吳元釗,俞逸嫻,徐菀憶,應(yīng)劍波,王斌杰,王繼業(yè),姚偉宣*

(1.浙江警察學院浙江省毒品防控技術(shù)研究重點實驗室,中國浙江 杭州 310051;2.杭州市公安局刑事科學技術(shù)研究所,中國浙江 杭州 310004)

抗凝血類滅鼠劑是指通過干擾肝臟對維生素K的利用,阻礙肝臟合成凝血酶原以及抑制凝血酶原和凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成,使機體凝血時間和凝血酶原時間延長,造成各個臟器及黏膜出血,從而達到毒殺鼠類的一種滅鼠劑[1～2]。相對于急性劇毒類滅鼠劑,抗凝血類滅鼠劑具有半衰期長、適口性好、滅鼠效率高、毒性作用較為平緩等優(yōu)點,且對人畜較為安全[3]。我國從20世紀80年代開始大規(guī)模推廣抗凝血類滅鼠劑,使之逐漸成為生產(chǎn)生活中使用最多的滅鼠劑[4]。盡管抗凝血類滅鼠劑對人畜毒性較低,但其危害也不能忽視。根據(jù)美國國家毒物控制中心統(tǒng)計,1987—2018年,抗凝血類滅鼠劑導致的中毒人數(shù)平均每年達11 021人[5～6]。在國內(nèi),抗凝血類滅鼠劑安全事件也頻繁發(fā)生。四川大學華西醫(yī)院在2008—2016年共診斷并治療了65名抗凝血類滅鼠劑中毒兒童病例[7]。唐玲玲[8]對49例兒童抗凝血類滅鼠劑中毒事件進行了統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)兒童中毒病例數(shù)量呈逐年上升趨勢,這可能與抗凝血類滅鼠劑普遍使用以及監(jiān)管不力密切相關(guān)。此外,因使用不規(guī)范等,抗凝血類滅鼠劑對環(huán)境造成的污染問題也逐漸引起人們的重視。茅海瓊等[9]報道了溴鼠靈在水環(huán)境突發(fā)性污染事故中的藥物殘留。Regnery等[10]發(fā)現(xiàn),在德國巴伐利亞州,抗凝血類滅鼠劑在下水道排放的污水中普遍存在。

氯鼠酮(chlorophacinone)又稱鼠頓停、氯敵鼠,作為抗凝血類滅鼠劑的典型代表,它是目前世界上使用范圍最為廣泛的滅鼠劑之一。正是由于氯鼠酮的大范圍使用,其帶來的二次暴露危害較為嚴重,在各種環(huán)保監(jiān)測以及法醫(yī)調(diào)查中,氯鼠酮甚至出現(xiàn)在了非靶標動物鳥類的肝臟組織中[11]。不僅如此,研究者在家畜體內(nèi)也檢測到了氯鼠酮,其有可能通過食物鏈進入人類體內(nèi)[12～13]。因此,在目前建設(shè)美麗生態(tài)中國的大形勢下,對前期大規(guī)模使用的抗凝血類滅鼠劑進行生態(tài)毒性評估顯得尤為重要。然而,目前針對氯鼠酮的研究報道大多集中在含量檢測等領(lǐng)域[14～16],關(guān)于氯鼠酮對非靶向水生生物的毒理學研究卻鮮見報道。本文以斑馬魚為模式動物,研究氯鼠酮對斑馬魚胚胎/仔魚的急性毒性及抗氧化系統(tǒng)的影響,以期為評價環(huán)境中氯鼠酮的生態(tài)毒性及其環(huán)境風險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(國藥集團化學試劑有限公司);氯鼠酮(北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院);過氧化氫酶(catalase,CAT)測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒、總蛋白質(zhì)定量測定試劑盒、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)測試盒(南京建成生物工程研究所有限公司)。用DMSO做助溶劑,將氯鼠酮配制成質(zhì)量濃度為2 000 mg/L的儲備液,低溫保存待用。

LBI-400生化培養(yǎng)箱(上海龍躍);Olympus-SZX7體式倒置顯微鏡(奧林巴斯,日本);DanioVision高通量魚類行為系統(tǒng)(諾達斯思,荷蘭);JXFSTPRP-CL全自動樣品冷凍研磨儀(上海凈信);LEGEND MICRO 21R離心機(賽默飛世爾,美國);FlexStation 3酶標儀(賽默飛世爾,美國)。

