涂思梅,曲鑫建,2*

(1.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,中國遼寧 盤錦 124221;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，中國廣西 南寧 530200)

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通過體細(xì)胞重編程技術(shù)獲得的具有類似胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞[1～2]。人類iPSCs在細(xì)胞治療、疾病建模和藥物開發(fā)等領(lǐng)域已經(jīng)扮演了重要的角色。在當(dāng)今社會(huì),心血管疾病已經(jīng)嚴(yán)重地威脅人類的生命健康,而治療心血管疾病的關(guān)鍵工具和重要因素是獲得正常生理功能的心肌細(xì)胞。由iPSCs分化而來的心肌細(xì)胞,在產(chǎn)生符合治療和研究心血管疾病的細(xì)胞模型方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)。因此,應(yīng)用該細(xì)胞進(jìn)行心血管疾病的補(bǔ)償替代性治療或開發(fā)新型藥物具有良好應(yīng)用前景和重要意義。

相關(guān)研究在探索人類多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cells,hPSCs,包括 iPSCs和 ESCs)向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化的分子機(jī)制中發(fā)現(xiàn),Wnt信號(hào)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(bone morphogenetic proteins,BMPs)和Activin/Nodal等在hPSCs誘導(dǎo)中胚層細(xì)胞的產(chǎn)生中具有重要作用,其中,BMP4和Activin A是體外誘導(dǎo)中胚層產(chǎn)生最常用的因子[3];BMP2和成纖維細(xì)胞生長因子8(fibroblast growth factor 8,FGF8)可能會(huì)協(xié)同促進(jìn)中胚層細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[4]。另有研究發(fā)現(xiàn),趨化因子及其受體也可以在多能干細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用,其參與多能干細(xì)胞的增殖、分化以及多能性維持[5～7]。但是,目前尚沒有對(duì)誘導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的重要基因進(jìn)行系統(tǒng)性篩選與分析的報(bào)道。

高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用,產(chǎn)生了大量的iPSCs向心肌細(xì)胞分化的基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)。在本研究中,我們從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中下載了iPSCs向心肌細(xì)胞分化的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集,首先,應(yīng)用R包分析細(xì)胞分化過程中的差異表達(dá)基因,并對(duì)其進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology,GO)與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路分析;其次,構(gòu)建差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò);隨后,利用R包加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)對(duì)共表達(dá)的基因進(jìn)行聚類,并將其劃分為不同的基因模塊;最后,通過Cytoscape對(duì)重要基因模塊進(jìn)行可視化和富集分析,以期預(yù)測(cè)并篩選出iPSCs向心肌細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)備

從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)篩選并下載iPSCs向心肌細(xì)胞分化的基因表達(dá)譜(GSE137920),獲得iPSCs向心肌細(xì)胞分化的4個(gè)階段的數(shù)據(jù)集,分別是未分化的iPSCs(D0)樣品3例、中胚層細(xì)胞(D2)樣品3例、早期心肌細(xì)胞(D7)樣品3例、心肌細(xì)胞(D14)樣品3例[8]。

1.2 基因差異表達(dá)分析

對(duì)基因表達(dá)譜GSE137920進(jìn)行ensembl數(shù)據(jù)整理,把ensembl ID轉(zhuǎn)換為基因的名稱。把Bioconductor 3.12中的 limma 3.46.0、edgeR 3.32.0和pheatmap 1.0.12安裝在R 4.0.3中,以識(shí)別D0和D2或D7或D14樣品之間的差異表達(dá)基因,然后進(jìn)行熱圖的繪制。差異表達(dá)基因獲取的標(biāo)準(zhǔn):錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)＜0.05 和|log2(FC)|≥2(FC:fold change),FDR表示矯正后的P值,log2(FC)表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組樣品表達(dá)量的比值。

1.3 差異表達(dá)基因的功能及信號(hào)通路分析

GO是從分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)和細(xì)胞組分(cellular component,CC)3個(gè)方面注釋基因及其產(chǎn)物的功能。利用GO分析可以找到富集差異基因的GO分類條目,從而找出不同樣品中差異基因的生物學(xué)功能。KEGG是一個(gè)集成了化學(xué)、基因組和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫,能夠把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究,通常被用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分析。本文首先在R中利用org.Hs.eg.db 3.12.0把基因的名稱轉(zhuǎn)換為基因ID,再利用clusterProfiler v3.0.4實(shí)現(xiàn) D0和 D2樣品、D0和D7樣品以及D0和D14樣品差異表達(dá)基因的GO功能和KEGG信號(hào)通路富集分析,最后利用enrichplot 1.10.1和ggplot 2 3.3.2把輸出結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 共同差異表達(dá)基因的獲取

