5。

圖6 初始pH對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶活力的影響Fig.6 Effect of initial pH on the activities of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.4 菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

使用IBM SPSS V22.0軟件分析單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定影響顯著的因素接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和初始pH值（C），以阿魏酸酯酶活力（Y）為響應(yīng)值，依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，回歸模型的方差分析見表4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件中對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶酶活力（Y）對(duì)發(fā)酵溫度（A）、接種量（B）及初始pH值（C）的多元二次回歸模型：

由表4可知，模型P值＜0.000 1，極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.249 1，不顯著（P＞0.05），模型的決定系數(shù)R2=0.999 8，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.999 6，說明該回歸模型具有良好的擬合性。綜合分析，該回歸方程適用于對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶發(fā)酵條件的優(yōu)化分析及預(yù)測(cè)。由P值可知，所有項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

2.4.2 各因素間交互作用的響應(yīng)面及等高線

探究各因素間交互作用的影響，對(duì)優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面立體分析，并創(chuàng)建相應(yīng)的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖7。由圖7可知，各因素間交互作用對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶活力影響的響應(yīng)面均呈凸形，存在最高點(diǎn)；等高線均呈橢圓形，說明交互作用極顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖7 發(fā)酵溫度、初始pH值、接種量間交互作用對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶活力影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation temperature,initial pH and inoculum on the activity of ferulic acid esterase produced by strain M2

2.4.3 最佳產(chǎn)酶條件的確定及驗(yàn)證

采用Design-Expert 8.0.6對(duì)回歸擬合方程進(jìn)行求解，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度29.91 ℃，接種量4.97%，初始pH值5.53。在該發(fā)酵條件下，阿魏酸酯酶活力理論值為33.90 U/L。為便于實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵條件修訂為發(fā)酵溫度30 ℃，接種量5%，初始pH值5.5，發(fā)酵時(shí)間72 h，采用最優(yōu)條件重復(fù)3次試驗(yàn)，得到阿魏酸酯酶活力的實(shí)際值為（33.89±0.02）U/L，與預(yù)測(cè)值接近。結(jié)果表明，該模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有良好擬合度，可用于對(duì)菌株M2產(chǎn)阿魏酸酯酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

本研究從白酒釀酒大曲中篩選到一株產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株，編號(hào)為M2，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)技術(shù)鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定該菌株產(chǎn)酶的最佳條件為接種量5%，發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH值5.5，發(fā)酵時(shí)間72 h，在此優(yōu)化條件下，酶活力為33.89 U/L，比優(yōu)化之前提高了10.03%，阿魏酸是白酒中的健康成分，阿魏酸酯酶對(duì)白酒釀造過程中阿魏酸的釋放有積極作用，本研究為提高白酒中阿魏酸的含量提供了理論基礎(chǔ)，下一步可將該菌株用于白酒釀造，預(yù)期可提高白酒的健康成分。