1.2 胚胎的獲取

本實驗采用的斑馬魚均為野生型AB系純種斑馬魚(WT/AB),魚齡為6～18個月,購于武漢中科院國家斑馬魚資源中心,飼養(yǎng)于恒溫曝氣自動水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)(帶有28℃的溫控系統(tǒng)和循環(huán)水泵),每日喂食新鮮孵化豐年蝦兩次。在實驗前一天16時選擇性成熟且健康穩(wěn)定的斑馬魚成體進行配對,雄魚和雌魚的比例為2∶1。亞克力孵化盒中內(nèi)置柵格內(nèi)膽以過濾胚胎,并以透明亞克力隔板將雌雄斑馬魚分隔開。隨后加入系統(tǒng)水,對孵化盒進行暗處理過夜。實驗當天9時抽板,進行光照刺激,讓雌雄斑馬魚進行交配受精,20 min后收集胚胎。挑除發(fā)育異常的胚胎,得到可用于實驗的完整健康胚胎。

1.3 胚胎發(fā)育實驗

用配置好的氯鼠酮儲備液逐級稀釋至所需應(yīng)用液,確保應(yīng)用液中DMSO的體積分數(shù)小于0.5%(預實驗表明,DMSO的體積分數(shù)小于0.5%時對斑馬魚胚胎/仔魚無明顯毒性)。挑選受精后3 h發(fā)育正常的斑馬魚胚胎進行暴露實驗,氯鼠酮質(zhì)量濃度設(shè)置為 0.20 mg/L、0.30 mg/L、0.45 mg/L 和 0.67 mg/L,每個濃度設(shè)置3組平行實驗。使用6孔細胞培養(yǎng)板為容器,每孔6 mL溶液,放置胚胎30枚,暴露液一天一換,實驗期間孔板需蓋板蓋,以保證暴露組濃度保持不變。在96 h、120 h觀察斑馬魚的死亡率等生理學終點情況,并計算半數(shù)致死濃度(median lethal concentration,LC50),及時挑出死亡個體以防止對其他胚胎造成影響。在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h觀察氯鼠酮染毒后各暴露組斑馬魚胚胎發(fā)育情況與形態(tài)變化,記錄并拍照。48 h時斑馬魚胚胎開始掙破卵膜,72 h時胚胎開始陸續(xù)孵化,于96 h和120 h分別統(tǒng)計氯鼠酮染毒后各暴露組斑馬魚胚胎的孵化率,同時分別統(tǒng)計24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 時斑馬魚胚胎/仔魚的存活率。24 h時,統(tǒng)計各暴露組斑馬魚胚胎尾部的自主抽動次數(shù)。120 h時,統(tǒng)計各暴露組仔魚30 s內(nèi)心跳次數(shù),同時,統(tǒng)計各暴露組斑馬魚胚胎發(fā)育畸形數(shù)量占比,測量各暴露組仔魚體長,以mm為單位。

1.4 運動行為的記錄與分析

隨機挑選暴露120 h且具有運動行為能力的斑馬魚仔魚,通過DanioVision高通量魚類行為系統(tǒng)進行運動行為測試。根據(jù)Nery等[17]的實驗方法,將挑選出的仔魚放置在24孔細胞培養(yǎng)板中觀察,每孔隨機放置1尾斑馬魚仔魚,并加入2 mL氯鼠酮暴露液。光刺激條件設(shè)定為前20 min黑暗適應(yīng),之后每5 min進行1次明暗交替,記錄總時長為120 min的仔魚運動行為實驗數(shù)據(jù),包括運動距離、平均速度、行為軌跡和運動熱區(qū)圖等。實驗結(jié)束后利用斑馬魚行為分析系統(tǒng)EthoVision XT 14軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