利用在線工具Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制 D2、D7和D14三個(gè)樣品中差異表達(dá)基因的Venn圖,分析得到3個(gè)樣品中共同差異表達(dá)基因。

1.5 共同差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共同差異表達(dá)的基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)[9],獲得其所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系,PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn):相互作用分?jǐn)?shù)(interaction score)≥0.9。利用Cytoscape 3.7.2中的cytoHubba插件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化,篩選關(guān)鍵基因。

1.6 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

WGCNA[10]是根據(jù)基因表達(dá)模式的不同,挖掘出相似表達(dá)模式的基因,通常稱為模塊(module)。把每個(gè)模塊與其他模塊或外部樣本特征進(jìn)行關(guān)聯(lián),可用來篩選模塊中的核心基因,而核心基因基本是位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心的基因,是值得我們優(yōu)先深入研究和挖掘的對(duì)象。本文把iPSCs向心肌細(xì)胞分化的4個(gè)階段(D0、D2、D7和D14)的基因表達(dá)矩陣作為輸入數(shù)據(jù),在R中把基因表達(dá)量均值大于總體均值的基因作為高表達(dá)基因進(jìn)行WGCNA分析,使用動(dòng)態(tài)剪切樹的方法將基因聚類并劃分模塊,設(shè)定最小模塊大小的參數(shù)為30,將距離較近的模塊合并成新的模塊,選取剪切值(height)為0.25,將相似性大于0.75的模塊合并。最后,使用Cytoscape 3.7.2里的cytoHubba插件把重要基因模塊進(jìn)行可視化,篩選出模塊中的核心基因。

1.7 共同差異表達(dá)基因和重要模塊的通路富集分析

在Cytoscape 3.7.2中安裝上Reactome FIPlugIn插件,分析共同差異表達(dá)基因和重要模塊中基因的相關(guān)通路,設(shè)定分析的標(biāo)準(zhǔn)為P≤0.01、FDR≤0.05。

2 結(jié)果

2.1 iPSCs向心肌細(xì)胞分化中差異表達(dá)的基因

使用FDR＜0.05和|log2(FC)|≥2作為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn),獲取D0、D2、D7和D14樣品之間的差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示:與D0樣品相比,D2樣品中鑒定出了2 723個(gè)差異表達(dá)基因(包括959個(gè)表達(dá)上調(diào)和1 764個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因);D7樣品中鑒定出了5 155個(gè)差異表達(dá)基因(包括2 707個(gè)表達(dá)上調(diào)和2 448個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因);D14樣品中鑒定出了6 777個(gè)差異表達(dá)基因(包括3 871個(gè)表達(dá)上調(diào)和2 906個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因)。圖1給出了D2、D7和D14樣品中前20個(gè)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的差異基因的熱圖。

圖1 前20個(gè)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的差異基因的熱圖(A)D2樣品中的差異表達(dá)基因;(B)D7樣品中的差異表達(dá)基因;(C)D14樣品中的差異表達(dá)基因。橫坐標(biāo)為樣品,D0樣品為未分化的iPSCs(綠框),D2、D7和D14樣品分別為中胚層細(xì)胞、早期心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞(紅框)?？v坐標(biāo)表示基因,藍(lán)色表示下調(diào)基因,紅色表示上調(diào)基因。Fig.1 Heatmap of top 20 differential genes with up-or down-regulated expression(A)Differentially expressed genes in D2 samples;(B)Differentially expressed genes in D7 samples;(C)Differentially expressed genes in D14 samples.The sample names are listed on the abscissa.D0 samples are undifferentiated iPSCs(green box),D2,D7 and D14 samples are mesoderm cells,early cardiomyocytes and cardiomyocytes(red box),respectively.The genes are shown on the ordinate.Blue represents down-regulated genes,and red represents up-regulated genes.