1.5 生化指標測試實驗

每個暴露組隨機取100尾仔魚,用去離子水清洗兩次,加入300 μL預冷的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)和1顆磁珠,置于2.5 mL離心管內(nèi)0℃勻漿400 s,加入PSB溶液(pH 7.4)700 μL進行清洗轉(zhuǎn)移。0℃低溫下,2 500 r/min離心5 min,取上清液,待測。參照文獻[18],用考馬斯亮藍法測定總蛋白質(zhì)含量。GSH、MDA含量的測定參照供應(yīng)商提供的說明書進行操作。CAT、AChE活力的測定參照試劑盒說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.0中的非線性回歸法對斑馬魚胚胎死亡毒性進行分析,得到氯鼠酮對斑馬魚的半數(shù)致死濃度LC50。在滿足正態(tài)分布和方差齊性的前提下,采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)和最小顯著性檢驗法(LSD)分析各組間的差異顯著性,否則采用非參數(shù)檢驗處理差異的顯著性。與對照組比較,“*”表示P＜0.05,記為統(tǒng)計學差異顯著;“**”表示 P＜0.01、“***”表示 P＜0.001,記為統(tǒng)計學差異極顯著。采用GraphPad Prism 8.0軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 氯鼠酮對斑馬魚胚胎/仔魚存活率、孵化率的影響

圖1A是斑馬魚胚胎暴露96 h和120 h的孵化率。從圖中可以看出,氯鼠酮暴露96 h和120 h的斑馬魚胚胎孵化率變化趨勢類似,0.20 mg/L、0.30 mg/L和0.45 mg/L暴露組斑馬魚胚胎的孵化率均達到95%以上,與空白對照組相比無顯著差異,但0.67 mg/L暴露組的孵化率呈現(xiàn)一定的下降趨勢。氯鼠酮暴露對斑馬魚胚胎/仔魚存活率的影響如圖1B所示,暴露至24 h時,與空白對照組相比,各濃度組斑馬魚胚胎/仔魚的存活率并無顯著差異;當暴露至48 h時,0.67 mg/L暴露組胚胎/仔魚的存活率下降顯著,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);當暴露至72～120 h時,各濃度組斑馬魚胚胎/仔魚的存活率均呈下降趨勢,其中,0.20 mg/L與0.30 mg/L暴露組的下降無統(tǒng)計學意義,0.45 mg/L與0.67 mg/L暴露組的下降均具有統(tǒng)計學意義(0.45 mg/L:P＜0.01,0.67 mg/L:P＜0.001)。不僅如此,隨著暴露時間延長,LC50逐漸下降,氯鼠酮暴露96 h和120 h時,斑馬魚胚胎/仔魚的LC50分別為0.73 mg/L和0.61 mg/L。

圖1 氯鼠酮暴露對斑馬魚胚胎/仔魚的孵化率與存活率的影響(A)孵化率;(B)存活率。Fig.1 Effects of chlorophacinone exposure on hatching and survival rates of zebrafish embryos/larvae(A)Hatching rate;(B)Survival rate.

2.2 氯鼠酮對斑馬魚胚胎/仔魚自主抽動、心率的影響

由圖2A可知,氯鼠酮暴露24 h時,斑馬魚胚胎每分鐘自主抽動的次數(shù)隨著氯鼠酮濃度的增大呈現(xiàn)出升高的趨勢。相對于空白對照組,0.20 mg/L、0.30 mg/L暴露組的自主抽動次數(shù)無顯著性差異,但0.45 mg/L和0.67 mg/L暴露組的自主抽動次數(shù)顯著上升(0.45 mg/L:P＜0.05,0.67 mg/L:P＜0.01)。圖2B是氯鼠酮暴露120 h后對仔魚30 s內(nèi)心跳次數(shù)的影響。由圖可知,與空白對照組相比,0.20 mg/L、0.30 mg/L和0.45 mg/L暴露組的仔魚心跳無顯著差異,但0.67 mg/L暴露組的心跳次數(shù)顯著下降(P＜0.01)。暴露于氯鼠酮下的仔魚心率隨著氯鼠酮的濃度升高而下降,我們推測可能是氯鼠酮暴露導致了斑馬魚胚胎心臟發(fā)育不良,從而引起心臟功能失調(diào)。

圖2 氯鼠酮暴露對斑馬魚胚胎/仔魚發(fā)育相關(guān)參數(shù)的影響(A)自主抽動;(B)心跳次數(shù);(C)畸形率;(D)體長。Fig.2 Effects of chlorophacinone exposure on developmental parameters of zebrafish embryos/larvae(A)Spontaneous movement;(B)Heart beat;(C)Malformation rate;(D)Body length.