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能分析

GO分析結(jié)果顯示,D2樣品中的差異表達(dá)基因有 999個(gè) GO_BP項(xiàng)、58個(gè) GO_CC項(xiàng)、94個(gè)GO_MF項(xiàng)(P＜0.05),其中前10項(xiàng)主要包括胚胎器官發(fā)育(GO_BP)、含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)(GO_CC)和G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合(GO_MF)等(圖2A);D7樣品中的差異表達(dá)基因有1 677個(gè)GO_BP項(xiàng)、106個(gè)GO_CC項(xiàng)、144個(gè)GO_MF項(xiàng)(P＜0.05),其中前10項(xiàng)包括心臟形態(tài)發(fā)生(GO_BP)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(GO_CC)和受體配體活性(GO_MF)等(圖2B);D14樣品中的差異表達(dá)基因有1 886個(gè)GO_BP項(xiàng)、123個(gè)GO_CC項(xiàng)、173個(gè)GO_MF項(xiàng)(P＜0.05),其中前10項(xiàng)包括心肌組織發(fā)育(GO_BP)、離子通道復(fù)合物(GO_CC)和信號(hào)受體激活劑的活性(GO_MF)等(圖 2C)。

圖2 差異表達(dá)基因的前10個(gè)GO功能分析(A)D2樣品中差異表達(dá)基因的GO功能分析;(B)D7樣品中差異表達(dá)基因的GO功能分析;(C)D14樣品中差異表達(dá)基因的GO功能分析。圓的大小表示GO功能富集的基因數(shù)量,與圓的大小正相關(guān)。同樣,GO功能中基因富集的顯著性與圓的顏色深度正相關(guān)。Qvalue表示用FDR方法校正后的P值。Fig.2 Analysis of top 10 GO functions of differentially expressed genes(A)GO function analysis of differentially expressed genes in D2 samples;(B)GO function analysis of differentially expressed genes in D7 samples;(C)GO function analysis of differentially expressed genes in D14 samples.The circle size represents the number of genes enriched in GO function,which is positively related to the circle size.Similarly,the significance of gene enrichment in GO function is positively related to the color depth of the circle.Qvalue represents the P-value corrected by the FDR method.

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路分析

基于KEGG信號(hào)通路的分析,D2樣品中的差異表達(dá)基因在20條信號(hào)通路富集(P＜0.05),包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路和TGF-β信號(hào)通路等。在圖3A顯示的前20條信號(hào)通路中,神經(jīng)活性配體-受體相互作用的信號(hào)通路富集最為顯著,有68個(gè)差異表達(dá)基因富集到此信號(hào)通路。D7樣品中的差異表達(dá)基因在57條信號(hào)通路富集(P＜0.05),包括PI3K-Akt信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、心肌收縮和cAMP信號(hào)通路等。在圖3B顯示的前20條信號(hào)通路中,神經(jīng)活性配體-受體相互作用的信號(hào)通路同樣富集得最為顯著,有113個(gè)差異表達(dá)基因富集到此信號(hào)通路。在D14樣品中,差異表達(dá)基因在77條信號(hào)通路富集(P＜0.05),包括Ras信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、肥厚型心肌病、MAPK信號(hào)通路和擴(kuò)張型心肌病等。圖3C顯示了其中的前20條信號(hào)通路,還是以神經(jīng)活性配體-受體相互作用的信號(hào)通路富集最為顯著,有138個(gè)差異表達(dá)基因富集到此信號(hào)通路。

圖3 差異表達(dá)基因的前20條KEGG信號(hào)通路分析(A)D2樣品中差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路分析;(B)D7樣品中差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路分析;(C)D14樣品中差異表達(dá)基因的KEGG信號(hào)通路分析。縱軸表示信號(hào)通路,橫軸表示信號(hào)通路中富集的基因數(shù)量,顏色表示富集的顯著性,Qvalue表示用FDR方法校正后的P值。Fig.3 Analysis of top 20 KEGG signaling pathways of differentially expressed genes(A)KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes in D2 samples;(B)KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes in D7 samples;(C)KEGG signaling pathway analysis of differentially expressed genes in D14 samples.The signaling pathways are listed on the vertical axis,and the numbers of genes enriched in the signaling pathway are on the horizontal axis.The color represents the significance of enrichment.Qvalue represents the P-value corrected by the FDR method.