2.3 氯鼠酮對斑馬魚胚胎/仔魚發(fā)育表型的影響

圖2C是氯鼠酮暴露120 h后斑馬魚仔魚發(fā)育的畸形情況。由圖可知,斑馬魚仔魚的畸形率隨著氯鼠酮濃度的增加逐漸升高。與空白對照組相比,0.20 mg/L與0.30 mg/L暴露組的畸形率無顯著變化,但0.45 mg/L與0.67 mg/L暴露組的畸形率顯著增加,分別達到10.00%(P＜0.01)和33.33%(P＜0.001)。此外,由圖3可知,0.20 mg/L與0.30 mg/L暴露組的斑馬魚仔魚出現(xiàn)心包水腫與卵黃囊水腫;0.45 mg/L與0.67 mg/L暴露組則出現(xiàn)心包水腫、卵黃囊水腫、尾部彎曲等畸形。

圖3 氯鼠酮暴露120 h后對斑馬魚仔魚發(fā)育表型的影響(A)空白對照組;(B)0.20 mg/L;(C)0.30 mg/L;(D)0.45 mg/L;(E)0.67 mg/L。Fig.3 Effects of exposure to different concentrations of chlorophacinone on phenotypes of zebrafish larvae after 120 h(A)Blank;(B)0.20 mg/L;(C)0.30 mg/L;(D)0.45 mg/L;(E)0.67 mg/L.

2.4 氯鼠酮對仔魚體內(nèi)CAT活性和GSH、MDA含量的影響

圖4是氯鼠酮暴露120 h后對斑馬魚仔魚抗氧化相關(guān)指標的影響。實驗結(jié)果表明,氯鼠酮暴露會引起仔魚體內(nèi)CAT活性(圖4A)和MDA含量(圖4C)升高,同時GSH含量(圖4B)降低。由圖4A可知,隨著氯鼠酮濃度的增大,各暴露組仔魚體內(nèi)的CAT活性逐漸增加,存在較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與空白對照組相比,0.20 mg/L、0.30 mg/L和0.45 mg/L暴露組的CAT活性無顯著性差異,0.67 mg/L暴露組的CAT活性顯著增強(P＜0.05)。由圖4B可知,經(jīng)氯鼠酮暴露120 h后,斑馬魚仔魚體內(nèi)的GSH含量隨著氯鼠酮濃度的上升而下降,0.67 mg/L暴露組的GSH含量最低,與空白對照組相比具有極其顯著的差異(P＜0.001)。由圖4C可知,隨著氯鼠酮濃度的升高,斑馬魚仔魚體內(nèi)的MDA含量逐漸升高;與空白對照組相比,0.45 mg/L和0.67 mg/L暴露組的MDA含量均顯著增加(P＜0.05)。

圖4 氯鼠酮暴露120 h后對斑馬魚仔魚體內(nèi)抗氧化指標的影響(A)CAT活性;(B)GSH含量;(C)MDA含量。Fig.4 Effects of chlorophacinone exposure on antioxidant parameters of zebrafish larvae after 120 h(A)CAT activity;(B)GSH activity;(C)MDA content.

2.5 氯鼠酮對斑馬魚仔魚體內(nèi)AChE活性的影響

氯鼠酮暴露120 h后對斑馬魚仔魚體內(nèi)AChE活性的影響如圖5所示。由圖可知,隨著氯鼠酮濃度的增加,斑馬魚仔魚體內(nèi)的AChE活性逐漸降低。與空白對照組相比,0.45 mg/L(P＜0.001)和0.67 mg/L(P＜0.001)暴露組的AChE活性具有極其顯著的差異,這表明在氯鼠酮的作用下,斑馬魚仔魚體內(nèi)的AChE活性受到顯著抑制。

圖5 氯鼠酮暴露120 h后對斑馬魚仔魚體內(nèi)AChE活性的影響Fig.5 Effects of chlorophacinone exposure on AChE activity of zebrafish larvae after 120 h

2.6 氯鼠酮對斑馬魚仔魚運動行為的影響

由圖6A和B可知,氯鼠酮暴露120 h后,隨著暴露濃度的升高,斑馬魚仔魚的運動總距離和平均速度均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。與空白對照組相比,0.20 mg/L、0.30 mg/L暴露組無顯著性差異,0.45 mg/L和0.67 mg/L暴露組仔魚的運動總距離及平均速度均顯著下降(0.45 mg/L:P＜0.01,0.67 mg/L:P＜0.001),運動行為能力受到明顯抑制。此外,由圖6C可知,隨著氯鼠酮濃度的升高,仔魚在單位面積內(nèi)的停滯時間逐漸延長,表明氯鼠酮暴露后,斑馬魚仔魚的運動行為能力受到顯著抑制。

圖6 氯鼠酮暴露120 h后對斑馬魚仔魚運動行為的影響(A)總運動距離;(B)平均速度;(C)運動軌跡圖和熱區(qū)圖。Fig.6 Effects of chlorophacinone exposure on locomotion behavior of zebrafish larvae after 120 h(A)Total distance;(B)Average speed;(C)Swimming trajectory and thermogram.

3 討論

胚胎發(fā)育是魚類生命過程中的一個重要階段,相對于成年斑馬魚,斑馬魚胚胎/仔魚對外來毒物的反應(yīng)更加敏感,因此,藥物處理下斑馬魚胚胎的存活率和孵化率是衡量藥物急性毒性的重要生物毒理學指標之一。在本實驗中,斑馬魚胚胎的孵化率隨著氯鼠酮濃度的增加而呈現(xiàn)略微下降趨勢,但并無顯著差異,可能是由于胚胎期斑馬魚的卵膜能夠起到一定的屏障作用,從而可以阻隔氯鼠酮的侵入,維持胚胎的正常發(fā)育[19]。斑馬魚胚胎/仔魚的存活率隨著氯鼠酮濃度的不斷增大而逐漸下降,其中,0.45 mg/L與0.67 mg/L暴露組的存活率極其顯著地低于空白對照組(圖1B),說明氯鼠酮對斑馬魚胚胎/仔魚具有較強的急性毒性。不僅如此,氯鼠酮暴露96 h和120 h時,斑馬魚仔魚的LC50分別為0.73 mg/L和0.61 mg/L,隨著暴露時間延長LC50值呈現(xiàn)下降趨勢,表明氯鼠酮對斑馬魚胚胎/仔魚的毒性隨著時間的延長而增大。

自主抽動是指斑馬魚胚胎尾部不受大腦神經(jīng)控制的左右擺動的運動,是能夠檢測到的最早的斑馬魚胚胎發(fā)育的神經(jīng)行為,常常被作為評估斑馬魚早期神經(jīng)發(fā)育毒性的重要指標之一[20～21]。本研究中,與空白對照組相比,0.45 mg/L和0.67 mg/L暴露組的胚胎自主抽動次數(shù)均顯著升高(0.45 mg/L:P＜0.05,0.67 mg/L:P＜0.01)(圖 2A),表明斑馬魚胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受到顯著抑制,這說明氯鼠酮暴露對斑馬魚胚胎/仔魚具有一定的神經(jīng)毒性。心臟是斑馬魚生長發(fā)育過程中首先形成并發(fā)揮作用的主要器官,單位時間內(nèi)的心跳次數(shù)是反映心臟功能的重要指標。本研究發(fā)現(xiàn),0.67 mg/L暴露組斑馬魚仔魚30 s的心跳次數(shù)顯著下降(圖2B),這可能是氯鼠酮暴露導致了斑馬魚仔魚的心臟發(fā)育不良,引起心臟生理功能失調(diào)。斑馬魚胚胎心臟發(fā)育異常還能影響血液循環(huán),繼而影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常運送,從而可能誘導胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)心包水腫以及卵黃囊腫等畸形發(fā)育形態(tài),甚至死亡[22]。