2.4 共同差異表達(dá)基因的分析

通過Venn圖分析,從3個(gè)樣品中總共得到917個(gè)共同的差異表達(dá)基因,包括331個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因(圖4A)和586個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因(圖4B)。3個(gè)樣品中的差異表達(dá)基因都是與D0樣品比較得到的。

圖4 Venn圖分析得到共同差異表達(dá)的基因(A)3個(gè)樣品中上調(diào)差異表達(dá)基因的Venn圖分析;(B)3個(gè)樣品中下調(diào)差異表達(dá)基因的Venn圖分析。Fig.4 Common differentially expressed genes obtained by Venn diagram analysis(A)Venn diagram analysis of up-regulated differentially expressed genes in three samples;(B)Venn diagram analysis of downregulated differentially expressed genes in three samples.

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)3個(gè)樣品中共同差異表達(dá)的基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖5A),然后通過Cytoscape 3.7.2中的cytoHubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的前10個(gè)基因(圖5B),分別為FPR2、ADCY2、CXCR2、CXCR4、PF4、GALR1、GAL、CXCL5、CXCL6和HCAR3。

圖5 共同差異表達(dá)基因的PPI分析(A)共同差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò),紅色代表上調(diào),綠色代表下調(diào);(B)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的前10個(gè)基因,其中圓形代表下調(diào)基因,菱形代表上調(diào)基因,紅色、橙色、橘黃色和黃色代表基因連接程度依次遞減。Fig.5 PPI analysis of common differentially expressed genes(A)PPI network of common differentially expressed genes.Red represents up-regulation and green represents down-regulation;(B)The top 10 genes screened out in the PPI network.Circles represent down-regulated genes,and diamonds represent up-regulated genes.The colors red,orange,jacinth and yellow represent the decreasing connectivity of genes.

2.6 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

把所有樣品中表達(dá)量較低的基因過濾后,選取9 006個(gè)基因進(jìn)行WGCNA分析,將相似性大于0.75的模塊合并后最終得到了9個(gè)基因模塊(圖6)。不同的顏色代表不同的模塊,樹圖中每個(gè)葉節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)基因,其中密集連接的分支代表接近的基因。表1列出了不同顏色模塊所包含的基因數(shù)量。其中,綠色基因模塊(Green)聚類最顯著,包含的基因數(shù)目為2 175個(gè);暗綠色基因模塊(Darkturquoise)包含的基因數(shù)目最少,為133個(gè)。

圖6 高表達(dá)基因的聚類樹和模塊劃分Height為剪切值;Cluster dendrogram為聚類樹;Dynamic tree cut為最初得到的模塊;Merged dynamic為合并后最終得到的模塊。Fig.6 Cluster dendrogram and module division of high expression genesHeight is the cut value;Cluster dendrogram is the cluster tree;Dynamic tree cut is the initial module;Merged dynamic is the final module after the merger.

表1 不同模塊中包含的基因數(shù)量Table 1 The number of genes contained in different modules

通過WGCNA分析,我們可得到每個(gè)模塊中直接相互作用的基因。文中選取聚類最顯著的綠色基因模塊(Green)進(jìn)行Cytoscape的可視化分析,篩選模塊中相互作用的基因(weight＞0.695),結(jié)果顯示:綠色基因模塊(Green)中篩選到399組相互作用的基因。進(jìn)一步利用Cytoscape軟件中的cytoHubba插件對(duì)模塊中相互作用最多的前50個(gè)基因進(jìn)行可視化,結(jié)果顯示:在綠色基因模塊(Green)中,與其他基因相互作用最多的基因是BMP5(圖7)。與其他基因相互作用越多,表明該基因在模塊中越接近核心地位。

圖7 綠色基因模塊中基因的相互作用關(guān)系紅色表示與其他基因相互作用最多的基因。Fig.7 Interaction between genes in green gene moduleRed indicates the gene that interacts most with other genes.

2.7 共同差異表達(dá)基因和重要模塊的通路富集

應(yīng)用Cytoscape軟件中的Reactome FIPlugIn插件對(duì)共同差異表達(dá)基因和綠色模塊(Green)基因進(jìn)行通路分析,結(jié)果顯示:綠色模塊(Green)的基因富集的通路總共有48條,其中5條為翻譯后蛋白質(zhì)修飾、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、脂質(zhì)代謝、天冬酰胺N-連接糖基化和細(xì)胞對(duì)壓力的反應(yīng)(表2);共同差異表達(dá)基因的富集通路總共有10條,其中5條為GPCR配體結(jié)合、肽配體結(jié)合受體、RUNX2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及趨化因子受體結(jié)合趨化因子(表 2)。