生物體在受到毒物侵入時會生成大量活性氧(reactive oxygen species,ROS),在正常生理狀態(tài)下,機體將產(chǎn)生相應(yīng)的抗氧化酶來清除ROS,降低氧化損傷,以保障機體的生理功能正常有序進行,并使兩者保持動態(tài)平衡狀態(tài)。但若外來入侵物質(zhì)打破這種平衡狀態(tài),就會導致機體氧化損傷,甚至死亡[23]。CAT的主要作用是將生物體內(nèi)的H2O2分解為O2和H2O,其是生物抗氧化防御體系的標志性酶之一[24]。在本研究中,0.67 mg/L暴露組的CAT活性顯著增強(P＜0.05)(圖4A)。作為生物體內(nèi)清除氧自由基的重要組成部分,CAT活性升高表明隨著氯鼠酮濃度的升高,仔魚體內(nèi)產(chǎn)生的ROS也逐漸增多,提示氯鼠酮對斑馬魚仔魚的毒性逐漸增強。生物體在受到外界刺激后能夠誘導自身產(chǎn)生非酶抗氧化劑GSH,它能夠快速有效地清除生物體內(nèi)的有毒化學物質(zhì)刺激所產(chǎn)生的ROS[25],當機體內(nèi)的GSH逐漸減少甚至耗盡時,將導致機體產(chǎn)生中毒效應(yīng)。在本研究中,經(jīng)氯鼠酮暴露后的斑馬魚仔魚體內(nèi)的GSH含量隨著氯鼠酮濃度的上升而下降(圖4B),0.67 mg/L暴露組的GSH含量達到最低,這可能是機體為了維持體內(nèi)ROS與抗氧化防御系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡,GSH被消耗用于清除機體內(nèi)多余的ROS造成的[26]。MDA是機體發(fā)生不可逆脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物,其在機體內(nèi)含量的變化通常也可以用來反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的水平和損傷程度[27～28]。在本實驗中,隨著氯鼠酮暴露濃度的增大,斑馬魚仔魚體內(nèi)的MDA含量呈上升趨勢(圖4C),與空白對照組相比,0.45 mg/L與0.67 mg/L暴露組斑馬魚仔魚體內(nèi)的MDA含量顯著升高(0.45 mg/L:P＜0.05,0.67 mg/L:P＜0.05),這表明高濃度的氯鼠酮暴露產(chǎn)生的ROS攻擊斑馬魚體內(nèi)的不飽和脂肪酸,進而形成了MDA。氧化應(yīng)激實驗表明,在氯鼠酮的刺激下,斑馬魚仔魚的抗氧化防御系統(tǒng)被啟動,但隨著氯鼠酮濃度的不斷升高,機體內(nèi)多余的ROS不能被抗氧化系統(tǒng)完全清除,進而導致機體的氧化損傷程度不斷加劇,最終產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

AChE是一種與生物神經(jīng)傳導密切相關(guān)的酶,對斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育至關(guān)重要,其活力的改變通常被認為是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的重要指標之一[29]。在本實驗中,0.45 mg/L和0.67 mg/L暴露組的AChE活性與空白對照組相比具有極其顯著的差異(0.45 mg/L:P＜0.001,0.67 mg/L:P＜0.001)(圖5),表明在氯鼠酮暴露下,斑馬魚仔魚體內(nèi)的AChE活性受到顯著抑制。這可能是氯鼠酮暴露對斑馬魚仔魚的神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用,導致神經(jīng)突觸間隙中乙酰膽堿數(shù)量減少,繼而影響了興奮的傳遞,使斑馬魚仔魚的運動行為能力受到抑制。斑馬魚運動行為實驗是在整體水平上對生命活動進行動態(tài)研究的一種重要手段,能夠直觀地檢測各種因素對斑馬魚運動行為能力的影響[30～31]。本實驗通過對仔魚的運動行為進行分析發(fā)現(xiàn),0.45 mg/L和0.67 mg/L暴露組仔魚的運動總距離和平均速度受到顯著抑制(圖6A～B)。不僅如此,隨著氯鼠酮濃度的升高,仔魚在單位面積內(nèi)的停滯時間逐漸延長,并出現(xiàn)呆滯現(xiàn)象(圖6C)。這可能與斑馬魚仔魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因mbp和突觸蛋白基因syn2a的表達受到抑制有關(guān)[32]。

綜上所述,經(jīng)氯鼠酮暴露后,斑馬魚胚胎/仔魚的自主抽動、孵化率、存活率、體長等發(fā)育相關(guān)指標受到顯著影響,同時其體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)失衡,不僅如此,仔魚的運動行為能力和體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)AChE活性受到顯著抑制。實驗結(jié)果表明,氯鼠酮對斑馬魚胚胎/仔魚具有急性毒性和神經(jīng)毒性效應(yīng)。該結(jié)論為今后繼續(xù)開展以氯鼠酮為代表的第二代抗凝血類滅鼠劑對非靶向水生生物的毒性作用研究提供了借鑒和參考。