表2 綠色基因模塊和共同差異表達(dá)基因的通路富集Table 2 Pathway enrichment of green gene module and common differentially expressed genes

3 討論

目前,為探索心血管疾病的細(xì)胞治療途徑,獲得一種與人體生理狀態(tài)相接近的心肌細(xì)胞模型極其重要。與已建立的人源心肌細(xì)胞模型相比,從iPSCs中誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞具有很大優(yōu)勢(shì)和前景[11～12]。因此,探究人iPSCs向心肌細(xì)胞分化的作用機(jī)制以及篩選關(guān)鍵調(diào)控基因非常有必要。

本研究在D2、D7和D14三個(gè)樣品中篩選出的共同差異表達(dá)基因有917個(gè),其中包括331個(gè)上調(diào)基因和586個(gè)下調(diào)基因(圖4)。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)中共同差異表達(dá)基因的連接程度,我們篩選得到10個(gè)關(guān)鍵基因:FPR2、ADCY2、CXCR2、CXCR4、PF4、GALR1、GAL、CXCL5、CXCL6 和 HCAR3(圖 5)。其中,FPR2、CXCR2、CXCR4 和 PF4 可能在 iPSCs向心肌細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮重要作用[13～20]。

甲酰基肽受體(formyl peptide receptor,FPR)在人體中包括3個(gè)成員,分別為FPR1、FPR2和FPR3,它們是G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體家族的成員[13]。研究證實(shí),FPR2和FPR1通過F-肌動(dòng)蛋白聚合促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞遷移并且向神經(jīng)元分化[13]。另有研究發(fā)現(xiàn),FPR2和FPR1在活性氧和PI3K-AKT信號(hào)通路的介導(dǎo)下,誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化[14]。FPR在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá),而FPR1與N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine,fMLP)相互作用,會(huì)誘導(dǎo)人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[15]。在本研究中,GO和KEGG富集分析顯示,FPR2主要富集在第二信使介導(dǎo)的信號(hào)、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子對(duì)生長因子刺激的反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞趨化作用以及調(diào)控ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)反應(yīng)等,體現(xiàn)了FPR2可能在iPSCs向心肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用。CXC趨化因子受體2(CXC chemokine receptor 2,CXCR2)是一種G蛋白偶聯(lián)受體。研究發(fā)現(xiàn),在hPSCs中抑制CXCR2表達(dá),會(huì)抑制細(xì)胞向外胚層分化,導(dǎo)致細(xì)胞向中胚層和內(nèi)胚層分化,隨后hPSCs的特性逐漸消失,這表明CXCR2在維持hPSCs的多能性和增殖分化中扮演重要的角色[7,16]。此外,CXCR2及其下游信號(hào)在間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移、血管形成等運(yùn)動(dòng)中也發(fā)揮了關(guān)鍵作用[17]。本研究的GO和KEGG富集分析顯示,CXCR2主要富集在心肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、血管生成調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路等,表明CXCR2可能在iPSCs向心肌細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。CXCR4也是一種G蛋白偶聯(lián)受體。研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞利用SDF-1/CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以誘導(dǎo)c-kit+心臟干細(xì)胞的分化以及增殖,該信號(hào)通路也可以控制神經(jīng)干細(xì)胞以維持它的干細(xì)胞特性,而且被激活的CXCR4能促進(jìn)人ESCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化[18]。在小鼠的iPSCs中增強(qiáng)CXCR4的表達(dá)可以提高細(xì)胞遷移,并且不改變細(xì)胞的干細(xì)胞特性[19]。本研究的GO和KEGG富集分析顯示,CXCR4主要富集在心臟過程、心臟收縮和調(diào)節(jié)生長發(fā)育等,說明CXCR4可能促進(jìn)iPSCs向心肌細(xì)胞分化。血小板第4因子(platelet factor 4,PF4)是CXC趨化因子家族的成員,是iPSCs分化為心肌細(xì)胞的一種生物標(biāo)志物。研究報(bào)道,PF4可以促進(jìn)iPSCs向心臟分化,這可能與其調(diào)節(jié)FGF信號(hào)有關(guān)[20]。在本研究中,GO和KEGG富集分析顯示,PF4主要在血管發(fā)育調(diào)節(jié)、cAMP介導(dǎo)信號(hào)、造血正向調(diào)節(jié)和趨化因子的信號(hào)通路等富集,提示PF4可能參與iPSCs心肌細(xì)胞分化過程。綜合以上分析可知,FPR2、CXCR2和CXCR4都是趨化因子的受體,PF4是趨化因子的成員,它們都與細(xì)胞的趨化作用有著密切的關(guān)系,而且趨化因子的受體幾乎都是G蛋白偶聯(lián)受體,它們都在G蛋白偶聯(lián)受體配體結(jié)合的通路中富集。已有研究證明,趨化因子及其受體可以在多能干細(xì)胞的增殖、分化以及多能性維持中發(fā)揮重要作用[5～7]。例如:CXCL8(趨化因子)-CXCR2信號(hào)通路可以使hPSCs的分化能力提高;CXCL12(趨化因子)-CXCR4信號(hào)通路不僅參與hPSCs的遷移活動(dòng),還能夠增強(qiáng)細(xì)胞多能性[21]。因此,我們推測(cè)趨化因子及其受體在iPSCs向心肌細(xì)胞分化的過程中具有重要作用。

通過對(duì)WGCNA的結(jié)果進(jìn)行分析我們發(fā)現(xiàn),最顯著的基因模塊為綠色基因模塊(Green)(圖6),在該基因模塊中,BMP5與其他基因相互作用的程度最高(圖7)。BMP5是BMPs家族的成員,而BMPs是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族中的成員,它可以從細(xì)胞內(nèi)分泌到細(xì)胞間隙或者血漿中,從而和靶細(xì)胞相應(yīng)的抗體結(jié)合,發(fā)揮生物學(xué)作用[22]。BMPs及其受體被認(rèn)為是胚胎發(fā)育和器官形成中的重要調(diào)節(jié)因子,對(duì)心血管結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)也具有重要作用[23]。其中,BMP4與FGF2協(xié)同作用誘導(dǎo)人ESCs向中胚層細(xì)胞分化[24],BMP2與FGF8相互作用可能會(huì)誘導(dǎo)中胚層向心肌細(xì)胞分化[4]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),BMP5參與許多生命活動(dòng),如細(xì)胞的增殖和凋亡、軟骨發(fā)育、人類干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)、人體胚胎發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生和預(yù)后[25]。BMP5/7不但可以在體外明顯地促進(jìn)人iPSCs的分化能力,而且可以使神經(jīng)干細(xì)胞分化為中腦多巴胺神經(jīng)元的能力提高3倍[26]。另外,BMP5還可以調(diào)控心肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)[27]。本研究發(fā)現(xiàn),BMP5在iPSCs分化為中胚層細(xì)胞、早期心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞的3個(gè)階段都差異表達(dá),而且BMP5主要富集于心肌組織發(fā)育、胚胎器官發(fā)育、上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過程以及TGF-β信號(hào)通路。因此,我們推測(cè)BMP5具有促進(jìn)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的功能。

文獻(xiàn)研究顯示,在本文預(yù)測(cè)的關(guān)鍵基因中,BMP5和CXCR4已經(jīng)被證明在干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中起重要作用。譚金童[28]成功地利用BMP5重組腺病毒誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),SDF-1(又稱CXCL12)/CXCR4信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[29]。VEGF可以促進(jìn)iPSCs向心肌細(xì)胞分化[30],bFGF能促進(jìn)ESCs來源心肌細(xì)胞的早期成熟[31]。另有研究證實(shí),CXCL12-CXCR4信號(hào)通路還參與多種心血管的發(fā)育過程[32]。此外,有研究報(bào)道,SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在BMP(BMP2或BMP9)介導(dǎo)的成骨分化中發(fā)揮重要的作用[33～35],說明趨化因子及其受體介導(dǎo)的信號(hào)通路與BMP可以相互作用,但它們是否在心肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮作用目前尚不清楚。

本文通過生物信息學(xué)分析,雖然篩選得到了參與人iPSCs向心肌細(xì)胞分化的幾個(gè)關(guān)鍵基因,但在該過程中起作用的基因不止于此。在被篩選出來的基因中,FPR2、CXCR2和PF4在iPSCs向心肌細(xì)胞分化的過程中可能會(huì)發(fā)揮重要作用,其中BMP5和CXCR4介導(dǎo)iPSCs向心肌細(xì)胞分化的可能性最大,雖然它們已經(jīng)被證明參與干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化,但仍需要用實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證明它們是否參與iPSCs向心肌細(xì)胞分化的過程。